Le cellule T maturano nel timo, esprimono il recettore delle cellule T (TCR) e possono esprimere la glicoproteina di superficie CD4, sono allora chiamate cellule CD4+ (cellule T helper), o la glicoprotiena di CD8 e sono allora chiamte cellule CD8+ (cellule citotossiche). Anche se l’eziologia dell’AIG è scarsamente conosciuta [7], sicuramente le cellule T sono coinvolte nella patogenesi della malattia come è suggerito dalla predominanza di cellule T CD4+ negli infiltrati sinoviali [7]. 1. Linfociti T CD4+ helper
In seguito alla presentazione dell'antigene le cellule T CD4+ si attivano, aumentano in numero e possono differenziarsi in cellule effettrici che migrano nel tessuto sede del processo infiammatorio o in cellule della memoria. Fra queste si distinguono le cellule della memoria centrali (TCM),
localizzate negli organi linfoidi secondari e le cellule della memoria effettrici (TEM) che si trovano
nei tessuti sede dell'infiammazione. In caso di una nuova esposizione all'antigene le cellule della memoria si espandono rapidamente e rispondono in modo più efficace all'antigene. A seconda delle citochine a cui sono esposte le cellule T CD4+ naïve si differenziano inoltre in diversi sottotipi: Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, cellule regolatorie (Treg), cellule follicolari (Thf) (Fig.4)[92].
Fig.4: Sottopopolazioni T CD4+. Le diverse sottopopolazioni CD4+ derivano dalle cellule T naïve tramite l’azione di differenti citochine. TN: T naïve; Th:T helper; T reg: T regolatorie; Tfh:T follicolari Th1 Th22 Th9 Th17 Th2 Treg Tfh TN Cellula CD4+ Naïve , IFN-γ, TNF IL-4,IL-5, IL-13 IL-9 IL-17,IL-21,IL-22,IL-25,IL-26 IL-22 IL10, TGF-β IL-21
31 Cellule Th1, Th2, Th17
Sono coinvolte nella protezione da patogeni e si distinguono sulla base del tipo di citochina prodotta. Le cellule T helper di tipo 1 (Th1) secernono prevalentemente IFNγ, esprimono il fattore di tracrizione T-bet, e proteggono l’ospite contro agenti intracellulari; le cellule Th2, che secernono IL4, IL5, IL9 e IL13, esprimono il fattore di trascrizione GATA-3 e sono importanti nell'immunità umorale, nella protezione dalle infezioni da elminti e svolgono un ruolo centrale nella patogenesi di molte malattie infiammatorie allergiche e le cellule Th17, che esprimono il fattore di trascrizione ROR-γt, producono IL-17A, IL-17F e IL22, proteggono contro agenti extracellulari e infezioni fungine [92,93]. Oltre a questa funzione le cellule Th17 hanno dimostrato essere importanti nella patogenesi di diverse malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla, le malattie infiammatorie croniche intestinali, la psoriasi, la AR e la AIG [94]. Originariamente le malattie autoimmuni erano state associate con un fenotipo Th1. Dopo la scoperta delle cellule Th17, molti autori hanno focalizzato il proprio interesse su questo sottotipo di cellule e sul loro ruolo nelle patologie infiammatorie e autoimmuni [93]. Attualmente il dibattito sulle cellule Th1 e Th17 risulta ancora aperto. Sembra che un ruolo particolarmente importante sia rivestito da una particolare popolazione di cellule Th1. Nel linquido sinoviale di pazienti con AIG oligoarticolare è stato riscontrato, rispetto al sangue periferico, un aumento di una specifica popolazione di linfociti Th1. Si tratta di cellule T CD4+CD161+ appartenenti ai sottotipi Th1 e Th17/Th1 e Th1 non classiche mentre sono rare le cellule Th17 [95]. In presenza di citochine locali infiammatorie come IL12 e TNFα, le cellule Th17 acquiscono la capacità di produrre IFNγ. In questo primo stadio mostrano un fenotipo intermedio conosciuto come Th17/Th1 e producono sia IFNγ che IL17, ma possono anche perdere rapidamente la capacità di produrre IL17 e divenire produttori solo di IFN γ. Queste cellule Th1-derivate da cellule Th17 sono definite cellule Th1 non classiche perchè, a differenze delle cellule Th1, mantengono l’espressione di ROR-γT, CD161 e CCR6, tipiche molecole del sottotipo Th17 (Figura 4). E’ stata descritta una correlazione positiva fra la frequenza delle cellule CD4+CD161+Th17/Th1 nel liquido sinoviale delle articolazioni infiammate e i paramentri di
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attività di malattia [95]. Lo shift delle cellule Th17 verso il fenotipo Th1 non classico è guidato dall’IL12 che è stata riscontrata aumentata nel liquido sinoviale dei pazienti con oligoartrite [95,96]. Questi dati sulla plasticità delle cellule Th17, risolvono parzialmente il dibattito presente nella letteratura sul ruolo patogenico o protettivo delle cellule Th17 nei disordini immunomediati [97] e supportano l’ipotesi che, almeno nella AIG, il subset Th1, sia classico che non classico, sia direttamente coinvolto nelle fase attive della malattia, quando sono evidenti le manifestazioni clinche e che le cellule Th17 acquisiscano caratteristiche patogenetiche quando iniziano a produrre IFNγ e assumono fenotipo Th17/Th1 e Th1 non classico. Tuttavia, non può essere escluso, che anche le cellule Th17, possano giocare un ruolo nella patogenesi della AIG all’esordio o durante le fasi precoci della malattia [97,98].
Fig. 5: Somiglianze e differenze fra cellule Th1 e Th17. Sia le cellule Th1 classiche che non classiche
producono IFNγ, esprimono i fattori di trascrizione T-bet e Eomes e il marker di superficie CXCR3. A differenza delle cellule classiche, le cellule Th1 non classiche mantengono anche l’espressione di ROR-γT, CD161 e CCR6 come tipici fattori di trascrizione e marker di superficie del fenotipoo Th17 [97]. Infatti, le cellule Th1 non classiche originano dallo shift delle cellule Th17 verso il fenotipo Th17/Th1 in presenza di IL12 e/o TNFalfa.
I fibroblasti sinoviali sono le principali cellule residenti nella sinovia ed è stato dimostrato che sono in grado di produrre citochine ed enzimi in grado di degradare le matrice, promuovere la distruzione
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della cartilagine e mediare l’infiammazione. Le citochine prodotte dalle cellule T, in particolare IFN γ e TNF α, attivano I fibroblasti sinoviali [99]. E’ stato dimostrato in vitro che IL17A e TNFα da soli sono in grado di indurre l’espressione di IL6 e di IL8, sia da parte delle cellule endoteliali che dei sinoviociti [100]. I’IL8 determina il reclutamento dei neutrofili mentre l’IL6 è coinvolta nella differenziazione e nella espansione delle cellule Th17, nella produzione del VEGF, nella produzione di anticorpi e nella attivazione degli osteoclasti [99,100].
Cellule T regolatorie
Le cellule T regolatorie CD4+CD25highFOXP3+ sono un sottotipo di cellule T helper CD4+ presenti nei tessuti linfoidi e non linfoidi, e sono cruciali per mantenere la tolleranza al self, prevenire le allergie e controllare le risposte immuni dopo le infezioni. Esse possono svilupparsi nel timo o essere indotte in periferia e manifestano un meccanismo d’azione contatto dipendente e indipendente [101]. E’ stato visto che mutazioni inattivanti il recettore FOXP3 possono essere causa di malattie autoimmuni multiorgano come la sindrome IPEX (Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX) syndrome) [102]. Nei pazienti con AIG è stato osservato che le cellule T regolatorie nei siti infiammatori presentano: un repertorio ristretto del recettore TCR (T cell receptor)[103], instabilità del FOXP3 e del CD25[104], alterati markers di homing, alterata produzione di citochine, difetti nella produzione di chemochine, scarsa risposta a IL-2. Tutto questo a indicare una alterata funzione delle cellule T reg nell’AIG [105]. Le cellule T reg si è visto essere aumentate nei siti di infiammazione nei pazienti con AIG. E’ stato visto che cellule Treg, CD4+CD25highFoxP3+, sono presenti in numero significativamente maggiore nei pazienti con AIG oligoarticolare persistente rispetto che nei pazienti con AIG oligarticolare estesa [106]. E’ stato dimostrato che le cellule T eff della sinovia infiammata di pazienti con AIG, ma non del sangue periferico sono resistenti alla soppressione mediata dalle cellule T reg in termini di proliferazione e produzione di citochine [107].
34 Le Treg come bersaglio della terapia
Elevati livelli di TNFα nelle ginocchia in corso di artrite offrono un chiaro razionale per l’utilizzo della terapia anti-TNF [42,108]. Il TNFα può avere effetti sia positivi che negativi sulle Treg [109,110]. E' stato osservato che gli effetti negativi si riscontrano in particolare nelle articolazioni sede di flogosi [109], mentre gli effetti positivi del TNFα sui Treg sono stati riportati in vitro [108]. Il blocco del TNF alfa permette il ripristino della suscettibilità dei CD4+ e dei CD8+ all’effetto soppressivo dei Treg [111]. Il TNFalfa ha due recettori CD120a e CD120b [108]. Il CD120b media le funzioni proTreg del TNFα, compreso la proliferazione e la stabilizzazione dei Treg. E' stato osservato che bloccare il CD120a, risparmiando l'interazione CD120b-TNFα può migliorare l'artrite indotta dal collagene [112]. Tre anti-TNFalfa sono approvati per essere utilizzati nella AIG (adalimumab, etanercept, golimumab), nell’AR è inoltre approvato l’impiego di infliximab e certolizumab. Uno studio, condotto su un piccolo numero di pazienti con AR, trattati con adalimumab ha mostrato l’espansione dei Treg e la riduzione delle cellule Th17 [113]. In uno studio più recente, pazienti con AR trattati con successo con adalimumab, hanno presentato un aumento nel numero dei Treg periferici che risultavano funzionalmente efficaci [114]. Un aumento dei Treg circolanti è stato dimostrato anche nei pazienti con risposta clinica alla terapia con infliximab a differenza di quanto si verificava nei non responders e nei pazienti trattati con methotrexate [115]. IL-6 sposta l'equilibrio Treg/Th17 verso le cellule Th17 mentre è stato dimostrato che la terapia con Tocilizumab, aumenta il numero delle cellule Treg nell'AR [116, 117]. L’abatacept è risultato sicuro ed efficace nell’AIG oligo e poliarticolare. Si tratta di una proteina di fusione che contiene il dominio extracellulare dell' antigene 4 associato ai linfociti T citotossici (CTLA-4) e il frammento FC di una immunoglobulina IgG1. Il principale effetto riportato di abatacept è il blocco del secondo segnale necessario per l'attivazione delle cellule T. Abatacept infatti lega il CD80/CD86 espresso sulla superficie delle cellule dendritiche impedendo l'interazione con il CD28 espresso sui linfociti T [118]. Gli studi che hanno valutato gli effetti di abatacept sui Treg hanno fornito risulltati non univoci. Abatacept, infatti, ha determinato in pazienti con AR, una riduzione del numero dei
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linfociti Treg [118-120] pur migliorandone la funzione [120]. Una possibile spiegazione di questi risultati, può essere fornita dal fatto che se da una parte abatacept inibisce i Treg bloccando l'interazione CD80/86-CD28, dall'altra sembra promuovere la funzione dei Treg attraverso l'induzione di cellule dendritiche tollerogeniche. Studi sugli effetti delle terapie sulle cellule Treg sono riassunti nella Tabella 3.
Sono oggetto di ricerca terapie che utilizzano le Treg. E' stato visto che le Treg sono sicure ed efficaci nel ridurre l'infiammazione, indurre la tolleranza al trapianto, prevenire la malattia da rigetto del trapianto verso l'ospite (GVHD) e trattare l'autoimmunità [121]. Dal momento che, terapie che utilizzano le Treg sono complesse da attuare e costose, cercare di agire in vivo sulle Treg potrebbe essere una strategia più semplice. La terapia non cellulare più promettente si basa sull'utilizzo di basse dosi di IL2. Mentre le alte dosi di IL2 stimolano principalmente le cellule effettrici, le basse dosi spingono la risposta verso i Treg [122]. Le basse dosi di IL2 sono state utilizzate con successo nella terapia del DM1 [123], della GVHD [124], del lupus eritematoso sistemico (LES) [122]. Dalla letteratura recente sembra, tuttavia, che non sia sufficiente stimolare le Treg ma che sarebbe opportuno adottare terapie che contemporaneamente abbiano come bersaglio le cellule Teff [125].
36 Tabella 3: Effetti delle terapie sui Treg
Autore Titolo Farmaco N. pazienti
con AR
Risultati
Aravena et al.[113]
Anti-TNF therapy in patients with rheumatoid arthritis decreases Th1 and Th17 cell populations and expands IFNγ-producing NK cell and regulatory T cell subsets
Adalimumab 18 Adalimumab riduce il numero di cellule Th1, Th17 e delle cellule CD8+ e aumenta il numero delle cellule Treg e delle cellule NK produttrici di IFNγ
McGovern, et
al. [114]
Th17 cells are restrained by Treg cells via the inhibition of interleukin- 6 in patients with rheumatoid arthritis responding to anti-tumor necrosis factor antibody therapy.
Adalimumab 50
In pazienti trattati con Adalimumab si osserva una inibizione delle cellule Th17 e Th1 da parte dei Treg
Ehrenstein, et al. [115]
Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti- TNFalpha therapy.
Infliximab 27
Infliximab nei pazienti che vanno incontro a remissione determina un aumento di numero e un miglioramento della funzione dei Treg
Samson, et al. [117]
Brief report: inhibition of interleukin-6 function corrects Th17/Treg cell imbalance in patients with rheumatoid arthritis
Tocilizumab 15
Tocilizumab determina una riduzione delle cellule Th17 e un aumento dei Treg
Alvarez- Quiroga C, et al. [120]
CTLA-4-Ig therapy diminishes the frequency but enhances the function of Treg cells in patients with rheumatoid arthritis.
Abatacept 45 Abatacept riduce il numero dei Treg ma ne migliora la funzione
Cellule T helper follicolari
Le cellule T helper follicolari (Thf) sono un sottogruppo di cellule T helper che si trovano nelle zone B degli organi linfoidi secondari dove contribuiscono alla formazione dei centri germinativi (CG) e aiutano i linfociti B a produrre anticorpi contro agenti patogeni. Nei CG le cellule B si differenziano in plasmacellule e cellule B della memoria. Le Thf partecipano a questo processo stimolando la cellula B attraverso il legame fra la molecola costimolatoria CD40 sulla superficie
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della Thf e il CD40-ligando sulla superficie della cellula B e attraverso la produzione di IL21 che stimola la proliferazione linfocitaria. Le cellule Tfh sono caratterizzate dell'espressione del fattore di trascrizione Bcl6 e da numerosi markers di superficie quali CXCR5, PD1 e ICOS. La differenziazione delle cellule Thf è un processo che inizia nelle zone T degli organi linfoidi secondari. Inizialmente una cellula T CD4+ naÏve riconosce attraverso il TCR peptidi presentati dalle cellule dendritiche (CD) sul MHC di classe II. Questo insieme alle molecole costimolatorie ICOS-L e IL6, prodotte dalle CD, fornisce un secondo segnale alle cellule CD4+ che le induce ad esprimere Bcl-6 e a differenziarsi in cellule Tfh. Le cellule Thf esprimono CXCR5, ICOS e PD1 e migrano verso la zona B cellulare.
Una disregolazione delle cellule Thf è presente in una grande varietà di patologie caratterizzate da una aumentata o ridotta produzione di anticorpi [126]. Ad oggi, i dati sulle cellule follicolari nella AIG sono molto scarsi. In uno studio non è stata evidenziata alcuna differenze significativa nel numero delle Thf totali fra bambini con sindrome di Down e artrite, pazienti con AIG e controlli, anche se i bambini con sidrome di Down e artrite avevano un numero superiore del sottotipo Thf doppio positivo CXCR3+CCR6+ [127]. Gli studi condotti in pazienti con AR hanno fornito risultati non univoci. In cinque lavori è stato infatti osservato un aumento delle Thf circolanti nei pazienti rispetto ai controlli, in particolare nei casi con malattia di nuova insorgenza [128-132]. L'associazione fra aumento delle Thf e attività di malattia è dibattuta. In due studi, condotti in pazienti con AR, le Thf non sono risultate aumentate [133,134] e in un ulteriore studio è stata osservata una riduzione delle cellule Thf circolanti ICOS+ [135].
2. Cellule T CD8+ citotossiciche
Le cellule T CD8+ sono state meno studiate rispetto alle cellue CD4+. E’ stato tuttavia visto che le cellule T CD8+ hanno attività citolitica, producono citochine pro infiammatorie e possono reagire contro antigeni self [136]. In pazienti con AIG è stata osservata un'associazione fra aumento del numero delle cellule CD8+ nel liquido sinoviale e peggiore prognosi [137]. Il fenotipo delle cellule CD8+ nei siti infiammatori dei pazienti con artrite è eterogeneo e presenta sia caratteristiche pro
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infiammatorie che antiinfiammatorie. In particolare nel liquido sinoviale dei pazienti con AR è stata osservata un’aumentata espressione dei marker di attivazione (CD80,CD86,CD25), di citochine pro infiammatorie (IL6, TNF alfa), ma anche di markers di costimolazione negativi (TIM3, PD-1) [137,138]. Pertanto le cellule TCD8+ situate nei tessuti infiammatori sono eterogenee e possono presentare sia una funzione effettrice che regolatoria. Analogamente a quanto si verifica per i linfociti T CD4+, anche i linfociti T CD8+ si differenziano in cellule effetrici (TEFF ), cellule della
memoria centrali (TCM), e le cellule della memoria effettrici (TEM) dopo l'incontro con l'antigene.