Ad oggi non sono noti i meccanismi molecolari alla base di questa variabilità fenotipica, tuttavia è possibile avanzare delle ipotesi tra cui:
- il modello “two-hit” descritto da Girirajan et al. (2010); - l’imprinting;
- lo smascheramento di varianti recessive sull’unico allele rimasto, nel caso di delezioni; - la diversa localizzazione dei punti di rottura degli sbilanciamenti all’interno dei BP e,
quindi un alterato dosaggio dei geni in essi contenuti.
- In uno studio recente è stato ipotizzato il modello “two-hit” come una possibile spiegazione alla variabilità fenotipica descritta in molti casi di portatori di microduplicazioni e microdelezioni (16q12.1, 1q21.1, 15q13.3) (Girirajan et al. 2010). Lo studio è stato condotto su portatori di una microdelezione 16p12.1, in cui lo sbilanciamento rappresenta un fattore di rischio significativo per la disabilità intellettiva e il ritardo dello sviluppo e può agire in concerto con altri fattori per modificare un fenotipo neurologico.
65 Secondo questo modello, infatti, oltre ad uno sbilanciamento, è necessaria la presenza di una seconda alterazione (“hit”) durante lo sviluppo, che causa manifestazioni cliniche più severe. Il secondo hit può essere una CNV di grandi dimensioni (>500 Kbp), un errore nella riparazione di un singolo nucleotide, che introduce una mutazione in un gene correlato al fenotipo, oppure un evento ambientale che influenza il fenotipo.
Quindi la variabilità fenotipica associata ad una specifica microdelezione/microduplicazione può dipendere anche dal diverso background genetico di ciascun portatore e dall’azione dell’ambiente.
I fattori ambientali, come ad esempio gli xenobiotici e lo stile di vita, possono alterare la programmazione epigenetica, introducendo cambiamenti nell’espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica del genoma. Questi fattori possono agire a diversi livelli nell’attivare o bloccare i diversi pathways di signaling, che possono provocare alterazioni nella struttura della cromatina o agire su numerose attività enzimatiche. Questo determina differenze fenotipiche interindividuali e modifica la suscettibilità individuale a specifiche patologie (Ficociello et al. 2010).
- L’imprinting è un fenomeno epigenetico che consiste nell’espressione differenziata di un gene in base all’origine parentale. Tuttavia, dai dati descritti in letteratura e da quelli prodotti in questo lavoro di tesi, quello dell’imprinting non sembra essere un fattore alla base della variabilità fenotipica dei soggetti 1q21.1-q21.2. Infatti l’alterazione può essere sia di origine materna che paterna e il quadro fenotipico non sembra correlato all’origine parentale.
- Nel caso di individui portatori di una stessa microdelezione, la variabilità fenotipica potrebbe essere attribuita allo smascheramento di varianti recessive presenti sull’unico allele rimasto. Nei portatori di una delezione della regione 1q21.1, Mefford et al. (2008) hanno sequenziato i geni GJA5 e GJA8, associati rispettivamente ad anomalie cardiache e oculari, ma non hanno rilevato la presenza di varianti alleliche recessive che potessero spiegare la variabilità fenotipica osservata.
- Ciascun punto di rottura degli sbilanciamenti è localizzato in un intervallo compreso tra l’oligonucleotide alterato (deleto o duplicato) e l’oligonucleotide adiacente, che risulta invece essere normale. A causa dell’impossibilità di individuare sequenze uniche all’interno dei BP e, quindi, di disegnare degli oligonucleotidi in queste regioni, la distanza fra gli
66 oligonucleotidi che definiscono questi intervalli può essere molto variabile, da 17 Kb a 23 Mb. Quindi, anche se l’array-CGH individua in pazienti diversi uno sbilanciamento delle stesse dimensioni, in realtà, i punti di rottura si possono verificare in posizioni diverse all’interno dell’intervallo e questo potrebbe determinare un diverso dosaggio genico.
Un esempio è dato dal gene HYDIN2 che è espresso nel cervello e sembra essere associato ad un’anomala dimensione della circonferenza cranica negli individui portatori di uno sbilanciamento della regione 1q21.1-q21.2: in particolare, i portatori di una microdelezione o di una microduplicazione presentano, rispettivamente, micro- o macrocefalia (Brunetti-Pierri et al. 2008). Questo gene è localizzato all’interno del BP3, dalla posizione 146˙310˙552 bp a 146˙334˙210 bp (GRCh37/Hg19), quindi se il punto di rottura, che si verifica in questo BP, non include HYDIN2 nello sbilanciamento, probabilmente non ci sarà alcuna alterazione della circonferenza cranica.
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5. CONCLUSIONI
La regione 1q21.1-q21.2 ha una struttura estremamente complessa e al suo interno sono presenti numerose duplicazioni segmentali. Queste possono dare origine ad eventi di ricombinazione omologa non allelica (NAHR) che genera duplicazioni e delezioni e che, quindi, sono la causa più probabile della formazione di tali sbilanciamenti.
Le microdelezioni e le microduplicazioni sul cromosoma 1q21.1-q21.2, rilevate sia in letteratura che in questo lavoro, sono associate ad una grande variabilità fenotipica con assenza di caratteristiche peculiari che rendono difficile una diagnosi clinica.
Quindi le alterazioni individuate in questa regione evidenziano come un’analisi tramite array-CGH possa essere fondamentale nella diagnosi di pazienti con un fenotipo non sindromico e sono un chiaro esempio di come si possa giungere alla diagnosi con un percorso a ritroso, dal genotipo al fenotipo.
Alcune prospettive future di lavoro possono essere:
• il monitoraggio a lungo termine dei familiari dei pazienti per quanto riguarda disturbi neuropsichiatrici ad insorgenza tardiva. Infatti l’analisi del DNA condotta per i familiari spesso rivela la presenza di portatori dello stesso sbilanciamento sani o lievemente affetti, ma, dato l’ampio spettro fenotipico associato ai riarrangiamenti 1q21.1-q21.2, questi disturbi potrebbero manifestarsi in futuro. Inoltre è necessaria, soprattutto nei genitori, anche un’attenta valutazione di quei segni clinici che, pur presenti, possono essere passati inosservati.
• il sequenziamento dei geni presenti sull’unico allele rimasto, nel caso di portatori di una microdelezione, per verificare la presenza di eventuali mutazioni. Infatti in questi soggetti, la variabilità fenotipica potrebbe essere attribuita proprio allo smascheramento di mutazioni recessive.
• eseguire un primo screening e verificare la presenza di uno sbilanciamento 1q21.1- q21.2 in pazienti affetti da disabilità intellettive, ritardi psicomotori e di sviluppo mediante Real time PCR, che, in questo lavoro, è stata utilizzata per la validazione dei dati ottenuti con array-CGH. La Real time PCR si è dimostrata una metodica valida, attendibile e relativamente poco costosa.
Una volta individuati casi con uno sbilanciamento della regione di interesse si potrebbe procedere con l’analisi mediante array-CGH dei campioni selezionati per
68 avere maggiori informazioni sull’effettiva estensione dell’alterazione, riducendo così i tempi e i costi necessari per l’analisi.
Inoltre utilizzando questo approccio è possibile giungere all’identificazione di un gruppo molto ampio di portatori di uno sbilanciamento della regione 1q21.1-q21.2, e questo potrebbe essere utile per un’ulteriore caratterizzazione del quadro fenotipico ad esso associato.
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