La glutatione perossidasi nel seme

La glutatione perossidasi (GSH-Px) catalizza la riduzione del perossido di idrogeno e perossidi organici compresi quelli dei fosfolipidi, quindi gioca un ruolo importante nella protezione delle membrane lipidiche dalla perossidazione e mantiene l'integrita delle cellule. Per queste sue caratteristiche è considerato il principale enzima antiossidante 3 2,2'-Azino-[-3-ethylbenzthiazoline suphonate]+

presente nel liquido spermatico (Walczak-Jedrzejowska, 2013). É stato dimostrato che rimuove i perossidi e protegge le cellule contro i danni causati dai radicali liberi e dai prodotti della perossidazione lipidica in vivo (Surai e Fisinin, 2015). Nei mammiferi sono stati caratterizzate otto forme di GSH-Px, cinque di queste contengono nel loro sito attivo selenio, ma tutte provvedono alla funzione antiossidante nei vari tipi di tessuti; negli spermatozoi si ritrova soprattuto nella matrice mitocondriale, ma è stata trovata anche una forma nucleare che protegge il DNA dal danno ossidativo e partecipa al processo di condensazione della cromatina. La presenza di GSH-PX è stata dimostrata anche nel plasma seminale, suggerendo la sua origine dalla prostata (Walczak-Jedrzejowska, 2013). Una forma specifica di GSH-Px, utilizza come substrato la fosfatidilcolina PH-GSH-Px, è selenio dipendente ed è espressa in elevate quantità nei testicoli, anche se si ritrova in tutti i tessuti, è importante per la spermatogenesi e la funzionalità dei gameti, viene regolata dall'azione delle gonadotropine. Nei testicoli l'attività di questo enzima è collegato ai mitocondri di cellule in fase di differenziazione in spematozoi (Guerriero et al., 2014). La PH-GSH-Px può essere convertita a opera di una polimerasi in una proteina strutturale, che è stata identificata come una dei maggiori costituenti del materiale, simile alla cheratina, dove è incorporata la spirale mitocondriale degli spermatozoi, infatti la non espressione della proteina è considerata causa di infertilità e oligospermia (Surai e Fisinin, 2015).

4 Integrazione alimentare

4.1 I Minerali

Il 3,5-4,5% dell'organismo di un essere vivente è composto da sostanza inorganica: le ceneri costituite dai sali degli elementi minerali. I minerali si possono classificare in base alla loro presenza all'interno dell'organismo in macroelementi o macrominerali quelli presenti in quantità maggiori (grammi) e sono calcio, fosforo, potassio, sodio, cloro, zolfo, magnesio; hanno funzioni strutturali, tessuto osseo e altri tessuti e fluidi, svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio acido-base, della pressione osmotica, potenziale elettrico di membrana e trasmissione nervosa. I

microelementi o oligoelementi presenti in piccolissime quantità (milligrammi o

microgrammi) sono ferro, rame, manganese, zinco, cobalto, iodio, selenio e molibdeno; anche se presenti in concentrazioni bassissime questi elementi vanno a costituire spesso metallo-enzimi, cofattori e componenti di ormoni (NRC, 2001). Gli elementi inorganici sono sempre legati a molecole organiche complesse, quali gli enzimi, gli ormoni e i pigmenti respiratori. L'insufficiente presenza di questi elementi può provocare patologie o riduzione delle produzioni; anche il mancato rispetto dei rapporti tra le parti può essere causa di disequilibri alimentari. In letteratura vengono citati fenomeni di antagonismo (calcio/magnesio) di sinergia (ferro/rame) oppure di interazione tra oligoelementi e vitamine come nel caso del selenio e della vitamina E; tali rapporti sono molto complessi e perciò dobbiamo attribuire fondamentale importanza ai minerali nella formulazione della razione (Cevolani, 2005). I quantitativi presenti in foraggi, cereali e concentrati non sempre sono noti e anche quando lo sono, non corrispondono mai al quantitativo che arriverà all'animale, ricorreremo perciò a coefficienti di assorbimento. Gli stati carenziali nei nostri animali, si hanno per un numero limitato di minerali, più frequentemente di calcio, fosforo, sodio, cloro, magnesio, più raramente ferro, rame, cobalto, zinco, manganese, iodio, selenio; mentre non si è mai osservata per potassio e lo zolfo. Sebbene tutti i minerali concorrono a mantenere in salute l'animale, è quindi essenziale fornire razioni bilanciate che apportino le giuste dosi. Noi analizzeremo solo

quelli che concorrono direttamente a migliorare o mantenere livelli adeguati di fertilità.

4.1.1 Fosforo

Il fosforo oltre ad essere il costituente degli acidi nucleici, quindi di DNA e RNA, dei fosfolipidi e delle fosfoproteine, nelle ossa se ne ritrova l' 80% del totale e interviene nel metabolismo di tutte le sostanze formando legami ad alta energia: ATP, il coenzima A, i coenzimi piridinici. Il contenuto di P dei foraggi è influenzato dal suo contenuto nel terreno, ne sono più ricche le graminacee in particolar modo i semi di frumento, orzo e sorgo. Il fosforo nei cereali si trova in gran parte sotto forma di fitato, questa forma organica può essere assimilata solo dai ruminanti grazie alle fitasi batteriche che lo trasformano in fosforo inorganico, invece i monogastrici non riescono ad assimilarlo per la mancanza di questo enzima (Cevolani, 2005). La carenza di fosforo si manifesta con sintomi aspecifici: scarso appetito, riduzione dell'accrescimento, pelame opaco, si ha riduzione della fertilità maschile e femminile. L'assorbimento di questo elemento è ridotto in presenza di sali di alluminio, ferro e magnesio che con il P formano fosfati insolubili. Anche il rapporto Ca/P (2:1) è importante, quando nella razione vi è un forte eccesso di uno dei due, l'altro viene insolubilizzato per formazione di fosfato tricalcico, invece il suo assorbimento viene favorito dalla vitamina D (Borgioli,1995).

4.1.2 Zinco

Lo zinco è un oligolemento essenziale nel metabolismo di proteine, carboidrati, lipidi e acidi nucleici, e va a costituire numerosi enzimi e coenzimi; come la anidrasi carbonica, fosfatasi alcalina, alcool-deidrogenasi, DNA e RNA polimerasi. Lo Zinco è un costituente dell'insulina, svolge un'importante azione dermoprotettiva e immunostimolante ed è essenziale nella sintesi degli acidi nucleici. Per quanto riguarda gli effetti che ha sulla riproduzione, lo zinco svolge un importante ruolo sulla funzionalità della prostata, dell'epididimo e dei testicoli; in caso di carenza dell'elemento si assiste a atrofia di questi organi (Kumar e al., 2006). É stato riportato che influenza la spermatogenesi, la motilità degli spermatozoi, la stabilità della membrana compresa quella degli spermatozoi, preserva allo stato condensato la cromatina contenuta nel nucleo degli spermatozoi, garantendo quindi la loro funzione.

Inoltre è coinvolto nell'attivazione e nel mantenimento dell'epitelio germinativo dei tubuli seminiferi, e stimola la secrezione di testosterone che a sua volta va a stimolare la spermatogenesi (Kumar et al., 2006). Oltre a queste caratteristiche è anche un antiossidante svolge cioè una funzione detossificante rimuovendo i radicali liberi che si formano; inoltre l'acrosoma non è altro che un lisozoma altamente specializzato e lo zinco stabilizza e inibisce la degradazione dei lisosomi. Lo zinco è uno dei fattori principali responsabili della produzione di un anti-batterico rilasciato dalla prostata nel seme, che migliora la percentuale di spermatozoi vivi (Kumar et al., 2006). Questo elemento, come molti altri, non lo troveremo mai da solo ma sempre legato a proteine che quindi lo veicolano. Nell'integrazione dobbiamo tener conto che il suo assorbimento risente di fenomeni di antagonismo con il calcio, il ferro, il rame, i fitati e la fitina (Cevolani, 2005). Come detto i ruminanti riescono a metabolizzare i fitati grazie alla microflora ruminale e quindi non risentono di questo antagonismo (NRC, 2001). Come per il selenio anche lo zinco è stato dimostrato che se aggiunto in forma organica è maggiormente assimilabile (Scott et al., 1963). Gli alimenti naturalmente ricchi di zinco sono soprattutto le crusche dei cereali, i prodotti di origine animale e i lieviti. La dose raccomandata per le bovine da latte è di 150 mg/kg di alimento completo (Cevolani, 2005) mentre per i vitelli viene consigliata una dose di 35-40 mg/kg per mantenere le normali funzioni corporee, ma livelli maggiori migliorano l'immunità (Kumar et al., 2006). La dose tollerabile per bovini va dai 300-1000 mg/kg di alimento (NRC, 2001). Il seme e i suoi costituenti generalmente contengono alti valori di zinco, sebbene la concentrazione è molto variabile tra animali e tra specie (tab.3). Il suo collegamento con la fertilità è ormai chiaro, la carenza di questo elemento è stato dimostrato che porta a disfunzioni delle gonadi, ritardo dello sviluppo dei testicoli e riduzione del loro peso, si ha inoltre atrofia dei tubuli seminiferi e cessazione della spermatogenesi in agnelli, vitelli e ratti (Kumar e al., 2006). La concentrazione di zinco negli organi sessuali maschili e nelle secrezioni è normalmente alta e riflette il suo stato all'interno dell'organismo. Per esempio, valori di 105 ± 4.4 e 74 ± 5.0 mg Zn/kg SS sono stati segnalati per i testicoli di montoni fertili e infertili rispettivamente (Suttle, 2010). La carenza di questo elemento porta una diminuzione della produzione di gonadotropine ipofisarie e androgeni. La regolazione del metabolismo degli spermatozoi è mediato

dallo zinco che funge da regolatore dell'attività enzimatica del seme. Lo zinco viene incorporato all'interno degli spermatozoi durante la spermiogenesi per la maturazione e la sopravvivenza nell'epitelio germinale, nei gameti maschili lo zinco è associato a gruppi sulfidrili e disulfidrili ed è concentrato nella coda, quindi si ritiene sia coinvolto nella regolazione della motilità tramite il controllo dell'utilizzazione dell'energia tramite l'ATP coinvolta nella contrazione e attraverso la regolazione delle riserve energetiche dei fosfolipidi (Hidiroglou e Knipfel, 1984).

Specie animale Concentrazione di Zinco nel seme

(mg/kg) *

Toro 83,15 +/- 64,61

Ariete 60,46 +/- 35,37

Stallone 86,20 +/- 45,88

Verro 171,74 +/- 65,72

Tabella 3: * Concentrazione di zinco nel seme fresco (Kumar et al., 2006).

4.1.3 Selenio

Il selenio gioca un ruolo importante nella nutrizione animale, partecipando alla sintesi delle selenoproteine, attualmente si contano non meno di venticinque selenoproteine (Surai and Fisinin, 2015). Il selenio è un componete essenziale dell'enzima glutatione- perossidasi (GSH-PX) questo enzima converte il perossido di idrogeno in acqua ed è un importante componente del sistema antiossidante cellulare, protegge anche gli spermatozoi dall'ossidazione (NRC, 2001). Il Se insieme alla vitamina E, svolge un importante funzione protettrice delle membrane fosfolipidiche cellulari, nei confronti delle reazioni di ossido-riduzione, inoltre riveste un ruolo fondamentale nella formazione della forma attiva della tiroxina, trasforma il T4 in T3. Il Se può essere accumulato in alte concentrazioni nelle ghiandole endocrine e negli organi riproduttivi, è stato dimostrato che è un costituente degli spermatozoi ed è un elemento essenziale della spermatogenesi (Slowinska et al. 2011). La carenza di Se si riflette con problemi della sfera genitali sia femminile, come ritenzione di placenta, metriti e cistiti sia del maschile, con riduzione del numero di spermatozoi e minore motilità. Bisogna però tener presente che anche un eccesso di questo minerale può portare problemi, data la sua

tossicità, si riscontrano cirrosi epatiche, deperimento con astenia, zoppie e deformazioni degli unghioni ecc. Si sono riscontrati casi di avvelenamento da consumo di piante che accumulano molto Se (Astragalus sp.), se ci si attiene alle raccomandazioni sulla dose da integrare 0,5 mg/kg di alimento completo (Cevolani, 2005) è difficile avere problemi da eccesso dato che la tossicità acuta in vacche, si riscontra con dosaggi nettamente superiori, 10-20 mg di Se/kg di peso vivo, e tossicità cronica in vitelli tra 5-40 mg di Se/kg p.v. per un periodo prolungato (NRC, 2001).

Questo oligominerale è generalmente presente in natura, anche se alcuni pascoli possono esserne carenti, il contenuto di Se del suolo è direttamente proporzionale al contenuto del minerali di semi e foglie (NRC, 2001). In natura gli animali assumono selenio organico, le piante infatti assorbono il minerale sottoforma di selenito o selenato e sintetizzano aminoacidi, incluso la seleniometionina che rappresenta circa il 50% del Se contenuto nella granella dei cereali; l'assorbimento da parte delle piante è influenzato dal pH del terreno e dalla sua areazione, se forma complessi con il ferro diventa mal assorbibile, e le piante cresciute in quel terreno ne saranno carenti, l'integrazione nella dieta animale sarà necessaria per evitare turbe riproduttive. La forma inorganica per ora rimane la maggiormente utilizzata, le limitazioni al suo utilizzo del suo sono date dalla tossicità, dall'interazione con altri minerali, dalla bassa efficienza di trasferimento nei prodotti di origine animale e di costituire adeguate riserve corporee (Surai e Fisinin, 2015). Le forme di Se inorganico autorizzate per l'integrazione animale sono selenito di sodio e seleniato di sodio. Il loro assorbimento si aggira intorno al 40-50%; utilizzando fonti di selenio organico, come il lievito arricchito l'assorbimento aumenta, aumenta il Se ematico, nei tessuti e la concentrazione di GSH-px. (Johasson et al., 1990). Esistono tre principali forme di selenio organico, anche se la ricerca è sempre alla ricerca di forme più efficienti: lievito arricchito con selenio, selenio-metionina e selenio- metalosato (un insieme di Se inorganico e aminoacidi) i primi due possono essere considerati uguali dato che la maggior parte del selenio usato è SeMet (Suttle, 2010). Negli integratori a base di lievito arricchito, il contenuto di SeMet varia tra il 60 % e il 70%, e quello si SeCys del 10%-15% percui non avremo mai più dell' 85% di concentrazione anzi molte volte la percentuale è molto minore; inoltre il contenuto di SeMet in questi prodotti è molto variabile e con le tecnologie presenti attualmente è

difficile garantire un'esatta percentuale di minerale; una ulteriore problematica è data dalla difficoltà analitica con cui stabilire precisamente il contenuto in SeMet contenuto in lievito arricchito e soltanto pochi laboratori al mondo sono in grado di effettuare con precisione questa complessa analisi. Un'opzione più precisa potrebbe essere data dall'uso di SeMet purificata, ma sfortunatamente questa è una forma molto instabile e facilmente ossidabile (Surai e Fisinin, 2015). Queste forme risultano, come detto prima, maggiormente assimilabili, e si ritrovano maggiori livelli nei tessuti, ma ad oggi, non sono disponibili dati significativi sul miglioramento dello stato di salute e produzione, inoltre queste fonti sono maggiormente costose e registrano maggiori casi di reazione negativa al selenio (Suttle, 2010). Altri studi affermano che sono più importanti i livelli di Se integrato rispetto alla forma, e hanno dimostrato che per quanto riguarda gli agnelli, non c'è una differenza significativa fra forma organica e inorganica (Stupczyñska et al., 2009). Lo stesso autore ha riportato risultati positivi riguardo all'integrazione con 0,3 mg/kg di selenio organico (lievito arricchito con Se Sel-Plex, AlltechInc.) rispetto a selenio inorganico in tacchini, ha infatti registrato un aumento della concentrazione di spermatozoi, del numero totale di questi e un aumento della motilità (85%), scarsi invece i risultati rispetto allo stato antiossidativo e ai parametri biochimici (Slowinksa et al., 2011). Recentemente una nuovo prodotto maggiormente stabile, a base di selenio organico è stato sviluppato, seleno-idrossimetionina HMSeBA (nome commerciale Selisseo) sono stati condotti esperimenti nei broilers e in suini, mettendo a confronto questo nuovo prodotto e il lievito arricchito, i risultati sono stati positivi per entrambe le specie con aumento del livello generale del minerale e aumento del suo deposito corporeo (Surai e Fisinin, 2015). Quando si parla di fabbisogno di selenio, non è semplice stabilire un valore adeguato, perché questo dipende dallo stress ossidante al quale è esposto l'animale, che a sua volta dipende dalla combinazione di dieta e fattori ambientali, per esempio dipenderà da: contenuto della razione di vitamina E, di grassi polinsaturi PUFA; temperatura ambientale; stato fisiologico dell'animale e stato del pascolo o del foraggio assunto. Nel caso di diete ricche di vit. E il fabbisogno di selenio sarà basso mentre per diete ricche di PUFA il fabbisogno di selenio sarà elevato (Suttle, 2010).

4.1.4 Manganese

Questo minerale è il costituente o attivatore di importanti enzimi, quali l'arginasi e le carbossilasi. Nei ratti la carenza da origine a ritardi della crescita e ritardo dello sviluppo sessuale, nei maschi in particolare si ha degenerazione dei tubuli seminiferi del testicolo. Oltre a questo negli animali da allevamento abbiamo disturbi dell'ossificazione. Negli animali in accrescimento il fabbisogno è > 50 mg/kg di sostanza secca della razione (Borgioli,1995). É ben diffuso in tutti i vegetali, in particolare semi e tuberi, fieni e paglie invece è carente la granella di mais. I ruminanti vanno difficilmente in carenza.

4.1.5 Oligoelementi organici

Il sistema digestivo di tutti gli animali si è adattato a metabolizzare il selenio organico presente nelle piante, quindi l'inclusione di elementi minerari non è una condizione naturale e potrebbe essere meno efficiente (Surai e al., 2006).

L'integrazione delle diete dei ruminati viene generalmente apportata con sali inorganici quali ossidi, solfati o carbonati, non tenendo presente che non basta aggiungere un elemento a una dieta per aumentare la sua disponibilità e il suo assorbimento, quindi nella realtà dei fatti non andremo a correggere una carenza primaria o i deficit secondari dovuti a interazioni (con fitati, fosfati e ossalati) e antagonismi. Inoltre tutto ciò che non è assimilabile richiede un maggiore sforzo metabolico, a scapito delle produzioni, verrà eliminato andando a costituire un danno economico per l'allevatore che di fatto ha somministrato qualcosa che non è servito a nulla o poco; e renderà maggiormente inquinanti le deiezioni aumentando l'impatto degli allevamenti sull'ambiente. Caratteristica principale dei metalli è quella di acquisire o rilasciare elettroni promuovendo reazioni di ossido-riduzione, sono irritanti e potenzialmente tossici motivo per cui nel regno animali e vegetale vengono complessati "chelati", con il fine di renderli meno tossici e maggiormente assimilabili dall'organismo. La chelazione è una strategia naturale di protezione e potenziamento dei metalli, per cui è la forma maggiormente efficace per permettere un miglior assorbimento delle nostre integrazioni.

In alimentazione animale abbiamo a disposizione un ampia gamma di oligoelementi organici, la AAFCO (Association of America Feed Control Officials) ne ha definiti alcuni:

 Complesso metallo-aminoacido, il prodotto di un sale di metallo solubile con un aminoacido.

 Metallo proteinato (chelato), il prodotto della chelazione di un sale solubile di un metallo con un aminoacido e/o proteina parzialmente idrolizzate.

 Complesso metallo polisaccaride (carbonchelato), il prodotto risultante dal legame di sale solubile di metallo con una soluzione polisaccaridica.

 Complesso zinco-metionina, il prodotto risultante dal legame di un sale di zinco solubile con metionina.

 Metallo amino chelato, il prodotto risultante dalla reazione di uno ione metallico di un sale metallico solubile con un aminoacido in un rapporto molare : 1 mole di metallo con 1-3 moli di aminoacido per formare legami coordinati covalenti.  Metalosato, un metallo amino chelato nel quale gli aminoacidi costituenti

derivano dalla soia idrolizzata.

Oltre a questi metodi sopracitati, vi è anche la possibilità di rendere organici alcuni metalli con l'arricchimento di alcuni ceppi di lieviti. Gli oligoelementi come per esempio il selenio, vengono aggiunti al brodo di coltura dei lieviti in modo che questi li incorporino dopo averle organicate, risultando naturalmente arricchite. I minerali organici essendo elettricamente neutri, evitano fenomeni competitivi, interattivi e di saturazione dei sistemi di trasporto, rendendo fruibile all'animale l'integrazione.

Quando andiamo ad integrare un elemento, il sistema omeostatico di regolazione escrezione e assorbimento dell'animale reagirà sempre, con i composti organici questo può essere by passato permettendo all'organismo di usufruire di un maggior contenuto di nutrienti, l'assorbimento dei minerali avviene insieme all'assorbimento di aminoacidi e peptidi.

L'elemento non deve soltanto essere assorbito, ma deve raggiungere anche il sito di azione attivo. Il destino dell'oligoelemento dipende dall'aminoacido o peptide con il quale è legato, perciò si potrebbe migliorare l'efficacia dell'integrazione legando l'aminoacido migliore (Cevolani, 2005). Numerosi studi hanno dimostrato che si ottengono risultati migliori con integrazioni di minerali organici (Edens, 2002) (Edens e Sefton, 2003) (Agate e al., 2000). Di avviso diverso sono alcuni autori che non hanno rilevato differenze di assimilazione tra Se selenite e selenio organico aggiunto a lievito, somministrato ad agnelli, e affermano che influenza di più la quantità dell'elemento rispetto alla sua forma (Stupczyñska et al., 2009). Anche altri autori mettono in dubbio la differenza di assorbimento e di utilizzo di selenio organico (SelenioMetionina o SelenioCisteina) e selenio inorganico (selenito); infatti la selenite viene assorbita tramite assorbimento passivo, mentre SeMet e SeCy seguono la via di metionina e cisteina vengono assorbite attraverso il piccolo intestino intatte, quindi il valore di selenio sarà influenzato dal livello di questi due aminoacidi all'interno della dieta o della possibile sintesi proteica. L'assorbimento della SeCy è simile al selenito in tutte le specie, mentre SeMet risulta minore rispetto al selenito. In particolar modo la SeMet è influenzata dalla domanda/offerta di metionina, se la dieta è carente di questo aminoacido l'integrazione con selenio metionina andrà ad aumentare le riserve di selenio nei tessuti, ma non l'attività della GPX che sarà in declino. Perciò dobbiamo tener conto, quando andiamo a valutare la fonte migliore di integrazione, la sua disponibilità funzionale e tener conto anche del metodo di analisi che può andare a influenzare dando dei falsi positivi (Suttle, 2010). Per esempio da una ricerca sull' incidenza di determinate malattie su pulcini, si nota bene come la SeMet è meno efficace (Waschulewski e Sunde, 1988).

In un altro caso delle scrofe alimentate con selenio organico (lievito arricchito) e messe a confronto con scrofe alimentate con selenito, i risultati migliori si sono raggiunti con il selenito (Mahan e Peters, 2004). Per quanto riguarda la differenza tra ruminanti e non ruminanti, per i primi le fonti inorganiche vengono parzialmente incorporate in aminoacidi durante le fermentazioni ruminali come avviene nelle colture di lievito (Suttle, 2010).

4.2 Le vitamine

Le vitamine sono bioregolatori estremamente importanti e insostituibili, liberi o combinati vanno a costituire la maggior parte dei gruppi funzionali degli enzimi (coenzimi) e insieme a questi e agli ormoni regolano e controllano tutte le funzioni dell'organismo, in modo da garantire un buono stato di salute e la produttività. Dal