Nei topi, l’inattivazione genica sia di IRP1 che di IRP2 provoca la morte embrionale allo stadio della blastocisti, sottolineando il ruolo fondamentale che ricoprono nella rete IRP-IRE durante lo sviluppo precoce. I topi IRP1-/- mostrano una lieve dysregulation della ferritina nei reni e nel grasso bruno. In mancanza di un evidente
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fenotipo, sorprende molto il fatto che la c-acon, essendo una proteina altamente conservata, si trovi in molti diversi organismi.
Sono stati creati due distinti ceppi di topi IRP2 -/-. Un ceppo è stato creato inserendo il gene PGK-neomycin nell’esone 3/4 del gene IRP2, mentre l'altro ceppo è stato creato grazie alla tecnologia Cre-Lox . Entrambi i ceppi di topi IRP2 -/-, sviluppano una lieve anemia microcitica ed una alterata distribuzione di ferro nel corpo. Il contenuto di ferro è elevato sia nell'intestino che nel fegato e si associa ad un aumento dell'espressione della ferritina e ad una riduzione dell’espressione del TfR1; inoltre, è ridotto nei macrofagi splenici e si associa anche ad una riduzione dell’espressione della ferritina.
Nei topi IRP2 -/-, l’anemia microcitica è caratterizzata da una normale saturazione della transferrina ed ai parametri sierici del ferro; si ritiene che sia causata dalla carenza di ferro cellulare nei precursori eritroidi come conseguenza dei ridotti livelli di TfR1 e dell’aumento dei livelli di ferritina. Poiché i precursori eritroidi dipendono dal ferro che si lega alla transferrina per la sintesi dell'eme, l’aumento dei livelli di ferritina e la riduzione dell’assorbimento del ferro porterebbero ad una riduzione del pool cellulare di ferro labile, compromettendo la sintesi dell'eme. I topi privi della IRP2 negli enterociti, epatociti o macrofagi, non sviluppano l'anemia microcitica suggerendo quindi che l'anemia microcitica, nei topi IRP2 -/ -, rappresenti un difetto intrinseco dell'omeostasi del ferro nei precursori eritroidi. I topi IRP2 -/- sviluppano anche la protoporfiria eritropoietica caratterizzata da un aumento della protoporfirina IX nel midollo osseo, nel siero e nel fegato. La sintesi eritroide ALAS è upregulated nei precursori eritroidi IRP2 -/- probabilmente a causa della perdita della repressione traslazionale IRP2. Il precursore eme della protoporfirina IX, si accumula nei precursori eritroidi a causa della ridotta disponibilità del ferro che è necessaria per completare la sintesi dell'eme (Cooperman et al., 2005). Il ceppo IRP2 -/- creato da LaVaute et al. sviluppa una malattia neurodegenerativa con insorgenza tardiva caratterizzata da un’andatura anomala, debolezza negli arti posteriori e tremori, e da padronanza e prestazioni neuromuscolari ridotte, testate con l’hanging wire test. Il
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cervelletto, la substantia nigra, l’ippocampo ed il nucleo caudato ed altre aree del cervello hanno mostrato elevati livelli di ferro ferrico e ferritina in condizioni di assonopatia e perdita neuronale. L'insorgenza e la gravità della neurodegenerazione peggiora nei topi IRP2 - / - IRP1 + / - , come effetto di dosaggio del gene con le IRPs. I sintomi neurodegenerativi sia dei topi IRP2 - / - che IRP2 - / - IRP1 +/ - sono stati alleviati dall’uso del Tempol, una membrana permeabile agli scavenger radicali, che ha ridotto i livelli di ferritina e di ferro nella sostanza bianca cerebellare. Tempol, ha dimostrato di convertire la forma c-Acon della IRP1 nella forma RNA binding che stabilizza TfR1 mRNA e reprime la sintesi della ferritina, ristabilendo così l’omeostasi del ferro. Più di recente, i topi IRP2 - / - hanno mostrato di avere una ridotta degenerazione neuronale motoria e una ridotta assonopatia del midollo spinale, che invece è molto più grave nei topi IRP2 - / - IRP1 + / - . Nei topi IRP2 - / - , le sezioni lombari spinali hanno mostrato l'accumulo di corpi densi di mielina, che sono segni caratteristici della neurodegenerazione, nella sostanza bianca ventrale e laterale.
I mitocondri del midollo spinale lombare erano ingrossati, e presentavano anche delle creste interrotte e creste vacuolizzate. Nei mitocondri, sono state ridotte anche le funzioni dei complessi respiratori I e II della colonna vertebrale lombare dei topi IRP2 - / -. Il fatto che i complessi I e II contengano cluster Fe-S e gruppi prostetici eme essenziali per l'attività, suggerisce che la carenza di ferro cellulare nei neuroni motori può compromettere la funzione mitocondriale, che porta verso la degenerazione neuronale. Questa ipotesi è stata testata trattando i topi IRP2 - / - con Tempol e attraverso l’incrocio di topi IRP2 - / - o IRP2 - / - IRP1 + / - in un background Fth - / + . La sopravvivenza dei neuroni motori è migliorata grazie ad entrambi gli approcci, in linea con l'idea che la carenza di ferro cellulare abbia un ruolo nella degenerazione neuronale motoria nei topi IRP2 - / -.
In contrasto con i topi IRP2 - / - creati da LaVaute et al., i topi IRP2 - / - creati da Galy et al. non mostravano un’andatura anomala, debolezza negli arti posteriori e tremori o cambiamenti neuropatologici a 13-14 mesi di età. La terapia di Perls e
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TUNEL non ha evidenziato segni di deposito di ferro o di degenerazione cellulare nel cervello, ed anche la microscopia elettronica non ha mostrato alcuna presenza di difetti ultrastrutturali o mitocondriopatia. In accordo con LaVaute et al., il ceppo IRP2 - / - creato da Galy et al., evidenzia problemi nella coordinazione motoria e nell’equilibrio oltre ad una ridotta attività di padronanza quando sono stati esaminati con i rotarod e modified-hole board tests. Entrambi i ceppi presentano anche una riduzione di TfR1 ed un aumento dell'espressione della ferritina nel cervello.
Non è stato chiarito se le differenze nella gravità dei segni clinici e patologici della neurodegenerazione tra i due ceppi IRP2 - / -, siano dovute a strategie mirate, background genetici o problemi tecnici (Galy et al., 2008).
La funzione delle IRPs, nell’assorbimento del ferro è stata studiata attraverso l’eliminazione della sola IRP2 o di entrambe le IRP1 ed IRP2 nelle cellule epiteliali intestinali. I topi privi di IRP2 nel duodeno hanno rappresentato il fenotipo intestinale del duodeno con elevati livelli di ferro e l’aumentata espressione della ferritina nei topi IRP2 - / -.
Il contenuto di ferro nel duodeno ed i livelli di ferritina non hanno influito nei topi privi di IRP2, negli epatociti e nei macrofagi, suggerendo che l'omeostasi dysregulated del ferro nel duodeno con deficit di IRP2 è probabilmente dovuta ad una cellula autonoma. I topi privi sia di IRP1 che di IRP2 nelle cellule epiteliali intestinali, sono stati creati attraverso l’allevamento di topi omozigoti per gli alleli
Aco1 e IRE2 con topi che esprimevano Cre-ricombinasi sotto il controllo del
promotore Villin. Questi topi esprimevano gravi difetti di crescita 7 giorni dopo il parto, e l'80% degli animali sono morti poco dopo lo svezzamento probabilmente a causa di disidratazione, con il restante 20% che ha raggiunto l'età adulta grazie ad una incompleta eliminazione di IRP. Gli enterociti carenti di IRP nei topi mostrano delle cripte duodenali meno strutturate e villi, mentre gli enterociti intestinali evidenziano mitocondriopatia insieme ad un aumento dell'apoptosi.
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I livelli di ferritina e ferroportina sono stati profondamente aumentati, inoltre sono stati ridotti TfR1 e le isoforme DMT1-IRE mRNAs e la proteina. L’aumento dei livelli di ferroportina si sono verificati senza alterare i livelli dell’mRNA, malgrado aumentassero quelli dell’epcidina.
Difatti, l’aumento dei livelli di epcidina non poteva essere giustificato da un aumento dei livelli di ferro epatico, ed è stato ipotizzato che questo incremento fosse dovuto ad una ridotta eritropoiesi o ad una infiammazione. Sorprendentemente, i parametri del sangue non hanno evidenziato alterazioni dei livelli di ferro sistemico considerando i profondi cambiamenti avvenuti nell’omeostasi cellulare del ferro dei topi con enterociti cerenti di IRP. E’ probabile che l’aumento delle esportazioni di ferro dalla ferroportina possa compensare il ridotto assorbimento di ferro ed aumentare il livello di ferritina. Questo studio ha dimostrato che la dysregulation dell’assorbimento, deposito ed esportazione del ferro negli enterociti privi di IRP, è in relazione con una maggiore richiesta di ferro cellulare come una possibile causa di mitocondriopatia e alterazione della funzione degli enterociti.
È stata dimostrata l'importanza della ferritina nell’assorbimento del ferro, nei topi in cui era stata eliminata la subunità H-ferritin delle cellule epiteliali intestinali. Questi topi hanno mostrato un aumento dei depositi di ferro corporeo oltre alla saturazione della transferrina e, come previsto, un aumento dei livelli epatici di mRNA dell’epcidina. Un'ulteriore analisi ha evidenziato anche bassi livelli di DMT1, DYCTB e TfR1 mRNAs, oltre ad un aumento della ferroportina e della subunità L- ferritin. I livelli della IRP2 sono ridotti, suggerendo un aumento del pool cellulare di ferro labile, che porterebbe verso la destabilizzazione del DMT1 e TfR1 mRNAs e all’aumento della sintesi della ferroportina e della subunità L-ferritin. DMT1 e DCYTB mRNAs sono trascrizionalmente attivati dal fattore HIF-2α nei topi con deficit di ferro (Shah et al., 2009).
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