Valutazione del profilo immunofenotipico di una nostra paziente in fase di remissione e in attività

In una paziente abbiamo potuto valutare le sottopopolazioni B linfocitarie, le Treg e le CD sia in fase di inattività (T0) sia a distanza di 2 mesi in fase di attività (T2) (tabella 10). Si tratta di una paziente affetta da AIG poliarticolare, in cui, in seguito ad un periodo di remissione clinica e laboratoristica di 3 anni è stata sospesa la terapia con Tocilizumab con riacutizzazione a distanza di due mesi e mezzo dalla sospensione. In T1 la paziente presenta un JADAS pari a 0 e in T2 pari a 25. Data la riattivazione della malattia è stata ripresa la terapia con Tocilizumab con raggiungimento della remissione clinica e laboratoristica dopo 2 mesi. Per quanto riguarda il profilo immunofenotipico, nel passaggio da malattia inattiva a attiva, si può notare una riduzione dei Breg del 36% e una riduzione delle CD mieloidi e delle CD plasmacitoidi rispettivamente del 79% e del 50%.

Tabella 10: Immunofenotipo in fase di inattività (T0) e di attività (T2)

CD3 Treg CD19 B naÏve B memoria switch B memoria tot B zona marginale CD21 low Breg mCD/µL pCD/µL T0 61,7% 8,6% 16,8% 80,7% 5% 9% 7% 4,8% 8,8% 29,23 29,19 T2 61,7% 7% 15,8% 84,1% 4,57% 13,6% 6,2% 6,7% 5,6% 6,13 14,4

63 3.6 Discussione

Le caratteristiche cliniche e bioumorali dei nostri pazienti rispecchiano quelle descritte in letteratura. La forma oligoarticolare è, infatti, più rappresentata della poliarticolare e il sesso femminile risulta prevalente. Per quanto riguarda il pattern anticorpale, nella nostra casistica gli ANA sono risultati positivi nel 70% circa dei pazienti e il FR in un paziente su 5 con forma poliarticolare. Tali risultati sono in linea con quanto riportato in letteratura dove gli ANA sono descritti nel 65-85% dei pazienti con forma oligoarticolare, in circa il 50% dei pazienti con forma poliarticolare e il FR in circa il 20% dei pazienti con forma poliarticolare [1,46].

Pochi studi hanno valutato il profilo immunofenotipico esteso in pazienti con AIG. Dalla nostra analisi delle sottopopolazioni B linfocitarie emerge un aumento del numero dei linfociti B totali rispetto ai controlli sani omogenei per età. Abbiamo inoltre osservato una riduzione delle cellule B transizionali, delle cellule Breg e delle cellule B memoria totali rispetto ai controlli sani. L'aumento dei linfociti B totali nel sangue periferico è stato recentemente descritto in un lavoro condotto da Marasco et al. su pazienti con AIG [153]. In letteratura, gli studi che hanno valutato le cellule B transizionali nel sangue periferico di pazienti con AIG hanno fornito risultati non univoci. In uno studio, infatti, emerge un aumento delle cellule B transizionali in circolo, dato a cui gli autori attribuiscono due possibili spiegazioni ovvero un'aumentata produzione a livello del midollo osseo oppure un alterato ricircolo; le cellule B transizionali sono infatti prodotte nel midollo, rilasciate in circolo e trasportate alla milza dove si sviluppano in cellule B mature [151]. Nello studio di Marasco et al., invece, non sono state riscontrate differenze nel numero di cellule B transizionali fra pazienti e controlli [153]. La diversità dei risultati di questi due lavori con quelli ottenuti nella nostra coorte di pazienti potrebbe essere, almeno in parte, spiegata dalla differenza nel numero di pazienti con malattia attiva valutati nei vari studi. Nel lavoro di Corcione et al. [151], infatti, tutti i pazienti valutati presentano almeno un'articolazione attiva mentre, nella nostra casistica, in 10

64

Le Breg appartengono alle cellule B transizionali, esse sono in grado di produrre citochine immunoregolatorie e di sopprimere la differenziazione in cellule Th1/Th17 e indurre la differenziazione delle Treg [139]. Nel nostro studio abbiamo osservato non solo livelli inferiori di Breg rispetto ai controlli sani ma anche una riduzione statisticamente significativa nei pazienti con malattia attiva rispetto a quelli con malattia inattiva. Questi dati sulle Breg, concordano con i dati riportati in letteratura. In due lavori, che hanno valutato rispettivamente pazienti con AR e con AIG, le Breg in circolo sono risultate ridotte in modo significativo nei pazienti rispetto ai controlli e in entrambe le casistiche sono stati osservati valori più bassi nei pazienti con malattia attiva [149,150].

Per quanto riguarda le cellule B memoria totali, abbiamo osservato una riduzione rispetto ai controlli sani. Studi condotti in pazienti con AIG hanno dimostrato che il loro numero è significativamente superiore nel liquido sinoviale, dove tendono ad accumularsi, rispetto al sangue periferico [151,152]. In un lavoro è stato anche confrontato il numero delle cellule B memoria totali nel sangue periferico dei pazienti e dei controlli senza che siano emerse differenze significative [151]. La cellule B memoria switch rappresentano una delle sottopopolazioni B più studiate nella AIG. Nel nostro studio non abbiamo trovato differenze significative rispetto ai controlli sani. In letteratura è riportato un aumento di questa sottopopolazione cellulare nel liquido sinoviale [151,153] mentre i dati ottenuti da sangue periferico sono contrastanti. In un lavoro infatti non sono emerse differenze significative nei valori di cellule B memoria switch in circolo fra pazienti e controlli [151]. Nello studio più recente di Marasco et al, invece, queste cellule sono risultate aumentate nei pazienti rispetto ai controlli [153]. Nel medesimo lavoro è stato osservato che l'aumento nel tempo delle cellule B memoria switch è ridotto nei pazienti che raggiungono la remissione in corso di terapia con anti-TNF [153].

Per quanto riguarda le sottopopolazioni T linfocitarie, abbiamo osservato una aumento, statisticamente significativo, delle cellule Thf rispetto ai controlli sani. Nella maggior parte degli studi, condotti nella AR, in cui sono state valutate le Thf, è stato riscontrato un aumento di questa

65

popolazione cellulare [128-132]. Le Thf sono cellule in grado di aiutare i linfociti B nella produzione di autoanticorpi. Sulla superficie delle Thf possono essere espressi i recettori per le chemochine CXCR3 e CCR6 [173]. Nell'unico lavoro, fino ad ora condotto nella AIG in cui è stata valutata questa sottopopolazione cellulare, non è stata evidenziata alcuna differenza significativa fra pazienti con artrite associata alla Sindrome di Down, pazienti con AIG e controlli in termini di Thf totali. E' stato, tuttavia, osservato un numero superiore del sottotipo Thf doppio positivo CXCR3+CCR6+ nei pazienti con artrite associata alla sindrome di Down rispetto ai controlli e ai pazienti con AIG [127]. Negli ultimi decenni il ruolo delle Treg nella patogenesi delle malattie autoimmuni è stato oggetto di molto interesse in quanto tali cellule sono fondamentali nel mantenimento della tolleranza al self. Nei nostri pazienti non abbiamo osservato differenze significative nelle Treg rispetto ai controlli. Negli studi condotti in pazienti con AR e AIG è descritto un aumento delle Treg nel liquido sinoviale [106] mentre, è meno chiaro, se, in circolo, le Treg presentino variazioni numeriche rispetto ai controlli [174,175].

L'immunità innata gioca un ruolo importante nella patogenesi della AIG. In particolare, le CD sono fondamentali nell'attivazione e nel mantenimento della risposta immune. Nel sangue periferico si riconoscono 3 tipi di CD: le pCD caratterizzate dall'espressione di CD123 (IL-3R) e due mCD o CD convenzionali (cCD; BDCA1/CD1c+ cCD e BDCA3/CD141+ cCD). Le CD141+ CD sono in grado di polarizzare le cellule T CD4+ verso il fenotipo Th1 e di indirizzare verso il fenotipo Th2 in modo più efficiente rispetto alle CD1c+ cCD. In un recente studio è stato osservato che nel liquido sinoviale dei pazienti con AR, le cCD CD141+ sono aumentate significativamente e possono attivare i linfociti T CD4+ e CD8+ contribuendo all'infiammazione sinoviale [176]. Le pCD, invece, nelle quali le molecole MHC di classe II e le molecole costimolatorie sono espresse meno, sono meno efficienti nell'attivazione dei linfociti T [177]. Le pCD possono indurre la risposta immune tollerogenica agendo sulla differenziazione delle Treg e il loro aumento è stato descritto in pazienti con AR in remissione [178].

66

Nel nostro studio, emerge una riduzione significativa della percentuale delle mCD nei pazienti rispetto a un gruppo di controllo, omogeneo per età. Abbiamo, inoltre, osservato che mentre nei controlli prevalgono le le mCD, nei pazienti si ha una prevalenza del tipo plasmacitoide. Considerando solo pazienti con età inferiore a 18 anni, dal confronto fra i controlli e i pazienti con malattia attiva si osserva, nei pazienti, una riduzione delle mCD sia in percentuale che in valore assoluto e delle CD totali in percentuale. La riduzione percentuale delle mCD emerge anche dal confronto fra pazienti con malattia inattiva e controlli, in questi ultimi si osseva inoltre, rispetto ai controlli, un aumento del rapporto pCD/mCD. Inoltre nella paziente valutata sia in fase di remissione che di successiva riacutizzazione, abbiamo osservato una importante riduzione di entrambi i sottotipi di CD in corso di riattivazione. Precedenti studi hanno dimostrato la riduzione in circolo sia delle mCD che delle pCD in pazienti con AIG rispetto ai controlli. [167,168]. In uno studio condotto in pazienti con AIG sistemica tale riduzione interessa in modo specifico le mCD durante le fasi di attività di malattia [166]. Nello studio di Throm et al. non emergono, invece, differenze significative nel numero di mCD e pCD in circolo in pazienti con AIG e controlli [179]. In un recente lavoro, in cui sono state confrontate le CD in pazienti con AIG e artrite settica, non è emersa alcuna differenza significtiva nelle mCD e pCD in circolo, mentre entrambe risultano aumentate in modo significativo nel liquido sinoviale dei pazienti con AIG [180]. La riduzione delle cellule dendritiche mieloidi (mCD) individuata nel nostro studio potrebbe essere la

conseguenza della migrazione di queste cellule dal sangue periferico alla cavità articolare.

Il presente lavoro ha il pregio di valutare un esteso pannello di sottopopolazioni linfocitarie e le

CD in una patologia in cui dati della letteratura sono scarsi e non sempre univoci. Una limitazione è data dal numero relativamente esiguo di pazienti. In conseguenza di questo, i

confronti fra sottogruppi, che avrebbero potuto evidenziare differenze fra pazienti con malattia attiva e inattiva come pure con forma poliarticolare e oligoarticolare non hanno fornito, eccetto che per un dato, risultati significativi. Sempre a causa della scarsa numerosità della popolazione in

67

studio non è stato possibile valutare, in modo accurato, un'eventuale influenza della terapia con anti-TNFα sui risultati.

5.Conclusioni

Dal presente studio emergono differenze in alcune sottopopolazioni B linfocitarie, nelle Thf e nelle CD, in particolare di tipo mieloide, fra pazienti e controlli sani. Queste osservazioni ci portano a ipotizzare che tali popolazioni cellulari possano essere implicate nella patogenesi della AIG e pertanto rappresentare possibili bersagli terapeutici. La valutazione del profilo immunofenotipico di una coorte di pazienti più ampia ci potrebbe consentire di confermare i nostri risultati valutando anche una possibile influenza della terapia ed eventuali differenze nelle popolazioni cellulari in pazienti con malattia attiva e in remissione.

68 Bibliografia:

1. Ravelli A, Martini A. Juvenile idiopathic arthritis. Lancet 2007;369:767-68.

2. Petty RE, Southwood TR, Manners P, et al. International League of Associations for rheumatology classification of juvenile idiopathic arthritis: second revision, Edmonton, 2001. J Rheumatol. 2004;31:390-2. 3.Martini A. It is time to rethink juvenile idiopathic arthritis classification and nomenclature. Ann Rheum Dis. 2012;71:1437–9.

4. Ravelli A, Felici E, Magni-Manzoni S, et al. Patients with antinuclear antibody-positive juvenile idiopathic arthritis constitute a homogeneous subgroup irrespective of the course of joint disease. Arthritis Rheum. 2005;52:826–32.

5. Ravelli A, Varnier GC, Oliveira S, et al. Antinuclear antibody-positive patients should be grouped as a separate category in the classification of juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2011;63:267–75. 6. Giancane G, Consolaro A, Lanni S,et al. Juvenile Idiopathic Arthritis: Diagnosis and Treatment.Rheumatol Ther. 2016;3(2):187-207.

7. Prakken B, Albani S, Martini A. Juvenile idiopathic arthritis. Lancet 2011:377:2138-49.

8. Prahalad S, McCracken CE, Ponder LA, et al. Familial autoimmunity in the childhood arthritis and rheumatology research alliance registry.Pediatr Rheumatol 2016;14:14.

9. Cobb JE, Hinks A,Thomson W. The genetics of juvenile idiopathic arthritis: current understanding und future prospects. Rheumatology (Oxford) 2014;53:592-99.

10. Prahald S, Glass DN. A comprehensive review of the genetics of juvenile idiopathic arthritis. Pediatr Rheumatol Online J 2008;6:11.

11. Prahald S. Genetics of juvenile idiopathic arthritis: an update. Curr Opin Rheumatol 2004;16:588-94. 12. Rosen P, Thompson S, Glass D. Non-HLA gene polymorphisms in juvenile rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol 2003;21:650-56.

13. Barnes MG, Grom AA, Thompson SD, et al. Subtype-specific peripheral blood gene expression profiles in recent-onset juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum 2009;60:2102-12.

14. Griffin TA, Barnes MG, Ilowite NT, et al. Gene expression signatures in polyarticular juvenile idiopathic arthritis demonstrate disease heterogeneity and offer a molecular classification of disease subsets. Arthritis Rheum. 2009;60:2113-23.

15. Barnes MG, Grom AA, Thompson SD, et al. Biologic Similarities Based on Age at Onset in Oligoarticular and Polyarticular Subtypes of Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheum 2010;62:3249-58. 16. Hunter PJ, Nistala K, Jina N, et al. Biologic Predictors of Extension of Oligoarticular Juvenile Idiopathic Arthritis as Determined From Synovial Fluid Cellular Composition and Gene Expression. Arthritis Rheum 2010;62:896-907.

17. Hori S , Takahashi T, Sakaguchi S. Control of Autoimmunity by Naturally Arising Regulatory CD4+ T Cells. Adv Immunol 2003;81:331-71.

69

18. De Kleer IM, Kamphuis Y, Rijkers M, et al. The spontaneous remission of juvenile idiopathic arthritis is characterized by CD30+ T cells directed to human heat-shock protein 60 capable of producing the regulatory cytokine interleukin-10 Arthritis Rheum 2003;48:2001-10.

19. Nistala K, Adams S, Cambrook H. et al. Th17 plasticity in human autoimmune arthritis is driven by the inflammatory enviroment. Proc Nat Acad Sci USA 2010;107:14751-56.

20. Vasert SJ, Kuis W, Grom AA. Systemic JIA: new developments in the understanding of the pathophysiology and therapy. Best Pract Res Clin Reumatol 2009;23:655-64.

21. Anink J, Prince FH, Dijkstra M, et al. Long-term quality of life and functional outcome of patients with juvenile idiopathic arthritis in the biologic era: a longitudinal follow-up study in the Dutch Arthritis and Biologicals in Children Register. Rheumatology (Oxford) 2015;54:1964-9.

22. Pascual V, Allantaz F, Arce E, et al. Role of interleukin-1 (IL-1) in the pathogenesis of systemic onset juvenile idiopathic and clinical response to IL-1 blockade. J Exp Med 2005;201:1479-86.

23. De Jager W, Hoppenreijs EP, Wulffraat NM, et al. Blood and synovial fluid cytokine signatures in patients with juvenile idiopathic arthritis: a cross sectional study. Ann Rheum Dis 2007;66:589-98.

24. De Jager W, Vastert SJ, Beekman JM, et al. Defective Phosphorylation of interleukin-18 Receptor Beta Causes Impaired Natural Killer Cell Function in Systemic-Onset Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheum 2009;60:2782-93.

25. Frosch M, Roth J. New insights in systemic juvenile idiopathic arthritis-from pathophysiology to treatment. Rheumatology (Oxford)2008;47:121-25.

26. Foell D, Roth J . Proinflammatory S100 proteins in arthritis and autoimmune disease. Arthritis Rheum. 2004;50:3762-71.

27. Foell D, Frosch M, Schulze zur Wiesch A, et al. Methotrexate treatment in juvenile idiopathic arthritis: when is the right time to stop? J. Ann Rheum Dis. 2004;63:206-8.

28. Put K, Vandenhaute J, Avau A., et al. Inflammatory gene expression profile and defective interferon-γ and granzime k in natural killer cells from systemic juvenile idiopathic arthritis patients. Arthritis Rheumatol 2017;69:213-224

29. Aggarwal A, Sarangi AN, Gaur P, et al. Gut microbiome in children with enthesitis-related arthritis in a developing country and the effect of probiotic administration. Clin Exp Immunol 2017;187:480-89

30. Tejesvi MV, Arvonen M, Kangas SM, et al. Faecal microbiome in new onset juvenile idiopathic arthritis. Eur Clin Microbiol Infect Dis 2016;35:363-370.

31. Horton DB, Scott FI, Haynes K, et al. Antibiotic exposure and juvenile idiopathic arthritis: a case control study. Pediatrics 2015; 136:e333-e343.

32. Arvonen M, Berntson L, Pokka T, et al. Gut microbiota-host interaction and juvenile idiopathic arthritis. Pediatra Rheumatol 2016;14:44.

33 Schneider R, Laxer RM. Chapter 3: systemic juvenile idiopathic arthritis. In: Cimaz R, Lehman T, editors. Handbook of systemic autoimmune diseases, vol. 6. Elsevier BV; 2007. p. 35–274.

34. Gurion R, Lehman TJ, Moorthy LN. Systemic arthritis in children: a review of clinical presentation and treatment. Int J Inflam 2012;2012:271569.

70

35. Lee JJY, Schneider R. Systemic Juvenile Idiopathic Arthritis. Pediatr Clin North Am 2018;65:691-709. 36. Calabro JJ, Holgerson WB, Sonpal GM, et al. Juvenile rheumatoid arthritis: a general review and report of 100 patients observed for 15 years. Semin Arthritis Rheum 1976;5:257–98.

37. Kimura Y, Weiss JE, Haroldson KL, et al. Pulmonary hypertension and other potentially fatal pulmonary complications in systemic juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Care Res (Hoboken) 2013;65:745–52. 38. Wittkowski H, Frosch M, Wulffraat N, et al. S100A12 is a novel molecular marker differentiating systemic-onset juvenile idiopathic arthritis from other causes of fever of unknown origin. Arthritis Rheum 2008;58:3924–31.

39. Seth V, Kabra SK, Semwal OP, et al. Clinico-immunological profile in juvenile rheumatoid arthritis–an Indian experience. Indian J Pediatr 1996;63:293–300.

40. Sawhney S, Woo P, Murray KJ. Macrophage activation syndrome: a potentially fatal complication of rheumatic disorders. Arch Dis Child 2001;85:421–6.

41. Ravelli A. Macrophage activation syndrome. Curr Opin Rheumatol 2002;14:548-52. 42. Crayne CB, Beukelman T. Juvenile Idiopathic Arthritis: Oligoarthritis and Polyarthritis. Pediatr Clin

North Am 2018;65:657-674.

43. Saurenmann RK, Rose JB, Tyrrell P, et al. Epidemiology of juvenile idiopathic arthritis in a multiethnic cohort: ethnicity as a risk factor. Arthritis Rheum. 2007;56:1974-84.

44. Eisenstein EM, Berkun Y. Diagnosis and Classification of Juvenile Idiopathic Arthritis. Autoimmun 2014;48-49:31-3.

45. Ostrov BE. What is the significance of dry synovitis? Pediatr Rheumatol Online J 2004;2:114-18. 46. Ravelli A, Varnier GC, Oliveira S, et al. Antinuclear antibody-positive patients should be grouped as a separate category in the classification of juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum 2011;63:267-75. 47. Martini A. Are the number of joints involved or the presence of psoriasis still useful tools to identify homogeneous disease entities in juvenile idiopathic arthritis?J Rheumatol. 2003;3:1900-3.

48. Hafner R, Michels H. Psoriatic arthritis in children. Curr Opin Rheumatol 1996;8:467-72. 49. Espinosa M, Gottlieb BS. Juvenile idiopathic arthritis. Pediatr Rev 2012;33:303-13.

50. Misrty RR, Patro P, Agarwal V, Misra DP. Enthesitis-related arthritis: current perspectives. Open Access Rheumatology: Research and Reviews 2019;11:19-31.

51. Weiss JE, Ilowite NT. Juvenile idiopathic arthritis. Pediatr Clin North Am 2005;52:413-42.

52. Consolaro A, Giancane G, Alongi A, et al. Phenotypic variability and disparities in treatment and outcomes of childhood arthritis throughout the world: an observational cohort study. Lancet Child Adolesc Health 2019;3:255-63.

53. Martini A. It is time to rethink juvenile idiopathic arthritis classification and nomenclature. Ann Rheum Dis 2012;71:1437-9.

71

54. Nigrovic PA, Martinez-Bonet M, Thompson SD. Implications of juvenile idiopathic arthritis genetic risk variants for disease pathogenesis and classification. Curr Opin Rheumatol 2019;31:401-10.

55. Martini A, Ravelli A, Avcin T, et al. Toward new classification criteria for juvenile idiopathic arthritis: first steps, pediatric rheumatology InternationalTrials Organization International Consensus. J Rheumatol 2019;46:190-7.

56. Terslev L, Naredo E, Iagnocco A, et al.Defining enthesitis in spondyloarthritis by ultrasound: results of a Delphi process and of a reliability reading exercise. Arthritis Care Res (Hoboken). 2014;66:741-8.

57. Colebatch-Bourn AN, Edwards CJ, Collado P, et al. EULAR-PReS points to consider for the use of imaging in the diagnosis and management of juvenile idiopathic arthritis in clinical practice. Ann Rheum Dis. 2015;74:1946-57.

58. Beukelman T, Patkar NM, Saag KG, et al. 2011 American College of Rheumatology Recommendations for the Treatment of Juvenile Idiopathic Arthritis: Initiation and Safety Monitoring of Therapeutic Agents for the Treatment of Arthritis and Systemic Features. Arthritis Care Res (Hoboken). 2011 Apr;63:465-82. 59. Bou R, Adan A, Borras F, et al. Clinical Management Algorithm of Uveitis Associated With Juvenile Idiopathic Arthritis: Interdisciplinary Panel Consensus. Rheumatol Int 2015;35:777-85.

60. Bechtold S, Simon D. Growth abnormalities in children and adolescents with juvenile idiopathic arthritis. Rheumatol Int 2014;34:1483-8.

61. Packham JC, Hall MA. Long-term follow-up of 246 adults with juvenile idiopathic arthritis: social function, relationships and sexual activity. Rheumatology (Oxford). 2002;41:1440-3.

62.Stoll ML, Sharpe T, Beukelman T, et al. Risk factors for temporomandibular joint arthritis in children with juvenile idiopathic arthritis. Good J, Young D, Cron RQ. J Rheumatol. 2012;39:1880-7.

63. El Assar de la Fuente S, Angenete O, Jellestad S, et al. Juvenile idiopathic arthritis and the temporomandibular joint: A comprehensive review. J Craniomaxillofac Surg. 2016;44:597-607.

64. Fantini F, Beltrametti P, Gallazzi M, et al. Evaluation by dual-photon abdorptiometry of bone, mineral loss in rheumatic children on longterm treatment with corticosteroids. Clin Exp Rheumatol 1991;9:21-8. 65. Burnham JM, Shults J, Dubner SE, et al. Bone density, structure, and strength in juvenile idiopathic arthritis: importance of disease severity and muscle deficits. Arthritis Rheum 2008;58:2518-27.

66. Falcini F, Bindi G, Simonini G, et al. Bone status evaluation with calcaneal ultrasound in children with chronic rheumatic diseases. A one year follow up study. J Rheumatol 2003;30:179-84. 67. Pepmueller PH, Cassidy JT, Allen SH, et al. Bone mineralization and bone mineral metabolism in children with juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1996;39:746-57.

68. Burnham JM, Shults J, Weinstein R, et al.Childhood onset arthritis is associated with an increased risk of fracture: a population based study using the general practice research database. Ann Rheum Dis 2006;65:1074-79.

69. Roth J, Bechtold S, Borte G, et al. Osteoporosis in juvenile idiopathic arthritis--a practical approach to diagnosis and therapy. Eur J Pediatr 2007;166:775-84.

72

70.Ravelli A. Toward an understanding of the long-term outcome of juvenile idiopathic arthritis. Clin Exp Rheum 2004;22:271-75.

71. Ravelli A, Martini A. Early predictors of outcome in juvenile idiopathic arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2003;21:89-93.

72. Lomater C, Gerloni V, Gattinara M, et al. Systemic onset juvenile idiopathic arthritis: a retrospective study of 80 consecutive patients followed for 10 years. J. Rheumatol 2000; 27:491-96.

73. Guillaume S, Prieur AM, Coste J, et al. Long-term outcome and prognosis in oligoarticular onset juvenile