Effetto dell'integrazione vitaminico-minerale della dieta sulla qualita' del seme delle principali specie zootecniche

Dipartimento Scienze Veterinarie

Corso di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie delle Produzioni Animali

Tesi di Laurea

Effetto dell'integrazione vitaminico-minerale della dieta

sulla qualità del seme delle principali specie zootecniche

Candidato

Relatore

Nadia Alberti

Dott. Gian Battista Liponi

Indice

1Riassunto ...5

2Introduzione...7

3Principali parametri di valutazione del seme ...10

3.1Caratteri Quantitativi ...11

3.1.1Volume dell'eiaculato...12

3.1.2Concentrazione di spermatozoi...12

3.2Caratteri Qualitativi...16

3.2.1Motilità...16

3.2.2Valutazione della Morfologia ...22

3.2.2.1Metodi di Valutazione della Morfologia ...23

3.2.3Anormalità ...25

3.2.3.1Principali anomalie ...27

3.2.3.2 Differenze di specie...28

3.2.4Test della funzionalità; HOSST e BCMPT...31

3.2.4.1Hos-Test ...31

3.2.4.2BCMPT bovine cervical mucus penetration test...32

3.2.5 Attività enzimatica principale: fosfatasi alcalina; acido fosfatasi; GOT e GPT...35

3.2.6Concentrazione di ATP...34

3.3Danno da ossidazione e sistemi antiossidanti...34

3.3.1La perossidazione lipidica nel seme ...35

3.3.2Sistema antiossidante ...36

3.3.3La glutatione perossidasi nel seme ...37

4Integrazione alimentare...39 4.1I Minerali ...39 4.1.1Fosforo ...40 4.1.2Zinco...40 4.1.3Selenio ...42 4.1.4Manganese...45 4.1.5Oligoelementi organici...45 4.2Le vitamine ...48

4.2.1Le vitamine che migliorano la fertilità ...49

4.2.1.1Liposolubili ...50

4.2.1.2Idrosolubili ...53

4.2.2Fabbisogni ...54

4.3Specie animali e effetto di integrazione di vitamine e minerali ...57

4.3.1Ariete...57 4.3.2Montone ...57 4.3.3Avicoli ...58 4.3.4Coniglio...61 4.3.5Verro ...63 4.3.6Stallone ...67 4.3.7Toro ...71 5Conclusioni ...75 6Bibliografia...77

1 Riassunto

Effetto dell'integrazione vitaminico-minerale della dieta sulla qualità del seme delle principali specie zootecniche.

Scopo. L'obiettivo di questa tesi è quello di analizzare i principali lavori scientifici che

sono stati condotti fino ad oggi riguardo l'effetto di vitamine e minerali sulla qualità del seme delle principali specie zootecniche allevate. La fertilità del maschio dipende in primo luogo dalla qualità e dalla quantità del seme prodotto. Nei centri di produzione di seme e negli allevamenti a ciclo chiuso, risulta importante la valutazione del seme, sia nella scelta degli animali da destinare alla riproduzione sia durante la produzione per garantire una adeguata fertilità. L'alimentazione è uno dei principali fattori esogeni che influisce sulla qualità del seme; in particolare l'integrazione di minerali e vitamine è essenziale.

Materiali e metodi. É stata presa in considerazione la principale bibliografia che negli

anni ha preso in esame lo scopo della presente tesi.

Risultati e discussioni. Da un accurato esame è emerso che l'integrazione

vitaminico-minerale influisce sulla qualità del seme di tutte le specie allevate, anche se con risultati diversi. Gli oligoelementi minerali i più importanti per mantenere e migliorare la fertilità maschile sono lo zinco e il selenio. Lo zinco influisce sulla funzionalità della prostata, dell'epididimo e dei testicoli; garantisce la funzione e il mantenimento dello strato germinativo e quindi influisce direttamente la spermatogenesi, si ritrova concentrato nel flagello degli spermatozoi e controlla l'utilizzo dell'ATP influenzando la motilità, ha inoltre azione antiossidante. Il selenio agisce come antiossidante principale è il costituente principale della glutatione-perossidasi (GSH-px), influisce sulla spermatogenesi. I macroelementi non hanno un effetto diretto sulla qualità del seme, ma concorrono a mantenere in ottima salute l'animale, e quindi indirettamente vanno ad influenzare la riproduzione. In generale gli elementi minerali in forma organica risultano essere maggiormente assimilabili dagli animali, ma ancora non è chiaro e non può essere affermato con sicurezza che questa forma sia migliore. Tra le vitamine liposolubili la E è la più importante, agisce soprattutto come antiossidante prevenendo l'ossidazione lipidica della membrana e la ritroviamo inglobata al suo interno, anch'essa influisce sul processo di spermatogenesi. La vitamina C coadiuva l'azione antiossidante sostenuta dalla vitamina E. La vitamina A protegge gli epiteli e quindi anche l'epitelio germinativo dei tubuli seminiferi del testicolo. L'azione di vitamine e minerali insieme dà risultati migliori, come si assiste con l'integrazione di vit.E e selenio. Considerando le varie specie zootecniche risulta che, l'integrazione vitaminico-minerale è più efficace negli animali sensibili alle alte temperature ambientali come suini, bovini e avicoli e in animali che hanno degli stati di carenza o soggetti con produzioni di seme intense e concentrate in una stagione. Nei cavalli gli effetti sono minori data la minor suscettibilità del loro seme all'ossidazione.

Abstract

The effect of vitamin-mineral supplementation of diet on semen quality of the main livestock species.

Object. The aim of this thesis is to analyze the main scientific works that have been

conducted to date about the effect of vitamins and minerals on the sperm quality of the main livestock species. Male fertility depends primarily on the quality and quantity of semen produced. In the centers of production of sperm, and in closed cycle farms, it is important to the evaluation of the sperm both in the choice of animals to be used to play both during production to ensure adequate fertility. Nutrition is one of the main external factors that affect the quality of the semen especially the supplemetation of minerals and vitamins is essential.

Materials and methods. It was considered the main references in the years examined

the objective of this thesis.

Results and discussion. A careful review showed that the vitamin-mineral integration

affects the quality of the sperm of all livestock species, although with different results. The mineral trace elements most important to maintain and improve male fertility are zinc and selenium. Zinc affects the prostate function, epididymis and testicles; provides the function and maintenance of the germinal layer and thus directly affects spermatogenesis, is found concentrated in the flagellum of sperm and controls the use of ATP influencing motility, also antioxidant. Selenium acts as the primary antioxidant and is the main constituent of glutathione peroxidase (GSH-px), it affects spermatogenesis. The macroelements does not have a direct effect on semen quality, but must keep the animal in good health, and then indirect go to influence the reproduction. In general, the mineral elements in organic form appear to be more assimilable by the animals, but still it is not clear and can not be stated with certainty that this form is better. Between the fat-soluble vitamin E is the most important, especially acts as an antioxidant by preventing lipid oxidation of the membrane and we find it incorporated inside it, also it affects the process of spermatogenesis. Vitamin C assists the antioxidant action supported by vitamin E. Vitamin A protects epithelia and therefore also the germinal epithelium of the seminiferous tubules of the testis. The action of vitamins and minerals together gives better results, as it assists with the integration of vitamin E and selenium. Given the different livestock species that, the vitamin-mineral supplementation is more effective in animals susceptible to high ambient temperatures as pigs, cattle and poultry and animals which have the states of deficiency or subjects of intense seed productions and concentrated in a season. In horses, the effects are minor due to the lower susceptibility to oxidation of their semen.

2 Introduzione

La moderna zootecnica ha assunto due indirizzi principali; l'allevamento di tipo estensivo dove gli animali sono meno sfruttati e quindi necessitano di minori input e l'allevamento di tipo intensivo dove agli animali è richiesto un maggiore sforzo e quindi nostro interesse e impegno garantire adeguati livelli nutritivi per il raggiungimento di standard qualitativi elevati e redditizi. Se per quanto riguarda la fertilità femminile si è molto indagato e siamo a conoscenza dell'importanza dell'integrazione di oligoelementi e vitamine durante la loro carriera riproduttiva (Kellogg et al., 2003) per quanto riguarda la fertilità maschile gli studi sono minori e c'è ancora molto da indagare.

Con l'avvento delle nuove tecniche di selezione genetica: genomica e proteomica ai giovani torelli si richiede di entrare in produzione di seme molto presto, quando ancora non hanno ancora raggiunto la piena maturità sessuale (tori razze da latte 11-13 mesi di età; tori razze da carne 12-15 mesi di età). Per massimizzare il potenziale riproduttivo dei giovani tori è importante quindi ottimizzare l'alimentazione durante le prime settimane di vita (dalle 10 alle 30 settimane) e nel post-pubertà (Jacob et al., 2016), un ruolo importante viene assunto soprattutto dall'apporto dei minerali in particolare zinco, e selenio e della vitamina E, A e C.

É di fondamentale importanza l'attenta e sistematica valutazione del seme dal quale ne deriva la fertilità dell'allevamento ed anche il corretto management aziendale.

Il volume totale e la concentrazione di spermatozoi sono influenzati da molteplici fattori; età, stato di salute, frequenza di raccolta, procedure di raccolta, stagione, specie e tipo di allevamento, non di minore importanza l'alimentazione e in particolare l'integrazione vitaminico-minerale che gioca un ruolo fondamentale, sia direttamente, andando ad aumentare la produzione e le caratteristiche fondamentali del seme fertile, come riportano molti autori in diverse specie, che indirettamente andando a migliorare lo stato di salute dell'animale e il suo benessere generale.

In condizioni naturali i nostri animali in produzione zootecnica non necessitano di particolari integrazioni, ma dal momento in cui li alleviamoin maniera intensiva questi possono andare incontro a carenze che si riflettono sulla loro salute e quindi sulla qualità, la quantità delle produzioni e sulla sfera riproduttiva.

Molta attenzione viene posta sulla corretta alimentazione della vacca, della pecora, della scrofa e della fattrice, in generale sull'alimentazione femminili, trascurando la corretta gestione dell'alimentazione della linea maschile dei nostri animali in allevamento dimenticando che quando si parla di fertilità il maschio contribuisce per il 50% al successo riproduttivo.

Da tenere presente che la produzione di seme non è continua, ma nel toro occorrono circa 60 giorni per lo sviluppo da cellula germinativa a cellula spermatozoo, perciò lo sperma eiaculato oggi riflette lo stato nutrizionale del toro dei 60 giorni precedenti, bisogna quindi cercare di mantenere un certo equilibrio nella sua alimentazione. La fertilità del toro è quindi in evoluzione, la fertilità di un anno fa può non essere la stessa di oggi. Animali stagionali come possono essere i cavalli e gli ovi-caprini devono sostenere un forte stress in un periodo ristretto di tempo, la stagione di monta, e a questi si richiede una forte produzione di sperma, prodotto anch'esso durante il processo di spermatogenesi, in ogni specie ha una durata diversa, come detto per il toro è di circa 60 giorni, nello stallone è 57 giorni, nel verro è di 39 giorni è nell'ariete 47 giorni (Hafez and Hafez, 2000). Per cui anche per le specie con riproduzione stagionale è importante garantire una adeguata integrazione di elementi minerali e vitamine, per far fronte alla concentrata e intensa richiesta della stagione di monta.

I lipidi sono un importante costituente del seme dei mammiferi, essi svolgono una funzione strutturale andando a costituire componenti della membrana degli spermatozoi, sono precursori di numerosi composti biologicamente attivi (eicosanoidi) e forniscono energia. Questi grassi sono acidi grassi polinsaturi PUFA, il 50% dei fosfolipidi totali sono rappresentati da catene da 20 a 22 atomi di carbonio, in particolar modo l'acido docosaesaenoico DHA è il più rappresentato e più importante, le caratteristiche di questi lipidi sono correlati positivamente con la mobilità e la normalità dei gameti. Ogni specie ha un diverso profilo di PUFA, le membrane degli spermatozoi delle diverse specie contengono percentuali diverse degli stessi acidi grassi; per esempio nel suino si ha predominanza di acido docosopentaenoico (22:5 n-6) che è quasi assente nell'ariete e nel gallo; mentre nel gallo il più rappresentato è l'acido adrenico ( 22:4 n-6) (Surai e Fisinin, 2015). L'alto grado di insaturazione di questi lipidi, rendono però queste cellule molto suscettibili alla perossidazione, che a sua volta è ritenuta una delle cause di

maggiore rilievo dell'infertilità maschile (Castellini e al., 1999).

A partire dal primo studio sulle funzioni riproduttive dei ratti di (Evans e Bishop, 1922) molti sono stati gli studi che hanno indagato e dimostrato i benefici che l'integrazione della dieta con vitamina E apporta sulla fertilità in diverse specie animali. La fertilità del maschio dipende dalla quantità e qualità del seme e degli spermatozoi; volume, concentrazione, vitalità, motilità integrità e capacità fertilizzante. Queste caratteristiche sono influenzate da molti fattori ambientali e agenti chimico fisici che possono entrare nell'organismo attraverso l'assunzione di alimenti, la respirazione e il contatto cutaneo; i risultati negativi possono essere parzialmente controllati con trattamenti farmacologici o meglio ancora con l'integrazione alimentare con benefici componenti: i minerali le vitamine (Rengaraj e HoHong, 2015).

La produzione di seme necessita di numerose divisioni cellulari, quindi una grande richiesta di zinco, elemento che è coinvolto ampiamente nel metabolismo degli acidi nucleici e delle proteine, quindi questo minerale è fondamentale per la buona differenziazione e replicazione cellulare (Kendall, 2000). Questo ci suggerisce che gli animali da riproduzione necessitano di adeguati livelli di questo minerale per mantenere lo stato di salute e la produzione.

É ormai da tempo entrato nella pratica normale di allevamento aggiungere alla dieta degli animali in produzione zootecnica vitamine e minerali che migliorano la riproduzione animale, questo lavoro vuol compiere una panoramica sull'effetti di minerali e vitamine della dieta, al fine di migliorare qualità del seme e quindi la fertilità, indagando quali sono i risultati ottenuti, fino ad oggi, nelle principali specie zootecniche allevate, inoltre verrà valutato se la forma organica degli elementi minerali, è veramente più efficienti e dà maggiori risultati.

3 Principali parametri di valutazione del seme

I parametri utilizzati per la valuzione del seme sono molteplici e variano in base a quale aspetto vogliamo andare ad indagare. Le caratteristiche del seme possono essere classificate in caratteri quantitativi e caratteri qualitativi:

Caratteri quantitativi

 Volume dell'eiaculato

 Concentrazione di spermatozoi  Numero di spermatozoi per eiaculato Caratteri qualitativi  pH  Motilità massale  motilità individuale  % di spermatozoi vivi  % di spematozooi anormali  % di acrosoma intatto

 Test della funzionalità; BCMPT e HOSST

 stima dell'attività degli enzimi del plasma; Fosfatasi Alcalina, Acido Fosfatasi, GOT e GPT, GSH px (Kumar et al. 2006)

3.1 Caratteri Quantitativi

Specie animale Volume di eiaculato (ml) Concentrazione spz (mil /ml) Spz / eiaculato (bilioni) Ciclo tubulo seminifero (giorni) Toro 5,0-8,0 800-2000 5-15 61 Stallone 60-100 150-300 5-15 55 Ariete 0,8-1,2 2000-3000 1,6-3,6 47 Becco 0,5-1,2 2500-5000 / / Verro 150-200 200-300 30-60 39 Coniglio 0,5-3,5 150 / 48 Tacchin o* 0,3-0,4 11000 / / Gallo 0,2-0,5 3000-7000 0,06-3,5 /

Tabella 1: Caratteristiche seme delle principali specie allevate (Hafez e Hafez,2000) *(Cavani et al,2008).

In generale si procede per ogni specie, prima ad una valutazione dell'aspetto generale e del colore del seme fresco.

Il seme fresco di stallone si divide in due frazione: gel-free fraction di colore grigio biancastro, maggiore o minore torbidità è indice approssimativo della concentrazione; e gel fraction di colore bianco, vischiosa e gelatinosa dovuta ai prodotti secrezione delle vescicole seminali e ghiandole di Cowper; prima della valutazione questa parte deve essere rimossa.

Nel toro il seme è bianco lattiginoso, ma può tendere al giallo in base al contenuto di caroteni nell'alimentazione.

Nel verro è bianco lattiginoso con presenza di granuli che in cervice creano una massa compatta, si distinguono tre frazioni (pre-sperm; sperm-rich; post-sperm) con diverse concentrazioni di spermatozoi.

Nell'ariete il seme è bianco latte o crema chiaro, mentre nel becco il colore è molto variabile dal grigiastro al giallo.

In linea generale un seme poco concentrato sarà grigiastro e acquoso, uno altamente concentrato sarà denso e cremoso. Colorazioni anomale indicano problematiche a livello urogenitale e per questo il seme viene scartato (Hafez e Hafez, 2000).

3.1.1 Volume dell'eiaculato

Il volume viene misurato in millilitri con l'uso di cilindri graduati sterilizzati e riscaldati a 37°C per evitare di danneggiaire il liquido seminale; in alternativa si può pesare il seme, premettendo che un millilitro di seme pesi un grammo (McKinnon, 2011).

3.1.2 Concentrazione di spermatozoi

Prima di procedere alla determinazione della concentrazione, bisogna ricordare che l'eiaculato di alcune specie presenta distinte frazioni con diverso numero di spermatozoi e con caratteristiche eterogenee: viscosità, opacità e presenza di particelle che possono interferire con la misurazione. Per esempio nel caso dello stallone e del verro si deve prima rimuovere la parte gelatiniforme dell'eiaculato. Importante quindi, per una buona valutazione, fare una adeguata diluizione (1:1000 per i molto concentrati come il montone, 1:5 per i poco concentrati come il verro) in modo da ottenere un campione rappresentativo dell'eiaculato.

Metodi manuali:

Si basano su conta diretta su diversi tipi di camere: Emocitometria; vetrino spesso con due camere rettangolari a formare una "H" suddivise in griglie, vengono contati al microscopio gli spermatozoi che ricadono al suo interno. Generalmente la profondità delle camere è di 100 μm. Esistono numerosi emocitometri il più usato per la misurazione della concentrazione spermatica è la camera Improve Neubauer (Brito et al., 2016).

 Camera di Makler; è stata costruita appositamente per la conta spermatica di seme non diluito, è costituita da un supporto metallico con al centro montato un vetrino circolare con inciso la griglia (1 mm2_{). La profondità è di 10 μm e la} speciale forma permette il movimento orizzontale degli spermatozoi, questo ci permette di valutare anche la motilità e si ottengono risultati migliori. La conta si

esprime come milioni su millilitro (Makler, 1978).

 esistono anche camere usa e getta per minimizzare il contatto con materiale infetto; con griglia o senza griglia, in questo ultimo caso dobbiamo ricorre all'uso di un oculare con reticolo.

Protocollo per Emocitometria:

1. Diluire il seme fresco in base alla specie presa in esame, per esempio 1:100 per lo stallone (20μm: 1,98ml). Con formalina tamponata o citrato di sodio 0,5 M. Miscelare bene il seme fresco in modo da prelevare un campione rappresentativo.

2. Miscelare bene il seme diluito e caricare 12 μm in una pipetta, riempire lentamente una delle due camere dell'emocitometro, procedere con la seconda. 3. Lasciare qualche minuto che il campione e l'emocitometro si stabilizzano,

ponendolo in una camera umida.

4. Osservare il campione al microscopio (20x), e inquadrare la griglia centrale, costituita da un quadrato 5 per 5 a sua volta divisa in piccoli quadrati 4 per 4. 5. I bordi dei 25 quadrati grandi sono definiti da tre linee, la linea centrale

rappresenta il confine dell'area di conteggio. Contare tutti gli spermatozoi , che hanno più della metà della testa all'interno dell'area. Degli spermatozoi che sono perfettamente a metà, sono contati solo quelli che giacciono sulla linea superiore e destra, in modo da non contarli due volte in riquadri vicini.

6. Contare tutti gli spermatozoi all'interno dei 25 quadrati di entrambe le camere, la media sono i milioni di spermatozoi per millilitro. I 25 quadrati rappresentano un quadrato di lato 1mm, la profondità dell'emocitometro è 0,1 mm. Perciò il volume dei 25 quadrati sarà 0,1 μl (1*1*0,1=0,1). Per ottenere la concentrazione di spermatozoi in milioni/millilitro, moltiplicare il numero di spermatozoi contati per 10.000 (1 ml = 1000 μl; 0,1 μl= 10.000). Esempio: se conto 243 in 0,1 μl avremo 243 spermatozoi e quindi in un ml 2.430.000 spermatozoi. Bisogna ricordarsi che avevamo preventivamente fatto una diluizione 1:100 per cui va moltiplicato per il fattore di diluizione; 2.430.000*100 = 243*106_/ml. (McKinnon,2011).

autori raccomandano di contare minimo 400 spermatozoi, e di accordare l'area esaminata con la diluzione effettuata. E ripetere più volte il conteggio.

Metodi automatici:

 Spettrofotometro; è il metodo di conta indiretto più usato, veloce attendibile e poco costoso. Lo strumento emette un fascio di luce che attraversa il campione, il photodetector rileva l'intensità della radiazione che lo raggiunge, il segnale registrato viene poi convertito in un valore di assorbanza che viene ulteriormente convertito in concentrazione di spermatozoi.

Per minimizzare l'errore, il macchinario deve essere usato sempre le stesse condizioni (lunghezza d'onda, il rapporto di diluizione diluente, miscelazione, tempo consentito prima analisi, ecc) utilizzate per la calibrazione. Dato che il metodo non conta direttamente gli spermatozoi, si perde di accuratezza quando i campioni contengono molti detriti o cellule diverse da spermatozoi.

 Computer assisted semen analysis (CASA) è un metodo automatico di analisi di immagini di spermatozoi, è rapido e abbastanza preciso anche se presenta numerosi problemi tecnici e variazioni, per questo motivo non è consigliato da WHO e National Association of Animal Breeders (Brito et al., 2012). Il principio della CASA comporta la visualizzazione e la digitalizzazione d'immagini di una successione di spermatozoi utilizzando un microscopio

installato (hardware), segue l'elaborazione e l'analisi di immagini per identificare il nnumero di spermatozoi (software). L'area delle immagini è nota, il volume viene misurato e la concentrazione dello sperma può essere calcolata. Esistono diversi hardware e software, alcuni hanno speciali filtri per leggere colorazioni a fluorescenza. Le immagini vengono registrate da una fotocamera, generalmente ogni 0,5 secondi. Il CASA viene utilizzato anche per valutare la morfologia e la motilità degli spermatozoi. Per interpretare i risultati, il sistema deve essere utilizzato da personale altamente competente e istruito sul funzionamento del sistema (Brito et al., 2016).

 NucleoCounter: è uno strumento per l'analisi automatica della concentrazione di spermatozoi, la misurazione è veloce, è richiesto una piccola dose per il campione (10 μl – 100 μl) non è necessaria la calibrazione, a differenza del CASA, e si ottengono risultati precisi e attendibili. Non risente di interferenza

con altri tipi di cellule, gel, diluenti ecc, perché esistono diversi software in grado di riconoscere la dimensione del nucleo degli spermatozoi delle maggiori specie studiate (Brito et al., 2016). Il campione viene diluito e unito a un reagente (SP-100 Diluent), che immobilizza gli spermatozoi e rende le membrane permeabili, dopo di che il campione viene inserito in particolari cassette (SP1 Cassette) contenenti un colorante fluorescente (Propidio Ioduro) che si intercala nel DNA, il macchinario registra il segnale fluorescente che il Software converte in concentrazione spermatica (Mckinnon et al., 2011).

 Flow Citometria o la citometria a flusso utilizza la luce diffusa e la fluorescenza di singoli spermatozoi è un metodo rapido che ci permette di escludere altri componenti dell'eiaculato come gel detriti e altre cellule, questo rende la citometria a flusso un metodo preciso e accurato per la conta spermatica. Questo metodo però viene soprattutto utilizzato in ambienti accademici, di ricerca, per validare altri metodi e per la calibrazione di differenti strumenti; il macchinario ha inoltre un costo elevato e deve essere utilizzato da un operatore qualificato. Nonostante le piccole incongruenze tra gli studi, gli autori hanno concluso che in generale il Nucleo Counter e la Citometria a Flusso sono i metodi più precisi per la stima della concentrazione di spermatozoi, i risultati ottenuti con questi metodi automatizzati sono molto più precisi di quelli ottenuti con hemocytometer. Il NucleoCounter inoltre è stato consigliato dal Danish National Committee for Pig Production ed è il metodo di scelta per la valutazione di seme congelato bovino nel centro di elaborazione del Nord America. Il Nucleo Counter e la Citometria a Flusso, insieme con il Emocitometro, sono tutti i metodi di riferimento e sono raccomandati dal National Association of Animal Breeders, per la calibrazione e la garanzia della qualità degli Spettrofotometri (Brito et al., 2016).

3.2 Caratteri Qualitativi

Specie animale pH Motilità % (seme fresco) Morfologia normale% Toro 6,4-7,8 40-75 65-95 Stallone 7,2-7,8 40-75 60-90 Ariete 5,9-7,3 60-80 80-95 Verro 7,3-7,8 50-80 70-90 Gallo 7,2-7,6 60-80 85-90

Tabella 2: Caratteristiche qualitative principali specie allevate (Hafez e Hafez, 2000)

3.2.1 Motilità

La motilità è uno dei parametri più importanti da valutare per determinare la qualità del seme; la motilità si può considerare la capacità di sopravvivere e risalire le vie genitali femminile e quindi avere la fertilizzazione con successo. La motilità deve mantenersi a livelli accettabili anche nel seme conservatore, refrigerato o congelato. Per la crioconservazione, si procede a valutare la motilità sia prima che dopo congelamento, per valutare anche che il processo sia avvenuto nel giusto modo.

La motilità è influenzata da molteplici fattori sia endogeni che esogeni. Fattori endogeni :

 età del soggetto; tempo di stoccaggio nell'epididimo, frequenza di eiaculazione  maturazione degli spermatozoi

 riserve di energia (ATP), in particolare il trasporto di membrana, il trasporto di ioni, movimenti del flagello e la contrazione delle proteine.

 superficie e attività tensioattiva, quali fattore di agglutinazione, anticorpi, integrità di membrana e dei recettori.

Fattori esogeni:

 Fattori di stimolazione e inibizione dovuta a: ioni inorganici (Cu, Zn, Cd, Mn, Hg); ormoni; prostaglandine; fattori immunochimici; farmaci; inquinamento ambientale ecc.

vaginali, muco cervicale, fluidi uterini).

 Fattori fisici e fisiologici; idrodinamica, viscosità, osmolalità, pH, temperautra, composizione ionica. (Hafez e Hafez, 2000).

La motilità è considerata generalmente un riflesso della vitalità degli spermatozoi in un dato campione. Un seme con scarsa o insufficiente motilità è considerato non fertile, anche se non ci possiamo basare sul solo esame della motilità per valutare la fertilità, inoltre motilità elevate possono non corrispondere a alta fertilità del seme (Mckinnon, 2011).

Nella maggior parte dei mammiferi si riscontrano due tipi di movimenti fisiologici, la motilità attivata caratterizzata da una certa simmetria, movimenti flagellari poco ampi che si traducono in un movimento lineare degli spermatozoi, questo tipo di avanzare si pensa agevoli la risalita delle vie genitali femminili e la motilità iperattivata dove i movimenti sono asimetrici e ampi e gli spermatozoi avanzeranno con moto circolare o a formare un otto, questo tipo di motilità lo possiamo osservare in sede di fertilizzazione (Turner,2006). La struttura responsabile del moto propulsivo è l'assone che si estende lungo il flagello dello spematozoo. Il movimento avviene grazie a un "motore proteico" la dineina, questa necessita di energia che viene fornita dall'idrolisi di ATP prodotta dai mitocondri, la dineina è in grado di trasformare l'energia chimica in energia meccanica generando il movimento (McKinnon, 2011).

Valutazione motilità:

Quando si va a valutare la motilità di un campione sia fresco che scongelato, dobbiamo porre molta attezione che tutto ciò che viene in contatto con il seme (diluitore, vetrino portaoggetti e coprioggetti, microscopio ecc.) sia a una temperatura di 37°C per evitare di danneggiarlo; tutte le attrezzature devono essere pulite e prive di residui di detergenti o disinfettanti; meglio se monouso.

Nella valutazione della motilità su seme fresco può essere difficile essere precisi e attendibili quando abbiamo alte concentrazioni di spermatozoi; infatti tenderanno ad agglutinarsi sul vetrino e risulterà una valutazione sottostimata. La giusta diluizione varia in base alla specie, per lo stallone, va dai 24 ai 50 milioni di spermatozoi/ml. Certe volte può comunque essere utile valutare anche il seme non diluito in questo caso il tecnico deve avere una buona strumentazione ed esperienza (Mckinnon, 2011).

La motilità può essere valutata ad "occhio" da un operatore altamente esperto e che abbia eseguito numerose analisi, viene definito come metodo soggettivo perché dipende molto dall'interpretazione del tecnico, oppure esistono metodi oggettivi come il CASA, che risentono meno del fattore umano.

Valutazione “ad occhio”:

Per l'analisi occorre un microscopio, vetrino portaoggetti e coprioggetti, mestruo diluitore. Generalmente il microscopio usato è a contrasto di fase con ingrandimento di 200x. Si può valutare la motilità totale descritta dai seguenti parametri: VG turbinii rapidi, G turbinii lenti e vortici, F no turbinii ma importanti movimenti della singola cellula, P piccoli o no movimenti della singola cellula (Youngquisit e Threlfall, 2007). La motilità progressiva che comprende la rapidità di movimento, la linearità e la velocità valutate tenendo conto di una scala da 0 (immobile) a 4 (rapido). Per i descrittori utilizziamo i seguenti range: VG = 80%-100%; G = 60%-79%; F = 40%-59%; P = meno del 40% (Youngquisit e Threlfall, 2007). Entrambe le motilità sono espresse come percentuale sul totale degli spermatozoi del campione.

Una goccia (5-10 μl) di sperma diluito a 37°C viene posto su un vetrino riscaldato, si pone con molta attenzione il vetrino coprioggetti evitando la formazione di bolle, alcuni (Youngquisit e Threlfall, 2007) non usano il vetrino coprioggetti. É importante mantenere la temperatura durante l'analisi e per questo si usa un microscopio con base riscaldata. Gli spermatozoi sono valutati al centro del vetrino, evitando i bordi dove lo sperma si secca facilmente e darebbe dei risultati falsati; vengono valutati più campi del vetrino, almeno sei, e se si vuole aumentare l'accuratezza di possono usare più esaminatori ( McKinnon, 2011).

Per la motilità progressiva si può anche non diluire lo sperma, una goccia di diametro di 3-4 mm. Viene posta su un vetrino si forma uno strato sottile di fluido, si usano ingrandimenti 200x 500x con microscopio a contrasto di fase, è difficile valutare la motilità individuale con microscopio ottico.

Computer-assisted sperm analysis: CASA.

Questo strumento è stato sviluppato negli anni ottanta; in seguito l'analisi si è evoluta ulteriormente con nuovi sistemi di acquisizione delle immagini, sistemi di calcolo più precisi e software sempre aggiornati e migliorati (Amann and Waberski, 2014). Negli

anni, è rimasto invariato il concetto base di rilevamento immagini, basato sull'intensità dei pixel in una cornice o in un campo a luce diffusa, e i componenti principali: una video-fotocamera, una scheda video-foto grabber, un computer.

Il software più idoneo per specie e uso, viene poi installato per identificare, analizzare le immagini degli spermatozoi ed eseguire i relativi calcoli che forniranno i risultati finali. (Mortimer, 2000).

I moderni sistemi CASA possono visualizzare automaticamente più campi di una superficie, catturare immagini stroboscopiche da 500 a > 2000 spermatozoi, a 50 o 60 fotogrammi al secondo con qualunque tipo di dilutore e in < 2 minuti, memorizzare le informazioni per 30 fotogrammi, fornire i dati di riepilogo per ogni spermatozoo e per la popolazione media di spermatozoi. Alcuni sistemi possono valutare contemporaneamente la morfologia e la motilità. La specie animali, il tipo e la concentrazione del diluitore, la fotocamera, l'intensità di illuminazione, l'hardware e il software di imaging, le impostazioni dello strumento, il tecnico che esegue l'analisi, sono tutti fattori che influenzano l'accuratezza e la precisione dei valori di uscita (Amann and Waberski, 2014).

Gli spermatozoi, vengono identificati dal computer in base alla dimensione della testa, per ogni specie è definito un range di dimensione, in base alla luminosità. Ogni oggetto all'interno di questo range viene riconosciuto come testa di spermatozoi; la luminosità serve come ulteriore discriminante spermatozoo/no-spermatozoo. Ogni oggetto mobile, con una determina dimensione e luminosità viene riconosciuto come spermatozoo e seguito dal macchinario; quello che non rientra in questi limiti viene classificato come non spermatozoo. L'immagine digitalizzata della testa viene seguita dal computer in un sistema di assi cartesiani x,y e viene ricostruita la traccia del percorso che compie lo spermatozoo durante il suo movimento, in un preciso campo e in un determinato tempo. Vengono analizzati più campi e il risultato finale è una media delle rilevazioni; la ricostruzione della traiettoria può essere alternata dal numero di immagini acquisite per secondo, più immagini vengono registrate e maggiore sarà l'accuratezza del risultato. Per confrontare i risultati di più analisi è importante standardizzare il numero di immagini da acquisire, pochi fotogrammi daranno un risultato lineare, aumentando il numero delle rilevazioni ci si allontanerà di più dalla traiettoria lineare. Per questo è

raccomandato analizzare dalle 300-500 cellule mobili per campione, su più campi scelti dal tecnico in modo casuale. Con il CASA si può calcolare la motilità totale, e la motilità progressiva. La motilità totale è determinata dal numero di spermatozoi che si muovono al di sopra di una certa soglia definita durante la programmazione dello strumento (per lo stallone generalmente > 20 μm/s). Gli spermatozoi che si muovono al di sotto della soglia vengono classificati come cellule lente e vengono definite ferme e non contribuiscono alla motilità totale (McKinnon, 2011). Il sistema CASA può calcolare molte caratteristiche specifiche:

VCL o velocità curvilinea, si basa sulla distanza totale che lo spermatozoo percorre durante l'analisi perciò è il dato dimensionalmente maggiore (espresso μm/s).

VSL o velocità lineare, deriva dalla distanza dritta tra un primo e un secondo punto della traiettoria ed è di solito il valore più basso (espresso μm/s).

VAP o percorso medio, è la distanzia media percorsa dallo spermatozoo durante l'analisi prendendo la posizione di ogni punto sul sistema x,y (espresso μm/s).

STR o rettilineità e LIN linearità rappresentano il rapporto (espresso in %) dei parametri di velocità:

LIN = (VSL/VCL) * 100 e SRT = (VSL/VAP)*100. Fig. 1: Sperm track

ALH o ampiezza e spostamenti laterali della testa, è calcolata dall'ampiezza dei movimenti laterali della testa dello spermatozoo durante un percorso liscio.

BCF frequenza dei battiti, che è la frequenza alla quale la testa dello spermatozoo attraversa un percorso medio del spermatozoo ed è espressa in Hertz (Verstegen e al., 2002).

Quindi la motilità progressiva è determinata da livelli soglia di VAP (50μm/s) e STR (75%).

Per analizzare un campione con il metodo CASA il seme fresco deve essere diluto, infatti alte concentrazioni possono interferire con la valutazione della motilità falsando il risultato. Il diluitore consigliato è a base di latte scremato o semplice soluzione salina; nessun diluitore è simile ai fluidi che gli spermatozoi troveranno nelle vie genitali femminili, in termini di viscosità e di ioni o molecole bioattive si cerca il diluitore che si avvicina di più (Amann and Waberski, 2014). Il seme congelato viene diluito per la conservazione con diluitore a basa di tuorlo d'uovo, questo rende più difficile l'analisi perché le gocce di tuorlo spesso sono contate come cellule non-mobili. L'illuminazione della macchina è importante e deve essere standardizzata, come lo spessore del campione, che non deve essere ne troppo spesso, altrimenti gli spermatozoi compiono movimenti eccessivi, ne poco spesso altrimenti gli spermatozoi non possono muoversi bene. Per avere uno spessore adeguato si deve usare 10-12 μl per 22 mm2 _{e fare molta} attenzione quando si pone il vetrino coprioggetti. In commercio esistono numerose camere progettate appositamente per l'analisi con il CASA garantendo lo spessore adeguato come Leja®, Cell-VU®, MicroCell® e Cell Vision®.

Nonostante l'automazione dell'analisi, si deve porre attenzione nella programmazione e nella validazione della regolazione; facendo in modo che il software segua solo gli spermatozoi e non le cellule non mobili, dopo la visualizzazione l'operatore esperto può fare degli aggiustamenti (McKinnon, 2011).

3.2.2 Valutazione della Morfologia

Le strutture principali che compongono lo spermatozoo sono: la testa con l'acrosoma, la coda o flagello.

La testa nella maggior parte dei casi è di forma ovale, appiattita e contiene cromatina altamente condensata, composta da DNA. Il corredo cromosomico è di tipo aploide derivante dalla divisione meiotica durante la spermiogenesi.

L'acrosoma si trova nella parte apicale della testa, è composto da una sottile membrana a doppio strato derivante dall'apparato di Golgi, si forma nella fase finale della spermiogenesi. Questa specie di cappuccio contiene molti enzimi tra cui ialuronidasi, acrosina e altri enzimi idrolitici che sono coinvolti nella fecondazione. La parte equatoriale dell'acrosoma è molto importante, è infatti la sezione che insieme al post-acrosoma si fonde con la membrana dell'oocita durante la fertilizzazione.

La coda è a sua volta divisa in collo, parte centrale, parte principale e parte finale (Fig.2). Il collo funge da connessione tra nucleo e resto del flagello, contiene i residui citoplasmatici dello spermatide. All'interno del collo troviamo un centriolo in posizione

Fig. 2: Strutture principali di spermatozoi delle principali specie allevate (Anatomy and Physiology of Farm Animals,

trasversale rispetto all'asse di simmetria dello spermatozoo, chiamato centriolo prossimale, e una placca basale di materiale denso dove si ancorano 9 colonne segmentate fibrose a costituzione proteica che si continuano per tutta la coda. Il tratto intermedio è costituito dalle 9 colonne segmentate che circondano il flagello interno costituito dalla tipica struttura microtubulare 9 + 2 (9 coppie esterne di microtubuli e 2 microtubuli centrali). Nel tratto intermedio troviamo la guaina mitocondriale, costituita da molteplici mitocondri che si pongono tra la membrana plasmatica e le nove colonne fibrose a formare un rivestimento che fornisce energia per il movimento dello spermatozoo; il tratto intermedio termina con una struttura proteica ad anello chiamata annulus. Il tratto principale è caratterizzato dall'assone rivestito dalle fibre striate che forniscono stabilità agli elementi contrattili della coda. Il tratto terminale che è costituito dalla sola struttura microtubulare, l'assone, rivestita dalla membrana plasmatica; l'assone è la struttura responsabile della motilità dello spermatozoo (Hafez e Hafez, 2000).

3.2.2.1 Metodi di Valutazione della Morfologia

Gli spermatozoi sono traslucidi e quindi invisibili alla luce del microscopio tal quali, è necessario per cui procedere preventivamente alla loro colorazione diretta o colorazione dello sfondo. Per esempio con colorazione Rosa Bengala si vedono rosa con sfondo chiaro; colorazione India prevede la colorazione dello sfondo e gli spermatozoi non si colorano e rimangono bianchi; la colorazione live-dead si effettua con nigrosina o anilina blu per colorare lo sfondo e eosina per colorare gli spermatozoi danneggiati, le cellule non vitali o danneggiate si colorano di rosa mentre le vitali respingono la eosina e appaiono bianche (Youngquist e Threlafall, 2007).

Il campione per essere valutato deve essere opportunamente processato; 5 ml di sperma vengono fissati in 10 ml di tampone cacodilato al 6% e gluteraldeide. A questo punto viene centrifugato e prelevato il surnatante, il pellet residuo viene sospeso in 0,1 M di tampone sodio cacodilato. A 100 μl di sospensione viene aggiunta un millilitro di acqua distillata. Viene allestito un vetrino posizionando una goccia di questa sospensione e coperta con vetrino coprioggetti, questo viene utilizzato per visualizzazioni al

microscopio a contrasto interferenziale (Nomarsky). Un'altra tecnica prevede lo striscio di una goccia di sospensione su vetrino che poi viene asciugato a 80°C e colorato con blu di Toluidina, questo viene osservato al microscopia in campo chiaro.

Microscopio ottico deve possedere un sistema ottico apocromatico1_{, obiettivo con lenti a} contrasto di fase, un condensatore universale che unisce campo chiaro, contrasto di fase e differenti interferenze. Il microscopio può essere interfacciano con un analizzatore di immagini (ImagePro-Plus) che rende l'analisi della morfologia più facile, vengono osservati 100 spermatozoi e le anormalità classificate; si possono dividere per tipo di anormalità in modo da valutare l'origine e l'entità di queste, ma nella routine si procede classificando come normali o anomali.

Microscopio a trasmissione elettrica il campione per microscopia deve essere colorato con acetato di uranile e citrato di piombo, in questo modo possono essere valutati lesioni agli organelli interni dello spermatozoo, come per esempio: sottili lesioni alla membrana plasmatica, inclusioni anomale nell'acrosoma e gocce citoplasmatiche, queste ultime per esempio al microscopio ottico possono sembrare solo citoplasma e invece possono contenere microtubuli. Possono essere individuate anche altri tipi di cellule come leucociti, macrofagi o cellule batteriche (McKinnon, 2011).

La valutazione con questi metodi però risente molto dell'esperienza del tecnico che la effettua, per cui negli anni sono stati studiati, come per gli altri parametri, metodi più oggettivi e affidabili per l'analisi morfologica.

Ad oggi la lo studio morfologico con computer-assisted CASA è il metodo più oggettivo, che permette di visualizzare anomalie che in precedenza non venivano osservate. L'analisi con il CASA si divide in tre step:

1. preparazione del campione con specifici lavaggi, fissazione e colorazione, 2. acquisizione dell'immagine e osservata con microscopia in campo chiaro, 3. elaborazione dell'immagini e loro analisi.

Il sistema automatico deve è programmato a riconoscere le immagini in base a parametri tecnici, basati su esperienza e risultati di ricerche specifiche, che sono stati 1 Per sistema apocromatico s'intende un sistema ottico in grado di mettere a fuoco nello stesso punto la luce di tre diverse lunghezze d'onda. E presenta aberrazioni cromatiche in misura estremamente ridotta.

caricati in fase di progettazione. Per esempio nell'uomo esistono più di 70 varianti individuate e numerosi criteri di classificazione.

Tuttavia anche se il metodo risulta essere più attendibile e meno soggettivo rispetto al metodo manuale, non si riesce ancora a elimare la soggettività e la variabilità, neanche per la specie umana che è la più studiata (Verstegen et al., 2002).

3.2.3 Anormalità

Nella maggior parte delle specie, le anormalità sono associate a subfertilità. Per esempio le anomalie della testa non permettono la risalita delle vie genitali femminili, cervice e muco cervicale infatti fungono da barriera selettiva per gli spermatozoi in bestiame e anche nell'uomo (McKinnon, 2011). Nella fattrice invece sembra che questa funzione sia svolta dalle giunzioni utero-tube, quindi anche se i dati scientifici sono pochi si ritiene che anche per la valutazione del seme di stallone la morfologia rappresenta un valore importante, anche per individuare problemi durante la spermiogenesi, infiammazioni agli organi genitali, shock da caldo, ecc. (Dresdener and Katz, 1981). L'origine delle anomalie ha numerose cause, in generale sono collegate al calore, per esempio nei toro un incremento di 0,5°- 1° C a livello del testicolo, persistente per pochi giorni, è sufficiente a causare un danno alla spematogenesi; il calore aumenta l'attività metabolica senza un corrispondente incremento di ossigeno, ne consegue un danno ai tessuti da ipossia. Oltre al danno da calore, altri stress che generano anomalie sono dovuti a cause genetiche, sostanze tossiche e deficiente nutrizionali (Youngquist e Threlafall, 2007).

Esistono molte anomalie degli spermatozoi, in base al ruolo che svolgono nella fertilizzazione si possono classificare in maggiori, quelle che giocano un ruolo fondamentale, o minori, quelle che non sono essenziali. In base al sito della loro origine, le anomali possono essere anche classificate in primarie quelle che hanno origine durante la spermiogenesi e secondarie quelle che avvengono dopo quando si trovano negli organi annessi; primarie e secondarie non indicano la gravità dell'aberrazione. Il singolo spermatozoo non ha quasi mai una sola anomalia, ma contemporaneamente più di una, quando andiamo a valutare l'incidenza di anormalità individuali, si contano tutti i difetti anche se sullo stesso spermatozoi, invece quando

contiamo il numero di spermatozoi anormali in un eiaculato, verrà considerato una volta sola (Youngquist e Threlafall, 2007). Il successo della fertilizzazione è dovuto a un adeguato numero di spermatozoi che raggiungono l'oocita, infatti anche se uno solo compie la fecondazione, tutti concorrono a farla avvenire. Per permettere ciò sono essenziali la parte centrale e principale del flagello, la membrana plasmatica, l' acrosoma e il nucleo (Mckinno,2011). Quindi con il test della morfologia andremo a vedere che queste parti siano presenti, siano bene sviluppate e integre. Per esempio l'integrità della membrana acrosomiale si può valutare solo con microscopio a fluorescenza utilizzando un fluorocromo (fluoresceina isiotiocianato) legato ad una lectina (Pisum sativum agglutinin - PSA), quest’ultima si andrà a legare agli oligosaccaridi presenti nella matrice acrosomiale che sono maggiormente rappresentati nella zona apicale dell’acrosoma; al microscopio a fluorescenza l’acrosoma integro apparirà verde brillante (Farlin et al., 1992).

3.2.3.1 Principali anomalie

3.2.3.2 Differenze di specie

Toro:

Gli autori ritengono che quando si supera il 20% di spermatozoi anormali, si assiste a un declino della fertilità; più precisamente per i difetti della testa la % deve rientrare tra il 15% e il 20%, per i danni all'acrosoma o alla coda la tolleranza è di 25%. Si accetta anche per la specie bovina la classificazione in primarie e secondarie; tutti i difetti della testa (acrosoma danneggiato, testa piriforme, microcefalo e vacuoli del nucleo) sono difetti primari come molti difetti della coda compreso "Dag defect", difetto della guaina mitocondriale, e coda arrotolata. Il " Dag defect" (Fig. 5) è il risultato di un anormale sviluppo dell'assone e della guaina mitocondriale. Alcuni difetti possono essere sia primari che secondari, per esempio la goccia prossimale può essere il risultato di un disturbo durante la spermiogenesi (primario) o disturbo dell'epididimo (secondario). Spermatozoi con goccia distale non sono collegati con infertilità, questo difetto non si origina ne durante la spermiogenesi ne durante il passaggio nell'epididimo, ma dipende dalla mancanza di un fattore emolitico nel fluido seminale. Alcuni difetti, come per esempio "diadema" (Fig. 6) possono essere compensati dall'uso di dosi con concentrazioni più elevate di spermatozoi, altri difetti come goccia prossimale non possono essere compensati.

Verro:

Nel verro il 15-20% degli spermatozoi anormali è da considerarsi non patologico. La maggior parte delle anomalie le troviamo quando gli animali sono sottoposti a stress da caldo (Cameron e Blackshaw, 1980).

Stallone:

Per quanto riguarda lo stallone la percentuale di spermatozoi normali è simile alla percentuale della mobilità progressiva, quindi se troviamo motilità bassa e alta percentuale di spermatozoi normali, possiamo ipotizzare un errore del laboratorio. Da uno studio su 168 stalloni e 531 eiaculati sono state rinvenute le seguenti anomalie a partire dalla più frequentemente riscontrata: eccentricità della porzione centrale; anormalità della coda, goccia prossimale; anormalità della testa; goccia prossimale; testa distaccata; anormalità della porzione centrale (Dowsett e Knott, 1996).

Montone:

Per quanto riguarda il montone c'è una correlazione positiva tra motilità e % di spermatozoi normali. Tutti gli eiaculati contengono alcune anormalità, tuttavia quando abbiamo più del 20% di anormalità la fertilità decresce, nel caso di valutazione del

Fig. 4: Goccia citoplasmatica Fig. 5: "Dag" Defect Fig. 6: Diadem Defect

maschio per l' inseminazione artificiale, questo viene scartato con seme con più del 15% di anormalità. Si è visto che la % di anormalità negli ovini è influenzata dalla stagione; durante la primavera si riscontrano maggiori anormalità che declinano quando la stagione riproduttiva avanza (Hafez and Hafez, 2000).

I difetti più comuni sono: distacco della testa, questo può essere transitorio quando causato da stress da caldo o da congelamento, o permanente in caso di infezione da Brucella ovis; difetti dell'acrosoma che hanno un maggiore impatto sulla fertilità; difetti citoplasmatici, gocce citoplasmatiche posizionate prossimalmente o distalmente nella porzione centrale, quelle prossimali sono correlate con immaturità; difetti del flagello, per esempio se con coda piegata su se stesso, lo spermatozoo nuoterà indietro (Youngquist e Threlfall, 2007).

Alcuni autori sostengono che alcuni microelementi giocano un importante ruolo nello sviluppo e nella maturazione di certi componenti del flagello (Barth e Oko, 1989).

Ariete:

Nella specie caprina una quantità fino al 20% di anomalie non si considera correlata con l'infertilità. Alcune anomalie riscontrate più frequentemente sono primarie: testa deforme; acrosoma anormale; anomalie della porzione centrale; anomalie della porzione principale fratture del collo; gocce plasmatiche prossimali. Secondarie: gocce citoplasmatiche distali; porzione principale della coda piegata; distacco della testa (Youngquist e Threlfall, 2007).

3.2.4 Test della funzionalità; HOSST e BCMPT

3.2.4.1 Hos-Test

Come già citato l'integrità della membrana e la sua attività biochimica sono essenziali per la fertilizzazione dell'oocita con successo, per cui sono stati messi a punto vari metodi per valutare questa funzionalità; uno dei più usati è l' Hypoosmotic Swelling Test (Hos-Test) come riportano Neild e altri, l' Hos-Test è semplice attendibile e meno suscettibile ai danni immediati da shock da freddo e si può fare una valutazione singola degli spermatozoi (Neild e al.,1998). La prova si basa sull'osservazione di spermatozoi posti in una soluzione ipoosmotica, l'acqua attraversa la membrana ed entra nella cellula per ristabilire l'equilibrio, lo spermatozoo aumenterà di volume e la membrana della coda si espanderà, il flagello si arrotolerà su se stesso. L'osmolalità è sufficiente per avere questo effetto senza provocare lisi. Il test è stato da prima messo a punto per l'uomo e in seguito sono state sviluppate opportune soluzioni iposmotiche anche per la specie bovina, equina, ovina, suina e canina. Il test viene utilizzato per valutare il seme

Fig. 4: Alcuni spermatozoi incubati in una soluzione ipoosmotica, l'HOST (+) mostra il flagello dello spermatozoo rigonfio e

arricciato. Scala = 5

(μmhttp://humrep.oxfordjournals.org/content/15/4/853/F1.expansi on.html).

e predire la sua fertilià sia su seme congelato che su seme fresco (Rota e al., 1999). Protocollo Hos-Test per Toro:

Si utilizza una soluzione di fruttosio, ma possono essere utilizzati anche altri zuccheri come saccarosio e lattosio, e citrato di sodio 1:1 in acqua distillata con osmolalità 100 mOsm/l.

 125 μl del campione di sperma vengono lavati con sperm-TALP medium (supplemento 6mg/ml BSA 110 μg/ml piruvato) e centrifugati a 250 g per 5 minuti.

 25 μl vengono prelevati e sospesi con 250 μl di soluzione HOS, incubato a 37°C per 5 minuti. Le cellule vive dopo incubazione si rigonfieranno e i flagelli si avvolgono, mentre gli spermatozoi morti o con membrana danneggiata non rispondono al test.

 10 μl vengono messi emocitometro BuKer e 200 spermatozoi che sono osservati al microscopio ottico (400x). Gli spermatozoi vengono classificati positivi se hanno la coda arrotolata o negativi in caso contrario (Rota et al., 1999).

Studi specifici per Hos-Test su seme equino hanno evidenziato che non ci sono differenze tra i tre zuccheri maggiormente usati (fruttosio; saccarosio e lattosio) e che le osmolalità che danno rigonfiamenti migliori sono 100, 50 e 25 mOsm/l (Neild et al.,1998).

3.2.4.2 BCMPT bovine cervical mucus penetration test

Questo test è risultato un metodo significativo per una valutazione più completa della capacità fertilizzante del seme (Kell et al., 1987) nella specie umana, in quella bovina e equina (Becher et al, 2013). Il test consiste nell'allestimento di tubi capillari, ne esistono di vario tipo e composizione: per ematocrito di forma circolare (8 mm di diametro); capillari piatti che permettono di osservare meglio le cellule perché esenti da curvature, allo stesso tempo i tubi circolari vengono riempiti con meno difficoltà e necessitano di un campione di seme ridotto, per questo vengono preferiti a quelli di tipo piatto (Becher

et al, 2013). I tubicini vengono riempiti con muco prelevato dalla cervice uterina di bovine in estro, dopodiché questi vengono immersi verticalmente in una soluzione di 0,5 ml di campione di seme (prova in doppio) dopo 60 min di incubazione a 37°C i tubi vengono lavati, asciugati e posti su vetrini graduati; osservati al microscopio (40x). Viene osservata la distanza in millimetri percorsa dagli spermatozoi, misurata dal punto di apertura del capillare fino al punto più lontano contenente una cellula mobile, vengono classificati:  Eccellenti > 30mm;  Buoni > 20mm < 30mm;  Medi >12mm < 20mm;  Scarsi < 12mm. (Srivastava e Kumar, 2014).

3.2.5 Attività enzimatica principale: fosfatasi alcalina; acido fosfatasi; GOT e GPT.

L'attività enzimatica viene valutata tramite kit diagnostici commerciali.

Le fosfatasi sono un gruppo di enzimi idrolasi che catalizzano la rimozione di gruppi fosfato; i catalizzatori della defosforilazione, in base all'ambiente in cui operano si distinguono in alcalini e acidi.

L'importanza dell'attività della fosfatasi alcalina (ALP) è stata ritrovata in numerose specie, nelle specie come nello stallone, dove la maggior parte della ALP deriva da testicolo e epididimo il dosaggio di questa può essere usato come marker di azoospermia o oligospermia (Turner e McDonnell, 2003).

La glutammato-ossalacetato transaminasi GOT e la glutammato-piruvato transaminasi sono due enzimi appartenenti alla classe delle transferasi deputate al catalizzare il trasferimento dei gruppi amminico α da un amminoacido a un α-chetoacido. Secondo alcuni autori l'attività di questi due enzimi sono correlate positivamente con motilità, concentrazione e fertilità del seme nei bovini (Khokhar et al., 1987) altri hanno dimostrato la correlazione tra l'attivita della GOT e il tasso di fertilizzazione in trota iridea (Oncorhynchus mykiss ) e coregone (Coregonus lavaretus), per la trota iridea è stata anche trovata una correlazione altamente significativa per motilità e concentrazione di

spermatozoi (Ciereszko e Dabrowski,1994).

3.2.6 Concentrazione di ATP

L'energia necessaria per la propulsione degli spermatozoi viene metabolizzata dai mitocondri del tratto medio della cellula, il flagello si muove grazie all'idrolisi dell' ATP in ADP, per questo la concentrazione di adenosin trifosfato nel seme può essere correlata positivamente al numero e alla motilità e potrebbe essere usata come metodo di stima della vitalità, anche se non tutti gli autori sono concordi (Sigh et al., 2012).

3.3 Danno da ossidazione e sistemi antiossidanti

Le reazioni di ossidazione consistono nel trasferimento di elettroni da una sostanza donatrice riducente a un'altra accettatrice ossidante, sono fondamentali per la vita, ma possono essere altrettanto dannose agli organismi viventi, durante le ossidazioni si possono produrre radicali liberi, responsabili dell'avvio di una reazione a catena che danneggia le cellule, perciò intervengono gli antiossidanti che si fanno ossidare e quindi impediscono altre reazioni ed intervengono sui radicali intermedi. Sono definiti

antiossidanti le sostanze chimiche o agenti fisici che rallentano o prevengono

l'ossidazione di altre sostanze, chimicamente sono agenti riducenti. Mentre le sostanze

pro-ossidanti inducono stress ossidativo, creando specie reattive all'ossigeno o inibendo

sistemi antiossidanti. L'eccesso di stress ossidativo può danneggiare le cellule e i tessuti. Alcune sostanze possono agire sia da antiossidante che da pro-ossidante a seconda di alcune condizioni: tra cui la concentrazione della sostanza chimica, la presenza di ossigeno o metalli di transizione. Per esempio sono pro-ossidanti il ferro e il rame ad alte concentrazioni e l'acido urico.

3.3.1 La perossidazione lipidica nel seme

La periossidazione lipica è dovuta all'azione dei radicali liberi contenenti ossigeno molecolare con carenza di un elettrone, i lipidi contenenti ac. grassi insaturi e i loro esteri vengono direttamente ossidati dall'ossigeno molecolare. Per attivare questo processo basta l'esposizione alla luce, al calore o all'ossigeno. Data la composizione degli spermatozoi altamente ricca di acidi grassi polinsaturi, questi sono facilmente soggetti alla perossidazione, questo è stato evidenziato dalle numerose pubblicazioni dei ricercatori Jones e Mann, che a partire dagli anni '70, hanno studiato a lungo l'effetto del'ossidazione sullo sperma (Jones e Mann, 1973), (Jones e Mann, 1976), (Jones e Mann, 1977a), (Jones e Mann, 1977b), (Jones et al., 1978), (Jones et al., 1979). Dalle loro ricerche è emerso che la perossidazione lipidica ha luogo negli spermatozoi di tutti i mammiferi, dove è causa del declino della motilità, danneggia irreversibilmente l'attività respiratoria dei gameti maschili e incrementa il rilascio di enzimi intracellulari. Hanno dimostrato in vitro che la perossidazione è la maggiore causa biologica di invecchiamento dello sperma e in fine che gli acidi grassi maggiormente ossidati sono l'acido docosaesaenoico 22:6n-3 e acido arachidonico 20:4n-6.

Per la maggior parte degli organismi sia animali che vegetali sopravvivere senza ossigeno sarebbe impossibile; tuttavia l'alta concentrazione di ossigeno nell'atmosfera espone in continuazione gli organismi a fenomeni ossidativi con produzione di radicali liberi dannosi, il danno apportato da questi dipende dalla loro produzione e dal sistema antiossidante. I radicali liberi sono prodotti normalmente dalle attività metaboliche e fanno parte del sistema immunitario per distruggere i microganismi invasori, è stato calcolato che si formano 2x1010 _{molecole di radicali reattivi all'ossigeno (ROS}2_{) per} cellula al giorno, durante situazioni stressanti la produzione aumenta (Surai et al., 2006). Un' eccessiva produzione di ROS danneggia l'apparato contrattile del flagello e riduce l'utilizzazione dell'ATP, ma ci sono delle evidenze che indicano che un livello basso di ROS è coinvolto nella regolazione di alcune funzioni dei gameti maschili; alcuni ricercatori hanno visto che essi sono coinvolti nella capacitazione degli spermatozoi di 2 ROS, specie reattive all'ossigeno sono i principali radicali liberi maggiormente diffusi e sono il

verro, inducono iperattivazione, fuzione con l'oocita e rilascio dell'acrosoma (Surai e Fisinin, 2015).

3.3.2

Sistema antiossidante

I radicali liberi attaccano costantemente l'organismo, per questo motivo durante l'evoluzione gli organismi hanno sviluppato un efficiente sistema antiossidante. Gli antiossidanti naturali sono presenti negli organelli cellulari, nei compartimenti sub-cellulari e negli spazi extrasub-cellulari. Il sistema di protezione antiossidante comprende: antiossidanti naturali liposolubili (vit. A, vit. E, carotenoidi ecc); naturali idrosolubili (ac. ascorbico, ac. urico, taurina ecc); enzimi (glutatione perossidasi GSH-px; catalasi CAT; superossido dismutasi SOD); sistema tierodossina e glutatione. Il sistema antiossidante delle cellule è basato su tre livelli: 1) attività di CAT, GSH-px, SOD e metallo-proteine, questo primo livello funge da prevenzione e controllo; 2) interruzione della catena ossidativa, limitazione della formazione e della sua propagazione; 3) attività degli enzimi che riparano o rimuovono il danno cellulare (Surai e al., 2006). Si distinguono tre distinte isoforme di super ossido dismutasi SOD, e la SOD1 detta anche Cu, Zn-SOD che è stato il primo enzima della famiglia ad essere caratterizzato; contiene appunto, zinco e rame e si ritrova esclusivamente nel citoplasma; e SOD3 esxtracellulare. La SOD catalizza la reazione:

2O2 + 2H+ __________SOD__________> H2O2 + O2

Il perossido di idrogeno formato viene detossificato dalla GSH-Px o dalla CAT e ridotto a acqua:

H2O2 + 2GSH____________GHS-PX__________> GSSG + 2H2O 2 H2O2____________CAT__________> 2H2O + O2

Questo primo livello di difesa trasforma sostanze molto reattive all'ossigeno con altre meno reattive; sfortunatamente questo non è sufficiente a prevenire completamente la formazione di radicali liberi, e alcuni scampano a questo controllo e provocano la perossidazione dei lipidi e danno al DNA. Il secondo livello di difesa consiste nella interruzione della reazione a catena antiossidante operata da vit. E, ubichinolo,

carotenoidi, vit.A, acido ascorbico, acido urico e altri antiossidanti. Nel secondo livello interviene anche il sistema glutatione tiredossina, questi vanno ad interrompere le reazioni ossidative a catena rimuovendo i radicali intermedi. Anche questo livello non è in grado di proteggere completamente dal danno lipidi, proteine e DNA. Il terzo livello è basato su un sistema che elimina il danno molecolare e lo ripara, sono inclusi in questa fase enzimi lipolitici, proteolitici, ligasi, nucleasi, polimerasi e numerosi altri enzimi (Surai e Fisinin, 2015).

La difesa dal danno ossidativo è molto importante anche per il seme congelato, perché durante la manipolazione e processazione del materiale seminale si ha un incremento della produzione di ROS, l'aggiunta di Se protegge e aumenta la resistenza al congelamento. L'aumento della capacità antiossidante nel materiale seminale, tramite l'integrazione alimentare, attualmente rappresenta la maggiore opportunità per migliorare la ferilità maschile, ed è una ottima chance per l'industria mangimistica (Surai e Fisinin, 2015).

Per misurare la capacità antiossidante del plasma seminale si può ricorrere a utilizzare un metodo di analisi che viene utilizzato per il plasma sanguigno umano ed è stato validato per il seme. Un' aliquota di seme congelato viene scongelato per 15' a 37°C a bagno maria, e viene analizzato con un analizzatore automatico Olympus AU 400 con kit Randox Total Antioxidant Status, questa procedura si basa sull'abilità delle sostanze antiossidanti presenti nei liquidi biologici di reprimere la produzione del catione cromogeno ABTS®+3_{. Il perossido di idrogeno agisce sulla metamioglobina generando} il radicale ferromioglobina che interagisce con ABTS® formando il catione ABTS+_, questo ha un colore relativamente stabile blu-verde rilevabile a 600nm (Contri e al., 2011).

3.3.3 La glutatione perossidasi nel seme

La glutatione perossidasi (GSH-Px) catalizza la riduzione del perossido di idrogeno e perossidi organici compresi quelli dei fosfolipidi, quindi gioca un ruolo importante nella protezione delle membrane lipidiche dalla perossidazione e mantiene l'integrita delle cellule. Per queste sue caratteristiche è considerato il principale enzima antiossidante 3 2,2'-Azino-[-3-ethylbenzthiazoline suphonate]+

presente nel liquido spermatico (Walczak-Jedrzejowska, 2013). É stato dimostrato che rimuove i perossidi e protegge le cellule contro i danni causati dai radicali liberi e dai prodotti della perossidazione lipidica in vivo (Surai e Fisinin, 2015). Nei mammiferi sono stati caratterizzate otto forme di GSH-Px, cinque di queste contengono nel loro sito attivo selenio, ma tutte provvedono alla funzione antiossidante nei vari tipi di tessuti; negli spermatozoi si ritrova soprattuto nella matrice mitocondriale, ma è stata trovata anche una forma nucleare che protegge il DNA dal danno ossidativo e partecipa al processo di condensazione della cromatina. La presenza di GSH-PX è stata dimostrata anche nel plasma seminale, suggerendo la sua origine dalla prostata (Walczak-Jedrzejowska, 2013). Una forma specifica di GSH-Px, utilizza come substrato la fosfatidilcolina PH-GSH-Px, è selenio dipendente ed è espressa in elevate quantità nei testicoli, anche se si ritrova in tutti i tessuti, è importante per la spermatogenesi e la funzionalità dei gameti, viene regolata dall'azione delle gonadotropine. Nei testicoli l'attività di questo enzima è collegato ai mitocondri di cellule in fase di differenziazione in spematozoi (Guerriero et al., 2014). La PH-GSH-Px può essere convertita a opera di una polimerasi in una proteina strutturale, che è stata identificata come una dei maggiori costituenti del materiale, simile alla cheratina, dove è incorporata la spirale mitocondriale degli spermatozoi, infatti la non espressione della proteina è considerata causa di infertilità e oligospermia (Surai e Fisinin, 2015).

4 Integrazione alimentare

4.1 I Minerali

Il 3,5-4,5% dell'organismo di un essere vivente è composto da sostanza inorganica: le ceneri costituite dai sali degli elementi minerali. I minerali si possono classificare in base alla loro presenza all'interno dell'organismo in macroelementi o macrominerali quelli presenti in quantità maggiori (grammi) e sono calcio, fosforo, potassio, sodio, cloro, zolfo, magnesio; hanno funzioni strutturali, tessuto osseo e altri tessuti e fluidi, svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio acido-base, della pressione osmotica, potenziale elettrico di membrana e trasmissione nervosa. I

microelementi o oligoelementi presenti in piccolissime quantità (milligrammi o

microgrammi) sono ferro, rame, manganese, zinco, cobalto, iodio, selenio e molibdeno; anche se presenti in concentrazioni bassissime questi elementi vanno a costituire spesso metallo-enzimi, cofattori e componenti di ormoni (NRC, 2001). Gli elementi inorganici sono sempre legati a molecole organiche complesse, quali gli enzimi, gli ormoni e i pigmenti respiratori. L'insufficiente presenza di questi elementi può provocare patologie o riduzione delle produzioni; anche il mancato rispetto dei rapporti tra le parti può essere causa di disequilibri alimentari. In letteratura vengono citati fenomeni di antagonismo (calcio/magnesio) di sinergia (ferro/rame) oppure di interazione tra oligoelementi e vitamine come nel caso del selenio e della vitamina E; tali rapporti sono molto complessi e perciò dobbiamo attribuire fondamentale importanza ai minerali nella formulazione della razione (Cevolani, 2005). I quantitativi presenti in foraggi, cereali e concentrati non sempre sono noti e anche quando lo sono, non corrispondono mai al quantitativo che arriverà all'animale, ricorreremo perciò a coefficienti di assorbimento. Gli stati carenziali nei nostri animali, si hanno per un numero limitato di minerali, più frequentemente di calcio, fosforo, sodio, cloro, magnesio, più raramente ferro, rame, cobalto, zinco, manganese, iodio, selenio; mentre non si è mai osservata per potassio e lo zolfo. Sebbene tutti i minerali concorrono a mantenere in salute l'animale, è quindi essenziale fornire razioni bilanciate che apportino le giuste dosi. Noi analizzeremo solo