Nell’intervallo tra BP3 e BP4, che corrisponde alla regione minima comune di 1,22 Mb, sono presenti 11 geni (Figura 4.4): GJA5, GJA8, FMO5, BCL9, PRKAB2, CHD1L, ACP6, NBPF11, NBPF24, GPR89B e GPR89C. Questi geni sono descritti nel database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) e, in particolare, GJA5 e GJA8 sono associati a specifiche patologie.
• GJA5
Il gene GJA5 (Gap Junction Protein, Alpha-5) codifica per la proteina “connessina 40” (Cx40), che ha un peso molecolare di 40 KDa. Le “connessine” sono proteine che oligomerizzano per formare dei canali intercellulari, chiamati “gap junction”, che facilitano la connessione cellula-cellula e consentono la diretta comunicazione intercellulare attraverso il passaggio di ioni e piccole molecole.
Gu et al. (2003) hanno condotto studi su animali modello per studiare il ruolo di Cx40 nella morfogenesi cardiaca. Hanno generato topi eterozigoti (+/-) e topi knock out (-/-) per GJA5 e l’incidenza di malformazioni cardiache era del 18% nei topi +/- e del 33% nei topi -/-, in cui le malformazioni erano più gravi. Quindi l’assenza o la limitata espressione di Cx40 aumentano la probabilità che si verifichino delle anomalie cardiache strutturali.
È stato dimostrato che il gene GJA5 è espresso selettivamente nei miociti atriali e che il suo prodotto media l’attivazione elettrica coordinata degli atri (Gollob et al. 2006). Dallo studio di pazienti affetti da fibrillazione atriale idiopatica e familiare sono state individuate differenti mutazioni missenso in eterozigosi in GJA5, con penetranza incompleta, portando ad ipotizzare una base genetica per questa patologia (Gollob et al. 2006; Yang et al. 2010).
• GJA8
Il gene GJA8 (Gap Junction Protein, Alpha-8)codifica per una proteina di membrana intrinseca del cristallino (MP70), nota anche come “connessina 50” (Cx50). Questa proteina ha un peso molecolare di 50 KDa e contiene quattro domini transmembrana. Il corretto sviluppo e funzionamento del cristallino nei mammiferi dipende dalla presenza di gap junctions, costituiti dalle connessine Cx43, Cx46 e Cx50, localizzate principalmente nella membrana plasmatica delle fibre del cristallino. In particolare, è stato mostrato che i topi knock-out per il gene GJA8 sviluppano microftalmia con
55 cristallini piccoli e cataratta nucleare, mentre i topi eterozigoti per il gene GJA8 hanno occhi e cristallini con dimensioni normali (Gong et al. 1998).
Studi condotti su individui affetti da cataratta congenita hanno rivelato la presenza di differenti mutazioni missenso in eterozigosi sul gene GJA8 (Berry et al. 1999; Willoughby et al. 2003; Devi and Vijayalakshmi 2006; Arora et al. 2008).
• FMO5
Il gene FMO5 codifica per la “monoossigenasi contenente flavina 5”, un enzima appartenente alla classe delle ossido - reduttasi, che catalizza l’ossidazione di atomi di azoto, zolfo e fosfato in una grande varietà di composti, inclusi molti pesticidi e farmaci (Phillips et al. 1995).
• BCL9
Il gene BCL9 codifica per la proteina “B-cell CLL/lymphoma 9” (Willis et al. 1998). BCL9 è un gene candidato per la polidattilia, in quanto è omologo del gene “Legless” (Lgs) di Drosophila, uno dei geni della polarità segmentale, essenziale per la determinazione dell’asse del corpo nei vertebrati (Rosenfeld et al. 2012). Da studi fatti su Lgs, è stato mostrato che in Drosophila il suo prodotto è necessario per la trasduzione del segnale di Wnt a livello della beta-catenina nucleare, quindi è stato ipotizzato un ruolo analogo anche per BCL9 nell’uomo (Kramps et al. 2002).
Il pathway di Wnt controlla molti processi fondamentali durante lo sviluppo degli animali e la trasduzione del segnale di Wnt è mediato dall’associazione della beta- catenina con i fattori nucleari TCF che legano il DNA, espressi nelle cellule T e nei precursori delle cellule B.
• PRKAB2
Il gene PRKAB2 codifica per l’isoforma β2 (AMPKβ2) della subunità regolatoria β della “proteina chinasi AMP dipendente”, AMPK (Harvard et al. 2011). AMPK è un complesso eterotrimerico costituito da una subunità catalitica α, da una subunità regolatoria β e da una subunità γ che lega ADP/ATP ed esistono molte isoforme per ciascuna subunità. La proteina AMPK percepisce e controlla il bilancio energetico cellulare e sistemico regolando la quantità di cibo assunta, il peso corporeo e
56 l’omeostasi del glucosio e dei lipidi. Inoltre AMPK regola negativamente il pathway di mTOR, il quale controlla la biosintesi di ribosomi e proteine.
Harvard et al. (2011) affermano che l’espressione della proteina AMPKβ2 diminuisce nelle linee cellulari linfoblastoidi (LBCs) di pazienti portatori di una delezione 1q21.1-q21.2, mentre la sua espressione aumenta nelle LBCs con una duplicazione 1q21.1-q21.2 rispetto ai controlli wild-type. Gli autori mostrano che un’aploinsufficienza di PRKAB2 è associata ad una non corretta attivazione del complesso AMPK e quindi ad una fosforilazione sub-ottimale dei suoi substrati; la duplicazione di PRKAB2 non sembra invece avere un impatto negativo sull’attività di AMPK.
• CHD1L
Il gene CHD1L codifica per la proteina “Chromodomain Helicase DNA-binding protein 1-Like”, implicata nel rimodellamento e rilassamento della cromatina e nella risposta ad un danno nel DNA: infatti, in seguito ad un danno, la proteina interagisce con le molecole di poli-ADP ribosio legate alle proteine della cromatina per favorirne una forma rilassata e facilitare la riparazione del DNA (Ahel et al. 2009). Da studi su linee cellulari linfoblastoidi di pazienti portatori di una microdelezione o microduplicazione 1q21.1-q21.2, è stato scoperto che il prodotto di questo gene è inoltre coinvolto nella corretta attivazione del “Decatenation Checkpoint” (DCC), un checkpoint funzionale del ciclo cellulare, che coinvolge proteine come ATR, ATM, BRCA1 e RAD9. Il DCC mantiene le cellule nella fase G2 fino a quando il DNA non è completamente “decatenato” (ovvero non più sottoposto a tensione torsionale) dalla “Topoisomerasi II alpha” e i cromatidi fratelli non sono del tutto separati (Harvard et al. 2011).
Nelle linee cellulari linfoblastoidi di pazienti portatori di una microdelezione o microduplicazione 1q21.1-q21.2, dove il dosaggio della proteina CHD1L è alterato, non si ha la corretta attivazione del DCC e l’arresto del ciclo cellulare in fase G2, quindi le cellule entrano in mitosi pur avendo ancora i cromatidi non perfettamente separati (Harvard et al. 2011).
57
• ACP6
Questo gene codifica per la “fosfatasi acida 6”, che fa parte di una classe di enzimi idrolasi che catalizzano la rimozione di gruppi fosfato.
Hiroyama and Takenawa (1999) hanno mostrato che ACP6 viene localizzata nei mitocondri grazie a peptidi segnale e regola la biosintesi di lipidi mitocondriali idrolizzando l’acido lisofosfatidico in monoacilglicerolo.
• NBPF11 e NBPF24
I geni NBPF11 e NBPF24 fanno parte di una famiglia di geni individuata da Vandepoele et al. (2005), localizzati principalmente nelle regioni ricche di duplicazioni segmentali del cromosoma 1. Questa famiglia è stata definita “Neuroblastoma Breakpoint Family”, poiché è stata riscontrata l’interruzione di uno di questi geni, a causa di una traslocazione, in un paziente affetto da neuroblastoma. I geni NBPF contengono numerosi elementi ripetuti e mostrano un’elevata identità di sequenza intergenica e intragenica sia nelle regioni codificanti che non, che possono predisporre queste regioni ad eventi di ricombinazione, generando variazione strutturale in questi geni.
• GPR89B e GPR89C
Questi geni codificano per le proteine “G protein-coupled receptor 89B e C”.
È stato dimostrato che queste proteine si trovano soprattutto nel Golgi e, in forma trimerica, costituiscono un canale coinvolto nella corretta acidificazione del Golgi, nel rapido trasporto e nella glicosilazione delle proteine (Maeda et al. 2008).
58
4.5.1 I geni coinvolti nello sbilanciamento fra BP1 e BP4
La microdelezione che si verifica fra i breakpoint BP1 e BP4 coinvolge altri geni oltre a quelli presenti nella regione minima comune sbilanciata. Nella regione che si estende verso il centromero, infatti, sono presenti 3 geni, PEX11B, HFE2A e RBM8A, che sono associati ad una specifica patologia nel database OMIM.
• PEX11B
Questo gene codifica per la proteina “Peroxisome Biogenesis Factor 11β” ed è stato dimostrato che la sovraespressione di PEX11β nelle cellule umane è sufficiente a indurre la proliferazione dei perossisomi (Schrader et al. 1998). L’assenza di PEX11β causa una patologia associata ad un difetto nella biogenesi dei perossisomi e, per i disturbi neurologici e di sviluppo che comporta, è molto simile alla Sindrome di Zellweger, da cui si distingue per alcune caratteristiche biochimiche (Ebberink et al. 2012).
• HFE2A
Il gene HFE2A o HJV, codifica per la proteina “emojuvelina” e mutazioni in omozigosi causano una forma di Emocromatosi giovanile di tipo 2A. L'emojuvelina svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo del ferro ed è direttamente coinvolta nella regolazione trascrizionale dell’ormone epcidina a livello epatico (Brakensiek et al. 2009; Gehrke S. et al. 2005; Murugan et al. 2008; Papanikolaou et al. 2004).
• RBM8A
Il gene RBM8A (RNA-Binding Motif protein 8) codifica per Y14, uno dei quattro componenti del “complesso di giunzione esonica” (EJC), che è coinvolto in funzioni cellulari come l’esportazione nucleare e la localizzazione subcellulare di specifici mRNA (Albers et al. 2012).
È stato dimostrato che l’assenza del prodotto di questo gene causa la sindrome Trombocitopenia e Assenza del Radio (TAR) (Albers et al. 2012).
59
4.5.2 I geni coinvolti nello sbilanciamento del paziente 8
Lo sbilanciamento rilevato nel paziente 8 si estende per circa 8 Mb, a partire da BP1 verso la parte terminale del cromosoma 1. Quindi sono coinvolti molti altri geni, oltre a quelli finora descritti e, in particolare, i geni CTSK, ECM1 e SF3B4 sono riportati nel database OMIM associati a specifici fenotipi.
• CTSK
Il gene CTSK codifica per la Catepsina K, una cisteina proteasi presente negli osteoclasti, essenziale per il processo di riassorbimento osseo operato da queste cellule. La mutazione di questo gene causa la Picnodisostosi o sindrome di Toulouse-Lautrec, una malattia genetica autosomica recessiva caratterizzata da osteosclerosi dello scheletro, bassa statura e fragilità ossea (Johnson M.R. et al. 1996).
• ECM1
Questo gene codifica per la “proteina della matrice extracellulare 1” (ECM1) e mutazioni con perdita di funzione di questo gene causano la sindrome di Urbach-Wiethe (anche nota come lipoproteinosi e ialinosi cutanea e mucosa) (Hamada et al. 2002). I sintomi di questa malattia includono lesioni e cicatrici cutanee, pelle molto suscettibile a danni, con insufficienza dei meccanismi di riparazione e, in alcuni casi, si verifica un indurimento del tessuto cerebrale a livello dei lobi temporali mediali che può condurre ad epilessia e problematiche neuropsichiatriche.
• SF3B4
SF3B4 codifica per un fattore coinvolto nel processo di splicing e l’aploinsufficienza di questo gene causa la Sindrome di Nager, che fa parte di un gruppo di patologie definite “Disostosi acrofacciali” e che è caratterizzata da malformazioni cranio-facciali e degli arti superiori (Bernier et al. 2012).
60