Il biofilm di Pseudomonas spp

Nell’ambito del genere Pseudomonas la specie Pseudomonas fluorescens ha una notevole rilevanza come agente di deterioramento alimentare, oltre che come contaminante dell’acqua ed agente di malattie di alcuni pesci, alcune piante, e solo sporadicamente, di infezioni nosocomiali. Ad esempio un ceppo di Pseudomonas

fluorescens isolato dal suolo ha prodotto in vitro un biofilm flocculento, non

mucoidale, con caratteristiche strutturali uniche. I biofilm maturi sono risultati formati da numerosi batteri vitali, anche dopo colture prolungate, e contengono fino al 50% di proteine ed il 3% (in peso secco) di calcio accumulato, suggerendo un importante ruolo del calcio bivalente nella formazione del biofilm. I polisaccaridi costituivano una frazione più piccola nel biofilm, di circa il 15%, mentre i livelli totali di acido nucleico nel biofilm ammontavano a circa il 5%. L’ultrastruttura del biofilm prevedeva fitti gruppi fibrillari, nanofibre e ordinati, avvolti in sottili fogli in camere a nido d’ape.

Il core del biofilm consisteva in un piccolo numero di batteri immersi nella matrice di fibre e in un particolato che si aggregava ad esse (Figura 6). Le fibre erano organizzate all’interno di reti ordinate. Queste reti contenevano pochi batteri ed erano coperte da un sottile strato di materiale simile a quello che immergeva i batteri nel particolato.

Sono stati studiati inoltre il comportamento e la fisiologia del ceppo di P.

fluorescens in esame sotto diversi stress idrodinamici e si è visto che i biofilm

formati ad un regime di flusso turbolento erano molto più attivi e contenevano più biomassa vitale rispetto alle loro controparti sottoposte ad un flusso laminare (Baum et al., 2009). In uno studio precedente su biofilm di P. aeruginosa è stato visto che, a bassi flussi laminari trasversali, il biofilm consisteva in un monostrato

37 di cellule con microcolonie circolari, ma ad alti flussi con moto turbolento i microrganismi creavano delle strutture filamentose (Purevdorj et al. 2002).

Figura 6 – Fibre associate ai batteri (B) e al particolato in un biofilm di Pseudomonas fluorescens (Baum et al., 2009)

Ѐ stato dimostrato che il biofilm batterico contiene una significativa popolazione di batteri vivi suddivisi in gruppi, circondati da batteri morti, indicando che il biofilm maturo è fisiologicamente attivo e non rappresenta solo un aggregato di detriti cellulari. I biofilm maturi contengono batteri vivi e sono strutturalmente, chimicamente e fisiologicamente eterogenei. Questa struttura tridimensionale è stata riprodotta in laboratorio e sembra che i microrganismi non perdano la loro attività di formare biofilm fino a sei o più subculture (Baum et al., 2009).

Molti studi sono stati inoltre concentrati su Pseudomonas aeruginosa, importante patogeno nosocomiale. Nonostante la sua natura patogena e non alterante, esso può aiutare a comprendere i meccanismi alla base della formazione di specie deterioranti appartenenti allo stesso genere che colpiscono l’industria alimentare. Una volta adeso alla superficie, P. aeruginosa forma delle microcolonie che svilupperanno in un gambo, che successivamente sosterrà una struttura a cappello di fungo. Diversi fattori, prodotti dalle cellule di superficie, sono stati identificati ed è noto che essi consentono l’iniziale interazione con le superfici e la formazione di strutture come pili, flagelli, proteine e polisaccaridi extracellulari. Ѐ stato inoltre visto che la presenza di acidi nucleici nell’EPS del biofilm svolge un ruolo importante nella stabilizzazione della matrice. Infatti P. aeruginosa necessita dei polisaccaridi nel biofilm nelle diverse fasi del suo sviluppo, ma prende vantaggio dalla presenza di acidi nucleici in particolare durante le ultime fasi di maturazione.

38 I polisaccaridi capsulari (alginato e levano) provvedono ad offrire una copertura intorno al microrganismo, mentre i polisaccaridi aggregativi (Psl, Pel e cellulosa) provvedono all’integrità strutturale e all’interazione con i componenti aggiuntivi della matrice (acidi nucleici, componenti della matrice contenenti polisaccaridi, componenti della matrice contenti proteine e ramnolipidi).

In P. aeuginosa l’alginato (Figura 7) è un’importante molecola della matrice per la formazione del biofilm. Nello specifico l’alginato ha un elevato peso molecolare, è un polimero acetilato con legami β-1,4 di acido L-guluronico e acido D- mannuronico. Sia i legami β-1,4 che β-1,3 conferiscono una considerevole rigidità se comparati ai legami β-1,2 e β-1,6 comunemente trovati nei destrani.

Figura 7 – Struttura chimica dell’alginato (Mann e Wozniak, 2012)

L’alginato una volta era identificato come l’esclusiva componente vitale nella matrice di P. aeruginosa e questo era dovuto alla sua abbondanza e alla sua capacità protettiva.

I polisaccaridi capsulari come l’alginato ed il levano possiedono sufficienti proprietà per la ritenzione di acqua e nutrienti. Si pensa che l’alginato abbia proprietà di ritenzione idrica simili a quelle dell’acido ialuronico e che possa trattenere fino ad 1 Kg di acqua per grammo di polisaccaride. La solubilità dell’alginato è influenzata dall’acetilazione perché i gruppi acetilici inibiscono l’interazione tra le catene polimeriche ed i cationi, pertanto consentono la formazione del gel. Questi fattori contribuiscono all’elevata viscosità dell’alginato. I biofilm contenenti alginato hanno una spiccata abilità nel sopravvivere in ambienti ostili.

L’azione del polisaccaride in ceppi mucoidi di P. aeruginosa consiste nel conferire resistenza agli antimicrobici ed all’opsonofagocitosi. L’ipotesi è stata confermata studiando gli anticorpi prodotti contro l’alginato in pazienti con fibrosi cistica e

39 verificando che gli anticorpi fallivano nel promuovere l’azione opsonica nei confronti di P. aeruginosa in vitro.

Il levano (Figura 8) invece è un polisaccaride prodotto da un sottoinsieme di pseudomonadi, identificabili come fitopatogeni. Il levano è un β-2,6 polifruttano ad alto peso molecolare con estese ramificazioni attraverso legami β-2,1. Il levano è prodotto dal sucrosio grazie all’azione delle levansucrasi extracellulari. La funzione del levano è stata studiata specialmente in P. syringae, dove ha il compito di stoccare nutrienti. Ѐ stato dimostrato infatti che esso non è responsabile del mantenimento della struttura del biofilm, ma la sua localizzazione in spazi vuoti o vescichette all’interno della matrice identifica il levano come una forma di stoccaggio di nutrienti.

Figura 8 – Struttura chimica del levano (Mann e Wozniak, 2012)

Il Psl (Figura 9) invece è un pentasaccaride contenente D-mannosio, D-glucosio e L-ramnosio. Esso è comunemente trovato in due forme: una componente cellula- associata ad alto peso molecolare ed una forma solubile relativamente più piccola che può essere isolata dal surnatante della coltura in forma libera. La sua principale funzione consiste nel garantire l’adesione delle cellule sessili sia su superfici biotiche che abiotiche. Il biofilm maturo trae vantaggio dal Psl per avere una migliore struttura e stabilità, esso inoltre protegge dagli effettori del sistema immunitario, complemento e neutrofili.

40

Figura 9 – Struttura chimica del Psl (Mann e Wozniak, 2012)

Al contrario la composizione e la natura dei polisaccaridi Pel non sono state definitivamente chiarite.

Mentre in alcune specie la funzione della cellulosa nel biofilm non è stata ancora descritta, la produzione di cellulosa da parte di P. fluorescens impatta fortemente sulla produzione del biofilm all’interfaccia aria-liquido. La conferma fu data dal confronto tra un ceppo difettivo nell’acetilazione della cellulosa con un ceppo acetilante ed è emerso che il primo produceva un biofilm più debole rispetto al secondo che era più resistente (Mann e Wozniak, 2012).

Anche lo ione magnesio (Mg2+) può avere un ruolo determinante sulla formazione del biofilm, infatti è stato visto come influisca sull’adesione batterica. L’effetto del magnesio è stato verificato su P. fluorescens ed è emerso che non ha alcuna influenza nei confronti delle cellule planctoniche, ma al contrario ha una certa rilevanza nella formazione del biofilm, aumentando la presenza di cellule adese. L’adesione delle cellule, influenzata da Mg2+

, rappresenta un aspetto complesso e dinamico. Questo microelemento è in grado di alterare la formazione e la struttura del biofilm, in quanto riduce le forze repulsive tra i batteri carichi negativamente ed il substrato superficiale e tra i gruppi negativi sui polisaccaridi che costituiscono il biofilm. P. fluorescens produce inoltre un galattoglucano acidico, precedentemente chiamato marginalano. Lo ione magnesio interagisce anche come reticolante con il galattoglucano acidico e stabilizza la struttura del biofilm (Song e Leff, 2006).

41