UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
TESI DI LAUREA
METABOLISMO DEL FERRO E
MECCANISMI DI OMEOSTASI
Relatori Candidata
Prof.ssa Claudia Martini Lucia Abbamonte
Dott.ssa Eleonora Da Pozzo
Dott.ssa Chiara Giacomelli
Indice
1. Il ferro 1.1. L’importanza del ferro nella fisiologia dei mammiferi...1 2. Il metabolismo sistemico e cellulare del ferro 2.1Il metabolismo cellulare delferro………...3 2.2 Distribuzione e metabolismo sistemico del ferro………...…...12 2.3. Trafficking del ferro cellulare………...16 3. Le Proteine regolatrici del ferro 3.1 Le proteine regolatrici del ferro...22 3.2 I recenti progressi nella regolazione dell’ IRP1...27 3.3 La regolazione dell’attività RNA-binding dell’IRP1 attraverso il cluster 4Fe-4S...29 3.4. La regolazione del ferro in seguito alla degradazione della proteina IRP1………...………...33 3.5 La fosforilazione S138 ed il meccanismo della regolazione della IRP1 attraverso il ferro……….…….….…....34 3.6 Le IRPs e l’ossigeno……….……….………....34 3.7 La regolazione ferro-mediata della stabilità della IRP2……….…..38 3.8 L’inattivazione genica di IRP1 e IRP2………...40
4. L’omeostasi del ferro e sue de regolazioni 4.1 I difetti nel signalling dell’epcidina……….…..……. 45 4.2 I polimorfismi della ferroportina...47 4.3Il rame nella NAFLD...51 4.4 I disordini del metabolismo del ferro...54 4.4.1 La sideropenia e l’anemia sideropenica...54 4.4.2. L’anemia dei disordini cronici (ACD)...55 4.4.3 L’anemia da iperproduzione ectopica di epcidina...56 4.4.4 L’IRIDA (Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia)...57 4.4.5 L’ipotransferrinemia...57 4.4.6 L’anemia da difetto di DMT1...58 4.4.7 Le Anemie Sideroblastiche Congenite...58 4.4.8 L’ aceruloplasminemia...59 4.4.9 L’emocromatosi ereditaria...59 4.4.10 Il sovraccarico di ferro acquisito...60 4.4.11 L’iperferritinemia isolata...61 4.4.12 L’iperferritinemia-cataratta...61 4.5 Il ferro e la Sindrome Metabolica ( MetS )...62 4.6 Ferro e IR...64 4.7 Ferro e NAFLD...67 4.8 Ferro e obesità...68 4.9 La terapia di modulazione dei depositi di ferro...69
Bibliografia...71
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Capitolo 1
Il ferro
1.1.
L’importanza del ferro nella fisiologia dei mammiferi.
Il ferro è un metallo di transizione che può assumere diversi stati di ossidazione. Le specie più comuni sono lo ione ferroso bivalente (Fe²+) e lo ione ferrico trivalente (Fe³+). Il potenziale redox del ferro può essere notevolmente modulato dalla natura dei ligandi che vi si legano. Ciò ha importanti implicazioni fisiologiche perché altri stati di ossidazione, come quello dello ione ferril (Fe4+), si possono formare temporaneamente durante le trasformazioni ossidative metallo-mediate. Anche altri metalli di transizione, come rame e manganese, sono idonei a partecipare alle reazioni redox biologiche tuttavia nel corso dell’evoluzione gli organismi hanno scelto il ferro per molteplici motivi. In primis perchè il ferro è il secondo metallo più diffuso sulla crosta terrestre, secondo solo all’alluminio. Inoltre, il ferro può esistere in più stati di ossidazione, che sono essenziali per il trasferimento degli elettroni e tra tutti i metalli di transizione presenta un potenziale ossidoriduttivo molto ampio (da 1000 a -550 mV). Sfruttando gli stati di ossidazione, lo stato dello spin elettronico ed il potenziale redox i sistemi biologici sono in grado di regolare la reattività chimica del ferro per soddisfare le proprie esigenze fisiologiche.
Il ferro è essenziale per gli organismi viventi perché rappresenta un cofattore per diversi enzimi oltre ad essere un costituente fondamentale delle emoproteine e delle proteine non eme.
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Le emoproteine sono coinvolte in numerose funzioni biologiche come il legame, il trasporto ed il metabolismo dell’ossigeno (emoglobine, catalasi e perossidasi), la respirazione cellulare ed il trasporto degli elettroni (citocromi).
Le proteine non eme contenenti il ferro sono importanti per i processi cellulari fondamentali, quali la sintesi del DNA, la proliferazione e il differenziamento cellulare (ribonucleotide riduttasi), la regolazione genica, il metabolismo dei farmaci e la sintesi di steroidi.
All’inizio dell’evoluzione, prima che l’ossigeno diventasse un componente abbondante dell’atmosfera, le cellule anaerobiche acquisirono con facilità il ferro ferroso solubile. Successivamente, l’aumento dell’ossigeno atmosferico provocò l’ossidazione dello ione ferroso a ferrico che risulta essere insolubile nei liquidi acquosi a pH fisiologico. Inoltre, il susseguirsi delle ossidoriduzioni degli ioni ferrosi e ferrici in presenza di H2O2 e O2•-, molecole fisiologicamente
prodotte durante la respirazione aerobica e le reazioni enzimatiche, ha portato alla produzione di radicali idrossilici secondo la reazione di Fenton che, a loro volta, possono attaccare e danneggiare facilmente le macromolecole cellulari. Pertanto, nonostante la sua abbondanza, sia l’acquisizione che il trasporto del ferro rappresentano una sfida per le cellule e per gli organismi a causa della sua bassa solubilità ed elevata tossicità ossidativa. Per superare questi problemi, gli organismi unicellulari come i batteri sintetizzano specifici agenti ferro-chelanti a basso peso molecolare, denominati siderefori, che catturano il ferro extracellulare e lo trasferiscono nella cellula (Hider et al., 2010). Diversamente, le cellule 2ucaristiche dei mammiferi acquisiscono il ferro dall’ambiente extracellulare usando specifiche proteine di trasporto.
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Capitolo 2
Il metabolismo sistemico e cellulare del ferro
2.1
Il metabolismo cellulare del ferro
.
Le cellule hanno sviluppato strategie metaboliche atte all’importazione e all'utilizzo del ferro. Pertanto, la regolazione dell’assorbimento, lo stoccaggio, la circolazione intracellulare e l'utilizzo sono dei processi fondamentali per il mantenimento dell'omeostasi del ferro cellulare. Siccome le membrane cellulari e le tight junctions tra le cellule impediscono il libero passaggio del ferro,le cellule hanno dei trasportatori chaperones e chelanti che ne permettono il passaggio attraverso le membrane.
Con poche eccezioni, la maggior parte di questi trasportatori appartengono alla famiglia dei trasportatori di soluti (SLC, dall’inglese solute carrier). La maggior parte delle cellule acquisiscono il ferro attraverso il legame con la proteina trasferrina (Tf) in circolo, che successivamente si lega al recettore 1 della transferrina (TfR1) (Wang et al., 2011). La Tf, una β-globulina glicoproteica omodimerica di 80 kDa, viene sintetizzata e secreta principalmente dal fegato. Delle quantità variabili vengono prodotte anche nei linfonodi, timo, milza, ghiandole salivari, midollo osseo e testicoli. La Tf è ugualmente distribuita tra plasma e fluidi extracellulari (come linfa e liquido cerebrospinale), lega il ferro in tali fluidi ed ha un’emivita di 8 giorni. La Tf si lega con due molecole di ferro ferrico, con alta affinità (Kd = 10-23 M).
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Sia il legame che il rilascio del ferro, sono accompagnati da un cambiamento conformazionale. Inoltre, l'interazione tra il ferro e la Tf è pH-dipendente difatti, a pH fisiologico plasmatico, la Tf si lega al ferro con alta affinità, mentre l'interazione viene abolita in modo sostanziale a pH acido (<5). In condizioni fisiologiche, solo una frazione di Tf (circa il 30%) viene saturata con il ferro (Figura 1).
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Figura 1. Il metabolismo del ferro cellulare. La maggior parte delle cellule acquisiscono il ferro
da diverse proteine in circolo denominate Transferrine (Tf). L’ holo-Tf carico di ferro si lega al recettore TfR1 sulla superficie cellulare dopodichè il complesso Tf-TfR1 subisce un processo di endocitosi grazie alla cavità rivestita di clatrina. Una pompa protonica acidifica l’endosoma, con il risultato del rilascio del Fe+3, che viene successivamente ridotto ad Fe+2 attraverso lo Steap3 (Six-Transmembrane Epithelial
Antigen of Prostate-3) e poi trasportato attraverso la membrana endosomale al citosol dal DMT1 (Divalent Metal Transporter 1).Il DMT1, facilita anche l’assorbimento del ferro alimentare. L’Apo-Tf viene dapprima riciclato sulla superficie cellulare e poi rilasciato dal TfR1 al plasma per ripetere un altro ciclo. Il ferro acquisito entra nel “pool di ferro labile “citosolico (LIP), che è redox-attivo. Il LIP in seguito viene chelato attraverso il sideroporo intracellulare che facilita il traffico intracellulare del ferro verso i mitocondri grazie ad un recettore non ancora identificato nei processi metabolici (come ad esempio la sintesi dell’eme ed i cluster ferro-zolfo). Il ferro cellulare che non è stato usato, viene immagazzinato legato alla ferritina oppure viene esportato attraverso la ferroportina.
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Il catabolismo della Tf avviene principalmente nel fegato attraverso la degradazione lisosomiale o la filtrazione glomerulare, seguita dal riassorbimento e dalla degradazione nei tubuli renali. Mutazioni nel gene della transferrina possono causare lo sviluppo di gravi anemie. È interessante notare che le cellule non ematopoietiche mostrano un forte sovraccarico di ferro, indicando l'esistenza di meccanismi alternativi per l'assorbimento del ferro cellulare.
Il recettore TfR1 è espresso dalla maggior parte delle cellule ed i suoi livelli sono correlati alle richieste di ferro cellulare. TfR1 è una glicoproteina transmembrana omodimerica con una massa molecolare di 180 kDa, in cui ogni subunità si lega ad una Tf. L'efficienza dell'interazione Tf-recettore dipende dal contenuto di ferro difatti la Tf diferrica mostra una maggiore affinità, la Tf monoferrica ha una affinità intermedia mentre la apo-Tf presenta la minore affinità.
L’endocitosi del complesso Tf-TfR1, è un processo energetico-dipendente che coinvolge la formazione di vescicole ricoperte di clatrina. Attraverso l'azione di una pompa protonica v-ATPasi, l’endosoma viene acidificato ed il successivo cambiamento conformazionale di Tf e TfR1 porta al rilascio del ferro. Dopodichè, il complesso apoTf−TfR1 ritorna sulla superficie cellulare dove poi la Tf si dissocia dal TfR1 (Aisen et al., 2004).
Il Fe3+ rilasciato viene poi ridotto a Fe2+ dall’enzima STEAP3 , un membro della famiglia delle metalloriduttasi. Il Fe²+ viene poi trasportato attraverso la membrana endosomiale nel citosol per mezzo del trasportatore DMT1/SLC11A2 (Divalent Metal Transporter 1/ Solute Carrier family 11 member 2) che si trova nella maggior parte delle cellule o dal suo omologo Nramp1 (natural resistance-associated macrophage protein-1) nei macrofagi. Una volta assimilato, il ferro citosolico viene trasportato ai siti intracellulari per uso locale o per deposito
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legato alla ferritina. La DMT1 è una proteina con duplice attività perchè è in grado di regolare l’omeostasi sia sistemica sia cellulare del ferro.
L’inattivazione della DMT1 nei topi e nell'uomo porta ad una carenza di ferro. Allo stesso modo, si è notato che mutazioni spontanee nell’enzima Steap3 o la sua ablazione genetica nei topi portano verso una mancanza di ferro negli eritroblasti ma non verso una carenza sistemica, suggerendo pertanto l’esistenza di percorsi alternativi per l'assorbimento del ferro. L’eliminazione mirata del gene Tfrc nel topo (che codifica TfR1), promuove la comparsa di una grave anemia che ne causa la morte, ciò indica che la distribuzione Tf-mediata del ferro risulta essere fondamentale per le cellule ematopoietiche.
Si è notato che, i tessuti non ematopoietici normalmente si sviluppano fino al giorno della morte dell’embrione, evidenziando ancora una volta l'esistenza di meccanismi alternativi per la distribuzione del ferro alle cellule nei feti. Negli esseri umani, non sono state descritte mutazioni nel gene TFRC. Tuttavia, una malattia autoimmune-simile con anticorpi per TfR1 può condurre ad una grave anemia. Gli epatociti potrebbero assumere il ferro Tf-legato sia attraverso TfR1 che attraverso l’isoforma TfR2.
La sequenza amminoacidica di quest'ultima è per il 45% simile a quella della TfR1, mentre la TfR2 si differenzia in modo rilevante in termini di distribuzione tissutale, affinità per Tf e regolazione del ferro.
La TfR2 è una glicoproteina transmembrana di tipo II con domini citoplasmatici ed extracellulari, il complesso Tf−TfR2 viene assorbito in modo analogo attraverso l’endocitosi mediata da clatrina. Tuttavia, mentre la TfR1 è quasi espressa in modo ubiquitario, l'espressione della TfR2 è limitata agli epatociti del fegato ed agli eritroblasti differenziati. Inoltre, la TfR2 lega la Tf con un'affinità più bassa di ∼30 rispetto alla TfR1, suggerendo che essa trasporti solo una piccola frazione di ferro assorbito. Inoltre la TfR2 è meno stabile della
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TfR1, infatti viene principalmente degradata attraverso regolazioni post-traduzionali ed è stabilizzata solo dalla Tf diferrica.
Considerando le caratteristiche della TfR2, sembra che la sua più importante funzione sia quella regolatoria. La TfR2 è coinvolta nel rilievo della Tf carica di ferro e nel controllo dell'espressione dell’epcidina. Da uno studio effettuato, è stato scoperto che le mutazioni del gene TFR2 portano verso l’insorgenza dell’emocromatosi non-HFE a causa di un deficit di epcidina negli esseri umani, come avviene nei topi mutanti TfR2(Johnson et al., 2004).
L’epcidina è il principale regolatore dell’omeostasi del ferro. E’ un ormone peptidico con proprietà antimicrobiche, regola le concentrazioni di ferro plasmatico e la distribuzione tissutale del ferro in funzione delle necessità individuali. L’epcidina, difatti regola l’assorbimento del ferro attraverso gli enterociti duodenali ed il rilascio del ferro da parte dei macrofagi.
Questo peptide, viene sintetizzato in prevalenza dagli epatociti e secreto nel sangue, in risposta al sovraccarico di ferro o alle citochine infiammatorie che promuovono un aumento della trascrizione del gene dell’epcidina nel fegato. La sua sintesi, viene inoltre soppressa dall’anemia e dall’ipossia.
Tale ormone, regola in modo inibitorio il rilascio del ferro dai depositi e l’ingresso del ferro attraverso l’epitelio intestinale. Questa azione, si esplica attraverso il legame dell’epcidina con la ferroportina a livello della membrana plasmatica di enterociti, macrofagi, epatociti e di altre cellule che di conseguenza promuovono la sua fosforilazione JaK-dipendente (Janus chinase) e la successiva internalizzione portando alla degradazione lisosomiale della ferroportina stessa. Difatti, l’internalizzazione della ferroportina, mediata dall’epcidina, conduce al legame ed alla attivazione della proteina JaK, che è essenziale per la fosforilazione della ferroportina stessa.
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Con l’internalizzazione a cui segue la degradazione della FPN (ferroportina), il ferro si accumula nei macrofagi ed apporta un aumento della sintesi intracellulare di H-ferritina, in modo da salvaguardare il deposito di ferro.
La ferroportina, rappresenta anche il recettore dell’epcidina, oltre che il principale regolatore cellulare del rilascio di ferro. Un deficit di epcidina, comporta la persistenza della ferroportina sulla membrana cellulare e di conseguenza un aumentato assorbimento di ferro a livello intestinale ed un aumentato rilascio di ferro da parte dei macrofagi deputati al riciclaggio del ferro che proviene dalla distruzione dei globuli rossi invecchiati.
La FPN rappresenta l’unico esportatore di ferro inorganico dei mammiferi. L’NTBI (non-transferrin-bound iron), comprende tutte le forme di ferro plasmatico che si associano con ligandi, diversi dalla Tf.
Lo stesso, non può essere rilevato in condizioni fisiologiche ma emerge in una varietà di sindromi da sovraccarico di ferro quando la capacità legante del ferro della transferrina è saturata o in caso di atransferrinemia. Anche se l’NTBI gioca un ruolo importante nel sovraccarico di ferro nel tessuto emocromatotico, il meccanismo rimane poco conosciuto. I chelanti che mostrano una minore affinità per il ferro rispetto alla transferrina, come la lipocalina 24p3, sembrano essere dei ligandi dell’ NTBI.
La lipocalina 24p3 è una proteina di trasporto che sequestra piccole molecole idrofobiche cariche di ferro o siderofori. È stato scoperto che il ferro che si lega alla 24p3 è essenziale nella morfogenesi epiteliale soprattutto per la nefrogenesi. Tuttavia, i topi privi della 24p3 non manifestano alcuna anomalia nello sviluppo dei reni e apparentemente hanno anche un normale metabolismo del ferro cellulare e sistemico.
Gli esperimenti sui topi knockout con doppia HFE e 24p3 hanno escluso un ruolo per la 24p3 nell'assorbimento dell’NTBI durante il sovraccarico di ferro
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epatico. Diversi studi biochimici e genetici hanno identificato altri potenziali fattori nell'assorbimento dell’NTBI, come il DMT1.
La carenza di ferro migliora in modo significativo l'espressione del DMT1 ed un cambiamento delle sue funzioni favoriscono un’efficace assorbimento del NTBI, suggerendo l'importanza del DMT1 nell'acquisizione del ferro elementare. Inoltre, nel topo microcitico (mk), il DMT1 mutante si comporta come un canale del calcio per facilitare l'assorbimento dello stesso NTBI, una scoperta che può avere implicazioni più ampie nella comprensione del rapporto funzionale tra i trasportatori del ferro ed altri canali ionici.
Sulla base di questi studi, si era ipotizzato infatti che il DMT1 fosse il maggiore agevolatore dell'assorbimento dell’ NTBI. Tuttavia, l'accumulo eccessivo di ferro nei tessuti dei topi privi di DMT1 punta al coinvolgimento di altri elementi (Gunshin et al., 2005).
Un altro candidato è rappresentato dalla proteina di trasporto dello zinco, Zip14/SLC39A14 (come Zrt - e Irt-like protein 14), che facilita la distribuzione del ferro NTBI-mediato nelle colture cellulari. Tuttavia, degli studi sui topi mk suggeriscono che pori transmembrana simili conducono Fe²+ e Ca²+ attraverso le membrane, mentre il coinvolgimento nell’assorbimento del NTBI è stato documentato per i canali di calcio L-type voltage-gated (LVGCCs) ampiamente espressi, detti Cav 1.1-1.4. E’ stato anche scoperto che bloccando i canali del calcio si ha una attenuazione del sovraccarico di ferro che porta ad un miglioramento dell’attività del DMT1.
Tuttavia, sebbene le prove ricavate da studi in vitro sostengono un ruolo dei LVGCCs nella circolazione del ferro, i topi privi di Cav 1.2 e 1.3 non manifestano alterazioni nel metabolismo del ferro.
Insieme, questi studi suggeriscono una ridondanza significativa nei meccanismi per l'assorbimento dell’ NTBI e la mancanza di un singolo percorso esclusivo.
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Le cellule possono anche acquisire il ferro che è in complessi con proteine o piccole molecole. Per esempio, l'internalizzazione della ferritina attraverso i recettori ferritina-specifici, come le immunoglobuline T-cell, le TIM-2 (mucin domain-containing protein-2) o Scara5 (Scavenge receptor family class A, member 5), facilita l'importazione del ferro. Tuttavia, nei topi privi di TIM-2 non vengono riscontrate altre evidenti anomalie nell’omeostasi del ferro. Inoltre, silenziando il recettore H-ferritina SCARA5, si contribuisce molto alla formazione del cancro.
L’eme assorbita, rappresenta anche un’importante fonte di ferro. L'importanza di questa via di assorbimento del ferro, è esemplificata da un miglioramento nell’assorbimento dell’eme che si osserva nello stato carente di ferro. Le cellule sono preposte ad internalizzare l’eme attraverso un processo recettore-dipendente (direttamente) o, indirettamente, con l'ausilio dell’HCP-1(carrier protein 1).
L’HCP-1, conosciuto anche come PCFT (proton-coupled folate transporter), è un membro della famiglia di trasporto dei soluti (SLC46A1), che importa eme o folati in colture cellulari o in ovociti isolati di rana. L’eme importata viene catabolizzata dall’eme ossigenasi 1 e 2 nel reticolo endoplasmatico (ER), mentre il ferro è a sua volta rilasciato nel citoplasma attraverso il DMT1 o il TRPML1 (transient receptor potential mucolipin 1).
Alcuni studi, hanno evidenziato che topi carenti di HCP-1 non presentano una carenza di ferro ma piuttosto dei disturbi nel metabolismo dei folati. Questi risultati inaspettati, considerando il fatto che la carenza di ferro aumenti l'espressione di HCP-1, possono mettere in discussione il ruolo fisiologico ricoperto da questa proteina nell’assorbimento dietetico di eme. L’eme, può essere anche trasportata dai lisosomi verso il citosol attraverso (HRG-1) (response gene-1) (SLC48A1). In sintesi, al fine di soddisfare le loro specifiche esigenze biochimiche, le cellule sono in grado di ottenere il ferro attraverso
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l’ausilio di diversi percorsi che ne garantiscono l’assorbimento(Huang et al., 2010).
2.2. Distribuzione e metabolismo sistemico del ferro
.Il corpo umano contiene ~3 -5 g di ferro. La maggior parte di esso è legato al gruppo eme dell'emoglobina all’interno degli eritrociti (>2 g) o legato alla mioglobina dei muscoli (~300 mg). I macrofagi, la milza, il fegato e il midollo osseo, mantengono una piccola frazione di ferro (~600 mg), mentre il ferro in eccesso viene immagazzinato nel parenchima epatico legato alla ferritina (~1000 mg). Il rimanente ferro si trova legato ad altre proteine cellulari ed enzimi, e rappresenta circa ~ 8 mg di ferro totale (Figura 2).
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Figura 2. L’assorbimento e la distribuzione del ferro nel corpo. I livelli di ferro corporeo sono
mantenuti attraverso l’assorbimento giornaliero di circa 1-2 mg di ferro alimentare, per bilanciare le perdite di una quantità simile di ferro dovuta ad esempio al continuo cambio delle cellule della mucosa e della pelle, e ad emorragie. Circa 4 mg di ferro, si trovano in circolo legati alla Tf, che rappresentano lo 0,1% del ferro corporeo totale. I macrofagi reticoloendoteliali della milza, che recuperano il ferro dai globuli rossi senescenti, forniscono il ferro per la sintesi di nuovi globuli rossi. La Tf libera il ferro per lo sviluppo dei precursori eritroidi e per gli altri siti che usano il ferro. Gli epatociti del fegato depositano il ferro nelle strutture globulari della ferritina. Durante la gravidanza, 250 mg di ferro sono trasportati attraverso la placenta fino al feto. La distribuzione del ferro nel corpo è alterata sia nella carenza che nel sovraccarico di ferro.
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Il ferro viene consegnato agli eritroblasti ed alla maggior parte dei tessuti attraverso la transferrina (Tf) che trasporta ~ 3 mg di metallo allo stato stazionario. Il ferro nel plasma è prevalentemente alimentato dai macrofagi reticoloendoteliali ed in piccola parte (~ 1-2 mg/al giorno), per assorbimento, dalla dieta. I macrofagi acquisiscono il ferro soprattutto attraverso l’eritrofagocitosi, l’internalizzazione dell’eme o del ferro inorganico o dal lume intestinale.
Il ferro citosolico viene usato per la produzione delle proteine contenenti il ferro e attraverso i mitocondri, per la biosintesi dell’eme e dei cluster Fe-S. Quando sia i depositi di ferro nel corpo che l’eritropoiesi sono adeguati, si ha una riduzione dell’esportazione di ferro dagli enterociti anche grazie all’ingresso mediato dall’epcidina ed alla degradazione della ferroportina mentre invece il ferro viene immagazzinato nella ferritina.
Il meccanismo di internalizzazione dell’eme non è ben definito e può coinvolgere sia il trasporto diretto di eme sia l’endocitosi mediata da recettori. I macrofagi e gli enterociti catabolizzano l’eme in una reazione catalizzata dall’eme ossigenasi -1 e-2 (rispettivamente HO-1 e HO-2), che libera il ferro inorganico.
L'assorbimento del ferro inorganico avviene grazie alla riduzione del Fe³+ ad Fe²+ ad opera dell’ascorbato e/o ferroriduttasi che sono associati alle membrane, come ad esempio il citocromo b duodenale (DcytB9) che, a sua volta, partecipa al trasporto del Fe²+ attraverso la membrana apicale grazie al DMT1/SLC11A2, noto anche come NRAMP2 (natural resistance-associated macrophage protein 2) o anche come DCT1 (divalent cation transporter).
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Macrofagi ed enterociti esportano Fe²+ nel plasma attraverso il trasportatore di
membrana, ferroportina/SLC40A1, in un processo associato alla ri-ossidazione del Fe²+ a Fe³+.
Questo processo viene mediato dalla ceruloplasmina ferrossidasi in circolo o dal suo omologo, l’efestina, che è espressa sulla membrana basolaterale degli enterociti duodenali ed interagisce fisicamente con la ferroportina.Il ferro viene poi inglobato dalla apotransferrina (Apo-Tf) plasmatica, che lo mantiene in uno stato redox inerte e lo consegna ai tessuti. La Tf contiene due siti di legame per lo ione ferrico che viene, in condizioni fisiologiche, saturata in modo parziale (30%) dal ferro.
La concentrazione della Tf diferrica nel plasma è di ∼5 µmol/L, che in modo approssimativo corrispondono ad un decimo della Tf totale in circolo. L’eccesso di apo-Tf insatura consente un efficiente tamponamento dei livelli di ferro nel plasma ed ostacola l’aumento dell’NTBI , che è ricavato dalle cellule parenchimali tissutali e promuove il danno ossidativo.
L’NTBI viene prodotto negli stati di sovraccarico di ferro, come nell'emocromatosi ereditaria, dove la transferrina viene saturata, in modo graduale, dal ferro perdendo il suo potere tampone (Brissot et al., 2012).
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2.3 Trafficking del ferro cellulare.
Uno degli aspetti meno compresi del metabolismo cellulare del ferro è il trafficking di ferro all'interno della cellula. Generalmente, si ritiene che il ferro assunto dalla cellula venga instradato verso i mitocondri.
Fino a poco tempo fa, non erano ancora note le proteine che regolavano il passaggio del ferro citosolico ai mitocondri. Il ferro assorbito dai percorsi Tf-dipendenti o Tf- inTf-dipendenti si presume che entri in un pool intermediario labile o in un pool di ferro labile (LIP). Il LIP viene definito in letteratura come ferro "scambiabile", "regolatorio" o "chelabile" perché la sua presenza è stata documentata utilizzando chelanti metallici.
Il LIP è pertanto un pool a basso peso molecolare di ferro chelato debolmente, che comprende sia Fe²+ che Fe³+ rappresentando una frazione della quantità totale di ferro cellulare (~3 -5 %). L'altra fonte di ferro per questo pool è rappresentata dalla degradazione delle proteine contenenti il ferro che siano eme o non eme.
Il ferro nel LIP, si trova in uno stato di equilibrio ed è disponibile per legare diversi chelanti a basso peso molecolare, come anioni organici (fosfati, citrati, e carbossilati) e ligandi polifunzionali (polipeptidi e siderofori).
Anche gli organelli contengono LIP, che si stima abbia una concentrazione da ~6 a 16 µM. I mitocondri sono i principali consumatori di ferro cellulare.
Anche se il ferro mitocondriale è in prevalenza legato alle proteine o all’eme, all'interno dell’organello in colture di epatociti e cardiomiociti vi è stato rilevato anche un pool di ferro chelabile. Si suppone un possibile aumento delle dimensioni del LIP mitocondriale in determinate condizioni patologiche in cui è indebolita l’esportazione dell’eme.
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Una sottopopolazione di endosomi e lisosomi contiene anche una grande quantità di LIP con una concentrazione stimata di 16 µM che potrebbe derivare dalla degradazione delle proteine di trasporto del ferro. In base alle diverse necessità, il LIP è prontamente disponibile per l'uso del ferro a livello intracellulare sebbene possa anche contribuire agli effetti negativi del ferro stesso come fonte di ioni redox-attivi in base alla reazione di Fenton.
Inoltre, il LIP è implicato anche nell’induzione dell'apoptosi. Per cui, la carenza di ferro nella cellula porta all'apoptosi, effetti simili sono stati osservati bersagliando il LIP con chelanti chimici come la deferoxamina (DFO) o chelanti biologici come la lipocalina 24p3.
Tuttavia, l'apoptosi indotta dai chelanti può essere soppressa attraverso la somministrazione esogena del ferro (Richardson et al., 2010). I mitocondri sono fondamentali per la regolazione del metabolismo del ferro cellulare infatti la maggior parte del ferro importato nella cellula viene usato all'interno di questo organello per la sintesi dell’eme e dei cluster ferro-zolfo (ISCs, Iron Sulfur Clusters).
Poco conosciute sono le vie di trasporto del ferro intracellulare che facilitano l'importazione del ferro nel mitocondrio.
Questo è un tema importante poiché il ferro nella sua forma libera deve essere protetto e scortato fino ai siti di utilizzo. Fino a poco tempo fa, la natura e l'identità delle molecole chaperone di questi meccanismi erano completamente ignote.
Tuttavia, i primi studi hanno indicato l'esistenza di composti leganti il ferro a basso peso molecolare o molecole sideroforo-simili che sono in grado di legare il ferro nelle cellule. È interessante notare che il ferro legato alle molecole sideroforo-simili rappresenta un bersaglio per le proteine di trasporto come 24p3.
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La lipocalina 24p3, nota anche come lipocalina 2 (Lcn 2) o siderocalina, è un membro della famiglia delle proteine lipocalina. Questa famiglia comprende più di 20 piccole proteine contenenti un motivo eight-stranded β-barrel altamente conservato che a sua volta racchiude una cavità al cui interno si trova un filamento continuo antiparallelo β-sheet. La cavità lega, trasporta e distribuisce piccoli ligandi molecolari.
La lipocalina 24p3 lega il ferro attraverso un cofattore ed influenza molte risposte cellulari. Diversi studi hanno dimostrato l'associazione tra la 24p3 e le molecole siderofori-simili. E’ stato inoltre proposto che, il ferro distribuito o sequestrato dalla 24p3 sia fondamentale per la nefrogenesi e l’apoptosi mediata. Tuttavia, i topi mancanti della 24p3 evidenziano uno sviluppo renale normale e senza squilibri evidenti nel metabolismo del ferro ma sono anche caratterizzati da anomalie multiple nelle cellule ematopoietiche.
Uno studio recente, ha identificato il cofattore 2,5-DHBA (2,5-dihydroxy benzoic acid) come agevolatore del carico di ferro sulla 24p3. A differenza della 24p3, la maggior parte dei tessuti sintetizza 2,5-DHBA ipotizzando pertanto che abbia altre funzioni oltre al caricamento del ferro sulla 24p3.
Le cellule eucariotiche prive di siderofori,come ad esempio il modello zebrafish o il lievito, non riescono a sintetizzare l’eme suggerendo pertanto che il 2,5-DHBA faciliti anche l'assorbimento mitocondriale del ferro. I mitocondri sono resti evolutivi di batteri aerobici in grado di fornire l'energia alla cellula ospite sottoforma di ATP generata in modo ossigeno-dipendente.
Il ferro è parte integrante di tutte le subunità proteiche coinvolte nella catena respiratoria. Così, la presenza di una molecola filogeneticamente conservata sideroforo-simile, la cui struttura e la biogenesi sono evolutivamente legate ai siderofori batterici, ne rappresenta un ottimo elemento.
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Anche se è stata identificata una molecola siderofora-simile nei mammiferi, i trasportatori o i recettori che mediano l'assorbimento mitocondriale del ferro restano sconosciuti. Sono stati segnalati altri chaperones citosolici che fanno circolare il ferro nella cellula.
Ad esempio, le monotiol glutaredoxine, Grx3 e Grx4, giocano un ruolo importante nel trafficking intracellulare del ferro, e la loro assenza compromette la sua importazione mitocondriale. Recentemente, è stato studiato il meccanismo di ingresso del ferro nei mitocondri.
Il ferro deve attraversare entrambe le membrane mitocondriali, sia esterna che interna, fino al sito della sintesi dell'eme, la matrice.
I trasportatori della membrana mitocondriale esterna che importano il ferro sono stati identificati mediante lo screening computazionale, che ha fornito diversi membri della famiglia SLC, vale a dire, SLC25a39 e SLC22A4 così come un trasportatore non-SLC, TMEM14C.
Tutti questi geni sono costantemente e specificamente co-espressi con geni che codificano gli enzimi della via di sintesi dell'eme. È interessante notare che, i membri della famiglia SLC facilitano anche l'importazione del ferro attraverso la membrana mitocondriale interna.
Degne di nota sono SLC25A37 o Mitoferrina-1 (Mfrn1) e SLC25A38 o Mitoferrina-2 (Mfrn2), che sono fondamentali per l'importazione del ferro mitocondriale all’interno delle cellule sia eritroidi che non eritroidi. Anche se la Mitoferrina-1 e la Mitoferrina-2 sono altamente omologhe, non mostrano nessuna ridondanza funzionale. Perciò, la sovra-espressione della Mitoferrina-2 non può far fronte alla carenza di ferro mitocondriale causata dalla deplezione della Mitoferrina-1.
L’ablazione genetica della Mfrn1 promuove una letalità embrionale a causa di una difettosa emoglobinizzazione. Tuttavia, l’ablazione genetica della Mfrn1 nel
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sistema ematopoietico ha portato verso la formazione di eritroblasti difettosi, che provocano l’anemia.
Al contrario, l’eliminazione mirata della Mfrn1 negli epatociti del fegato non si riscontra in nessuna anomalia fenotipica o biochimica in condizioni normali (Troadec et al., 2011).
Nonostante questi progressi, resta irrisolto il modo in cui il ferro viene trasportato attraverso la membrana mitocondriale esterna. Il trasporto del ferro intracellulare dipende dai siderofori, esso è indispensabile per la biogenesi dell’eme nel mitocondrio.
Tuttavia ,resta ignoto il rapporto tra la famiglia SLC dei trasportatori mitocondriali ed i siderofori. Per spiegare questa relazione, è stato proposto il modello "kiss-and-run" secondo cui il ferro Tf-legato viene direttamente consegnato ai mitocondri ed agli endosomi con Tf . Tuttavia, non sono ancora noti i mediatori che potrebbero facilitare questo processo.
Infine, le proteine regolatorie del ferro IRPs, la cui funzione primaria è quella di regolare l’omeostasi del ferro cellulare sono fondamentali anche nell’assicurare un adeguato approvvigionamento di ferro per i mitocondri almeno negli epatociti del fegato. Le limitazioni ISC o addirittura l’insufficienza dell’eme vengono percepite come una carenza di ferro mitocondriale e queste condizionifavoriscono l’attivazione delle IRPs nel citoplasma.
Le IRPs attivate a sua volta aumentano il livello di assorbimento del ferro cellulare e contemporaneamente riducono la portata di stoccaggio e l'esportazione del ferro.Nella Figura 3 viene rappresentata la cellulla con i ruoli delle proteine codificate dall’mRNA IRE-containing (red lettering).
Il ferro che è stato recuperato sia da TfR1 che da DMT1 entra a far parte del pool libero di ferro labile citosolico, che a sua volta si pensa sia costituito dal Fe2+ legato alle molecole di piccolo peso molecolare.
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Le proteine IRP percepiscono il ferro in questo pool e regolano la traduzione del 5’ mRNAs IRE-containing[H-ferritina ed L-ferritina, eALAS (erythroid aminolevulinate synthase), aconitasi-(m)mitocondriale e ferroportina)]. eALAS serve come un enzima che limita la velocità della sintesi dell’eme nei precursori eritroidi. L’aconitasi mitocondriale è un enzima del ciclo del TCA che richiede un cluster [4Fe-4S] per esplicare la sua l’attività. Il ferro che non stato è usato o immagazzinato nella ferritina viene esportato dalla ferroportina. L’esportazione del ferro dalle cellule è associato all’ossidazione del ferro attraverso l’epaestina legata alla membrana o alla CP (serum multicopper oxidase ceruloplasmin) (Wallander et al., 2006).
Figura 3. Il controllo dell’omeostasi cellulare del ferro nei mammiferi attraverso la rete regolatoria IRE-IRP.
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Capitolo 3
3.1 Le Proteine regolatrici del ferro.
Il mantenimento dell'omeostasi del ferro nell’organismo è principalmente mediato dall'ormone epatico epcidina, che inibisce il riciclo del ferro nel sangue e l'assorbimento del ferro alimentare nel duodeno, impedendo il sovraccarico del ferro sistemico. Inoltre, il fattore indotto dall’ipossia HIF (hypoxia-inducibile factor) 1ɑ e 2ɑ può aumentare l'assorbimento intestinale di ferro, l'assorbimento del ferro nei progenitori eritroidi, la sintesi dell’eme ed anche sopprimere la produzione di epcidina. Tutte queste azioni sono atte a garantire un adeguato approvvigionamento di ferro per sostenere l’eritropoiesi. I meccanismi che mantengono l'omeostasi del ferro a livello di una singola cellula si distinguono in base alla regolazione del ferro sistemico. Per garantire un contenuto adeguato di ferro, le cellule eucariotiche ne regolano i livelli attraverso l'assorbimento e l’esportazione.
Il ferro entra nella cellula dal flusso sanguigno in un complesso contenente transferrina, che si lega al TfR1(transferrin receptor 1) sulla membrana plasmatica, seguito da endocitosi mediata da recettori, acidificazione delle vescicole endosomali, riduzione del ferro nella sua forma solubile dalla metalloriduttasi STEAP3, e rilascio del ferro nel citosol attraverso il DMT1.
Nel citoplasma, il ferro viene incorporato negli enzimi che contengono ferro ed importato nei mitocondri per la biosintesi del cluster ferro-zolfo (Fe/S) e dell'eme, o conservato in un complesso con ferritina. Infine, il ferro può uscire dalla cellula attraverso l’Fpn1 (membrane transporter ferroportin 1) ed associato alla ceruloplasmina metalloriduttasi.
La stretta regolazione che si instaura tra importazione, esportazione e deposito del ferro sono fondamentali per prevenirne la carenza ed il danneggiamento delle
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funzioni cellulari vitali o il sovraccarico di ferro, che portano alla formazione di radicali tossici attraverso una reazione di Fenton, che è catalizzata dal ferro stesso. Le IRP1/2 (mammalian iron-regulatory proteins 1/2) funzionano come regolatori centrali della risposta alla carenza di ferro nella cellula attraverso la modulazione della stabilità dell'mRNA e la traduzione delle IRP (iron regulatory proteins). Negli stati saturi di ferro, l’IRP1 possiede un centro Fe/S e funziona come una aconitasi citosolica (Figura 4A).
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Figura 4. Percorso di acquisizione del ferro nei mammiferi e nel lievito. (A) Nei mammiferi le proteine
IRP1/2 del ferro vengono attivate in risposta alla carenza di ferro. In condizioni sature di ferro, la proteina IRP1 funziona come una aconitasi citosolica , mentre la proteina IRP2 viene degradata dal proteosoma. In condizioni di deficit di ferro la IRP1 viene attivata attraverso la perdita del suo cluster ferro-zolfo e viene stabilizzata la proteina IRP2. In seguito, entrambe le IRP1/2 si legano alle IREs nelle sequenze 3’ e 5’ non tradotte (UTRs) dell’ mRNA bersaglio. Il legame con la sequenza 3’ UTR stabilizza l’mRNA bersaglio del TfR1 che è responsabile dell’assorbimento del ferro. Legandosi alla sequenza 5’UTR, arresta la traduzione dell’mRNA bersaglio sopprimendo le proteine coinvolte nell’esportazione [ferroportina 1 (FPN1) e deposito del ferro (ferritina). In generale, le proteine IRP1/2 ripristinano l’equilibrio del ferro cellulare attraverso un aumento dell’importazione, una mobilizzazione dei suoi depositi ed una riduzione della sua esportazione. (B) Nel lievito con deficit di ferro, i fattori di trascrizione Aft1/2 si spostano dal citosol nel nucleo ed attivano la trascrizione dell’iron regulon che codifica i geni necessari per l’assorbimento ed il rilascio del ferro dai depositi intracellulari, aumentando in modo efficace il contenuto intracellulare di ferro (Abbreviazioni : Aft1/2 , activator of ferrous transport 1/2 ; FBLX5, F-box/LRR-repeat protein 5).
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La proteina IRP2, pur essendo priva sia dell’attività aconitasica che del centro Fe/S, viene tuttavia degradata dall’ubiquitina ligasi FBXL5 sensibile al ferro. L’attività delle IRP1/2 viene soppressa nelle cellule con adeguate riserve di ferro. Tuttavia, una riduzione del ferro cellulare attiva l’IRP1 attraverso la perdita del suo centro Fe/S e stabilizza la proteina IRP2 attraverso la degradazione del suo regolatore negativo, FBXL5, che perde il suo centro di ferro diventando così un bersaglio del proteo soma.
Dopo l'attivazione, le IRP1/2 interagiscono con le IRE (iron-response elements) nella sequenza 5’ e 3’ non tradotte (UTRs) di diverse molecole di mRNA, modificandone la loro stabilità o traduzione. In particolare, l'attivazione della risposta delle IRP1/2 migliora l'assorbimento del ferro nella cellula attraverso il legame e la stabilizzazione della TfR1 mRNA, che ospita varie IREs nella sua sequenza 3’UTR.
Al contrario, il legame delle IRPs con la sequenza 5’UTR sopprime la traduzione di molte mRNA, tra cui Fpn1 e ferritina, inibendo così l'esportazione del ferro dalla cellula e promuovendo invece il rilascio del ferro di deposito (Figura 4A). Un percorso regolatorio concettualmente simile esiste nel lievito Saccharomyces
cerevisiae, dove la mancanza di ferro induce la traslocazione dei fattori di
trascrizione Aft1/2p (yeast transcription factors) dal citoplasma nel nucleo, che a sua volta sovraregola la trascrizione del cosiddetto iron regulon che comprende i geni coinvolti nell’importazione del ferro ridotto e mediato dal sideroforo (Figura 4B). Nel complesso, le proteine IRP1/2 ed i meccanismi Aft1/2p del lievito hanno il compito di ripristinare l'equilibrio dei livelli di ferro, aumentandone l’importazione ed il rilascio dai depositi cellulari, anche se nei mammiferi questo processo è regolato su un livello post-trascrizionale, mentre l’altro meccanismo del lievito viene regolato modulando invece la trascrizione genica.
Anche se il sistema IRP1/2 è rimasto l'unico percorso di regolazione del ferro conosciuto nelle cellule eucariotiche, il meccanismo con cui le cellule che necessitano di ferro sopravvivono in condizioni di deficit di ferro non può essere
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completamente spiegato dalle azioni di IRP1/2, suggerendo l'esistenza di un altro sistema di regolazione del ferro.
Le IRPs regolano anche altre mRNA con sequenze 5′ IREs , tra cui l’aconitasi mitocondriale (ACO2, conosciuta anche come m-acon nel ciclo degli acidi tricarbossilici), la sintasi eritroide amminolevulinate (ALAS2, nota anche come eALAS, nella biosintesi dell'eme), la trascrizione del fattore HIF-2α (noto anche come EPAS1 nell’ipossia) e la proteina precursore della β-amiloide (APP, nel morbo di Alzheimer). Le IRPs regolano anche mRNA con sequenze 3′ IREs, che comprendono DMT1, CDC14A (fosfatasi mitotica), CDC42-binding protein kinase α (nota anche come MRCKα, nel citoscheletro) e HAO1 (hydroxyacid oxidase 1, peroxisomal enzyme).
Più di recente, è stato usato un approccio transcriptome-wide per identificare 35 nuove presunte mRNA IRE-containing, alcune delle quali esclusività solo per l’IRP1 o l’IRP2. Di ognuna di queste mRNA che contengono una IRE, devono ancora essere determinati i ruoli di molte di queste IREs in vivo. La presenza delle IREs in una varietà di mRNA suggerisce che la regolazione mediata dalle IRP si ritrova anche in altri processi all’infuori dell’omeostasi del ferro (Philpott et al., 2008).
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3.2 I Recenti progressi nella regolazione dell’IRP1.
Anche se le proteine IRP1 e IRP2 si assomigliano per circa il 64%, legano l'RNA e vengono entrambe regolate dal ferro, pur differenziandosi in diversi modi. Innanzitutto, la IRP1 è una proteina bifunzionale che si lega all’IRE con elevata affinità nella sua forma di apoproteina o nella sua isoforma citosolica dell’enzima aconitasi (c-acon) ferro-zolfo (Fe-S) (Fig. 5). La formazione e la perdita del cluster [4Fe-4S] regola il legame con l’RNA e crea un’unica correlazione tra l’IRP1 e la biogenesi del cluster Fe-S. In secondo luogo, la IRP1 interviene sia nella risposta adattativa alla disponibilità di ossigeno e sia nella percezione delle ROS (reactive oxygen species) o delle RNS (reactive nitrogen species).
In ultimo, l’IRP1 viene controllata da diversi meccanismi ferro-dipendenti, compresa la degradazione mirata della proteina per limitare l'accumulo della forma RNA-binding dell’IRP. Inoltre, la fosforilazione di IRP1 a livello della serina 138 richiede che venga regolato attraverso il ferro.
Diversamente dall’IRP1, la proteina IRP2 manca sia del cluster [4Fe-4S] che dell’attività aconitasica, pur funzionando come una proteina che si lega all’RNA. La IRP2 viene regolata soprattutto attraverso la degradazione ferro-mediata. Per cui, l’IRP1 risponde ad entrambi i segnali ferro-dipendenti- e ferro-indipendenti, che controllano la sua funzione attraverso molteplici meccanismi allo scopo di conservare l'attività IRE-binding all’interno di un intervallo che consenta il mantenimento ottimale dell’omeostasi del ferro cellulare (Wingert et al., 2005).
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Figura 5. I meccanismi ferro-dipendenti e ferro-indipendenti per la regolazione dell’IRP1. L’IRP1 può essere regolato
attraverso dei meccanismi dipendenti o indipendenti dal cluster [4Fe-4S]. Nel percorso cluster-dipendente, l’IRP1 svolge un duplice ruolo sia come proteina che si lega all’IRE con elevata affinità in assenza del cluster [4Fe-4S] o come una c-aconitasi quando il cluster [4Fe-4S è assemblato. La forma c-c-aconitasi non lega l’RNA. Il cluster [4Fe-4] è accessibile ai cluster perturbants di basso peso molecolare, che comprendono sia le specie ROS, come ad esempio O2•-, H2O2 che le
specie RNS, come ad esempio NO• o ONOO-. L’ipossia, stabilizza la forma c-aconitasi attraverso la riduzione del livello
di ossigeno o dei ROS. L’IRP1 può essere fosforilato in corrispondenza della S138. La presenza di IRP1 phosphomimetic mutants, indica che il cluster [4Fe-4S] può essere assemblato e la proteina mostra attività aconitasica; tuttavia, il cluster Fe-S è molto più sensibile alla distruzione attraverso il perossido di idrogeno e di ossigeno. Il ferro stimola la degradazione FBXL5-mediata dei phosphomimetic mutants dell’IRP1 S138 ed delle IRP1 non fosforilati quando la biogenesi del cluster Fe-S è compromessa (Wallander et al., 2006).
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3.3 La regolazione dell’attivià RNA-binding dell’IRP1 attraverso il
cluster 4Fe- 4S.
Il ruolo chiave del cluster[4Fe-4S] di IRP1 nel controllo dell’attività RNA-binding fornisce un mezzo per collegare i vari percorsi cellulari coinvolti nella formazione di questi cofattori per lo stato del ferro cellulare.
Negli ultimi anni, molti studi si sono focalizzati sulla comprensione del meccanismo e della biogenesi del cluster Fe-S negli organismi e sulla loro disfunzione nella malattia umana. In breve, gli studi effettuati indicano che la via principale per la biogenesi dei cluster Fe-S e per il loro inserimento nelle proteine citosoliche, come ad esempio la proteina IRP1, indirizza il ferro verso i mitocondri dove viene importato attraverso l'azione della mitoferrina. Si forma un cluster Fe-S transitorio sulla proteina scaffold ISCU attraverso l'azione del ferro, che si è legato alla proteina fratassina ed al sulfide, derivati dalla cisteina tramite la NFS1(cysteine desulfurase) e dal suo partner ISD11.
Le attività del meccanismo di biogenesi dei cluster Fe-S mitocondriali associati all’esportazione dei componenti del meccanismo (ad es.: ABCB7), sono necessarie per l'attivazione dell’assemblaggio del cluster Fe-S citosolico (CIA).
Gli approcci genetici, che fanno uso della IRP1 espressi nel lievito, hanno portato alla scoperta del primo fattore CIA, Cfd1. Ulteriori approfondimenti, soprattutto nel lievito, hanno portato all’identificazione di Nbp35 che insieme a Cfd1 forma l’iniziale scaffold Fe-S per la formazione del cluster citosolico con il supporto di DRE2 e TAH18.
Il trasferimento del cluster labile da Cfd1/Nbp35 ad alcune apoproteine bersaglio richiede l'eteromero Nar1/CIA1 mentre per gli altri è sufficiente Nbp35. È interessante notare che, recenti studi hanno iniziato ad identificare i "fattori di specificità" che hanno come bersaglio specifiche proteine apoFe-S (ad es. il complesso 1).
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In ogni caso, non sono ancora stati scoperti altri diversi percorsi per la biogenesi dei cluster Fe-S coinvolti nei processi sensoriali e regolatori delle proteine Fe-S nelle cellule eucariotiche, come per esempio l’IRP1. Soprattutto attraverso l’uso di approcci knockdown RNAi-based, sembra che la biogenesi dei cluster Fe-S influenzi sia la percezione che la distribuzione del ferro nelle cellule mammifere.
La distruzione di alcuni componenti che intervengono nella biogenesi mitocondriale S, come ad esempio la NFS1 (cysteine desulfurase) ed il suo partner ISD11, la Fe-S scaffold IFe-SCU ed IFe-SCA, il ferro che si lega alla proteina fratassina, la glutaredoxin 5, la proteina chaperone HSC20 e le ferrodossine 1 e 2 donatrici di elettroni, alterano l'attività delle proteine mitocondriali e citosoliche e molto probabilmente anche delle proteine nucleari Fe-S nelle cellule.
Di conseguenza, la riduzione dell'attività nella c-acon si riflette nell’attivazione dell’IRP1 che è associata ad un aumento della TfR1 e ad una riduzione dell'espressione della ferritina. Il fatto che la IRP2 sia stabilizzata, suggerisce una carenza generale di ferro citosolico.
Mentre l'aumento della TfR1 e la repressione della ferritina indotta dall’attivazione della IRP potrebbe riflettere l’esistenza di un meccanismo di compensazione per combattere la carenza di ferro citosolico, l'incapacità di impedire un inappropriato accumulo di ferro in caso di un eccesso di ferro, riflette l'incapacità di sottoregolare l’attività delle IRP che potrebbe essere citotossica.
E’ stato anche notato che la cattiva distribuzione del ferro cellulare caratterizzata da depositi anomali di ferro e di sovraccarico mitocondriale, sono in relazione con la carenza di ferro citosolico quando la biogenesi mitocondriale Fe-S è compromessa. Simili modifiche sono state osservate anche nel lievito.
Questi studi confermano che il concetto che la biogenesi del cluster Fe-S citosolico dipende dalla formazione del complesso mitocondriale, che è attivo nelle cellule
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eucariotiche, e mostrano anche che conseguenze che possono derivare da una alterata biogenesi mitocondriale dei centri Fe-S.
È stato esaminato anche l'impatto che provoca una alterata biogenesi del cluster Fe-S citosolico sulla IRP1(Sheftel et al., 2010). La riduzione di NUBP1 e NAR1 danneggia in modo specifico le proteine citosoliche Fe-S, tra cui la c-acon ed altre. Contemporaneamente, l'attivazione della IRP1 provoca un aumento della TfR1 ed una riduzione dell'espressione della ferritina.
È interessante notare che la IRP2 non viene influenzata questo suggerisce che, quando la biogenesi mitocondriale Fe-S è compromessa, la risposta della IRP2 è una risposta secondaria dovuta alla cattiva distribuzione del ferro cellulare.
La scoperta che la IRP2 è stabilizzata nelle cellule carenti di ABCB7, può riflettere un effetto feedback sulla formazione del cluster Fe-S mitocondriale o sul metabolismo del ferro. La soppressione di ABCB7 sull’omologa cellula di lievito porta ad una distribuzione anomala del ferro. Nel complesso questi studi suggeriscono che a differenza della IRP1, la IRP2 non percepisce il flusso di ferro attraverso la via di biogenesi del centro Fe-S citosolico.
Studi eziologici condotti sulla atassia ereditaria (FA) forniscono l'esempio più comprensibile della relazione che intercorre tra la biogenesi del cluster Fe-S e le alterazioni delle funzioni delle IRP. L’atassia ereditaria è la più comune forma di atassia causata soprattutto da un’alterazione nel gene della fratassina, che causa una riduzione dell’espressione di questa piccola proteina mitocondriale acida.
La fratassina si lega ad un complesso contenente la proteina ISCU Fe-S scaffold, denominata cysteine desulfurase NFS1, ed il suo partner ISD11. In un altro studio è stato evidenziato che una piccola porzione di fratassina funzioni anche nel citosol dove interagisce con la IRP1 facilitando la conversione a c-acon.
A livello cellulare, la FA è caratterizzata da una perdita delle attività delle proteine mitocondriali, citosoliche e nucleari Fe-S, da un sovraccarico di ferro mitocondriale e da segni di deficit di ferro citosolico.
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L’attivazione di entrambe le IRPs, si associa ad una riduzione della ferritina e ad un aumento dell'espressione di TfR1. Inoltre, viene ridotta l'espressione della ferroportina come esportatrice di ferro contribuendo ulteriormente alla distribuzione anomala del ferro e presumibilmente allo stress ossidativo osservato nella FA.
E’ interessante notare che, la carenza di fratassina è associata ad una riduzione degli altri componenti del meccanismo mitocondriale del cluster Fe-S, comprese ISCU e NFS1, ed anche a enzimi difettosi che intervengono nella sintesi dell’eme. Il fatto che l'espressione della fratassina si riduca in caso di carenza di ferro, suggerisce che l'induzione della carenza di ferro citosolico dovuta ad una bassa biogenesi mitocondriale del cluster Fe-S potrebbe essere amplificata attraverso una riduzione dell’espressione della fratassina.
Un dato importante è rappresentato dal fatto che le aconitasi hanno una diversa sensibilità nei confronti dei ROS e la c-acon si è mostrata molto resistente. Inoltre alcune ricerche hanno dimostrato che sia NO che il suo prodotto reattivo ONOO possono facilitare la conversione di c-acon ad IRP1. NO ha anche la capacità di influenzare l’IRP2, ma il meccanismo per questa regolazione e l'impatto sul metabolismo del ferro non è ancora del tutto chiarito. Studi recenti, che hanno fatto uso di topi privi di IRP1 o di IRP2, hanno dimostrato che la IRP1 è unicamente responsabile delle alterazioni nel metabolismo del ferro dei macrofagi in risposta all’NO. Inoltre, l'attivazione NO-dipendente della IRP1 potrebbe migliorare il deposito anomalo di ferro nel modello IRP2 knock-out attraverso la repressione dell’espressione della ferritina. La perdita del cluster Fe-S dalle aconitasi può essere avviata dal superossido che porta alla formazione del [3Fe-4S], una forma che non si lega all’RNA (Stys et al., 2011).
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3.4 La Regolazione del ferro in seguito alla degradazione della
proteina IRP1.
I primi studi sul meccanismo di regolazione della IRP1 attraverso il ferro hanno suggerito che la degradazione della proteina è il principale meccanismo di inattivazione. In seguito è stato scoperto che IRP1 esiste in due forme; una forma che lega l’RNA e una forma che è un’isoforma citosolica dell’aconitasi. Lo switch tra le due forme si verifica in seguito all'inserimento del cluster [4Fe-4S], meccanismo regolato dal legame all’RNA. Tale meccanismo “Fe-S switch” è stato ampiamente accettato come il principale meccanismo implicato nel controllo dell’attività della IRP1 legante l’RNA. Infatti i livelli della proteina IRP1/c-acon non cambiano in funzione dei livelli di ferro. In molti casi, tuttavia, c-acon è in quantità superiore rispetto a IRP1 e un pool più stabile di c-acon potrebbe mascherare i cambiamenti ferro-dipendenti in caso di eccesso di IRP1. Nelle gravi carenze di ferro alimentare, si è riscontrato un aumento dell’attività di IRP1 RNA-legante, in cui è stata reclutata una piccola parte del pool c-acon. Alcuni studi condotti su modelli ingegnerizzati hanno evidenziato come la stabilità della IRP1 è regolata dal ferro e come la degradazione della IRP1 mediata dal ferro sia un meccanismo di compensazione per evitare un eccesso di attività RNA-legante quando il meccanismo a “switch” viene impedito sperimentalmente. L’importanza del meccanismo “switch” per la funzione della IRP1 è stato ulteriormente suffragato dalla constatazione che la ligasi FBXL5 E3, che degrada le IRP2, agisce anche sulla IRP1.
Alla luce di queste scoperte, è interessante notare che laddove la biogenesi del cluster Fe-S sia compromessa, i livelli della proteina IRP1 diminuiscono in modo significativo. In queste condizioni, la proteina IRP1 può essere stabilizzata mediante la chelazione del ferro, suggerendo che la perdita della IRP1 non è semplicemente dovuta all’instabilità di un’apopoproteina ma invece è parte di un secondo meccanismo che dipende dal ferro per controllare l’accumulo dell’attività IRP1
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RNA-legante. Un’anomala biogenesi del Fe-S mitocondriale porta ad una carenza di ferro citosolico, riducendo presumibilmente l’attività della FBXL5 come evidenziato dall’aumento dei livelli della proteina IRP2. Indipendentemente dal meccanismo, l’attività RNA-legante delle proteine IRP1 e IRP2 sale a livelli patologici, quando la formazione del cluster Fe-S è compromessa, inoltre rischia di essere influenzata dall'eccesso di c-acon nella misura in cui FBXL5 viene inattivato (Salahudeen et al., 2009).
3.5 La Fosforilazione S138 ed il meccanismo della regolazione della
IRP1 attraverso il ferro.
Lo “switch Fe-S” ed i meccanismi di degradazione delle proteine per il controllo della funzione della proteina IRP1 potrebbero essere usati nella modulazione del metabolismo del ferro, al fine di soddisfare le esigenze cellulari. Un meccanismo importante coinvolge la fosforilazione in S138 della IRP1 attraverso la proteina chinasi C perché porta ad un accumulo della forma IRP1 RNA-legante (Eisenstein et al.,1993).
3.6 Le IRPs e l’ossigeno.
La scoperta di una IRE funzionale nella sequenza 5' UTR dell’mRNA che codifica per il fattore HIF-2α ha suggerito nuovi ruoli per le IRPs nella risposta adattativa all’ipossia ed alla carenza di ferro. Un recente studio ha dimostrato che l’HIF-2α mRNA viene traduzionalmente repressa nel fegato dei topi con deficit di ferro e questo promuove un aumento della IRP1 e dell’attività della IRP2 . Altri studi hanno dimostrato che HIF-2α IRE è il principale bersaglio della IRP1. Il fattore HIF-2α viene regolato attraverso la stabilizzazione della proteina in risposta all’ipossia ed alla
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carenza di ferro. In queste condizioni, l’HIF-2α stimola l'eritropoiesi attraverso l'attivazione dell’eritropoietina (EPO) e l'assorbimento intestinale del ferro attraverso l'attivazione del DMT1 e della ferroportina, promuovendo un meccanismo per coordinare l'assorbimento del ferro e la produzione dei globuli rossi. La regolazione traduzionale IRP-dipendente dell’HIF-2α mRNA è stata proposta come il meccanismo in grado di ridurre la produzione della EPO durante l'ipossia dovuta ad una alterazione dell’eritropoiesi nell’anemia sideropenica, garantendo in tal modo che non vengano prodotti i globuli rossi microcitici ipocromici. Visto che l’HIF-2α mRNA viene regolato in modo preferenziale attraverso la IRP1, questo ha suggerito che in condizioni di ipossia con sufficienti livelli di ferro, la IRP1 esisterebbe nella sua forma c-acon, che è incapace di legare l’RNA, assicurando in questo modo la traduzione dell’HIF-2α mRNA e la produzione della EPO.
Un fattore chiave nella scoperta della IRE è stato rappresentato dall’esistenza di una sequenza di ~ 28-30 nucleotidi appartenente alla sequenza della 5 'UTR nell’mRNA sia della H- che L-ferritina. Sono state identificate molte IREs nella sequenza 3' UTR della TfR1 mRNA, che servivano per controllare la stabilità dell’RNA e avrebbero anche potuto modulare la traduzione se fossero state trasferite in una sequenza 5' UTR. La struttura secondaria conservata delle IREs ha permesso di supporre che l'IRE canonica fosse un RNA con uno stelo a cerchio e con un esanucleotide terminale CAGUG(N) a cerchio e con un C spaiato (C8) nello stelo, nella sequenza 5' del cerchio (Selezneva et al., 2006) (Fig. 6).
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Figura 6. Confronto della ipotetica struttura secondaria delle IREs. Gli elementi strutturali chiave
necessari per il riconoscimento della IRE attraverso la IRP1 comprendono il C (C8) spaiato nello stelo della IRE ed i nucleotidi A16G17U18 del pseudotriloop. La struttura secondaria canonica dell’IRE è rappresentata da uno
dei cinque TfR1 IREs (TfR1 B ), in cui l’elica dell’ RNA è interrotta da solo un C8 spaiato. La struttura secondaria della L-ferritin IRE ha evidenziato l’U spaiato alla posizione 6 (con la freccia). Questo nucleotide aggiuntivo spaiato è stato osservato nella NMR della ferritin IRE, la struttura a forma di cristallo della IRP1 si lega alla ferritin IRE. Viene proposta anche la struttura secondaria del DMT1 e dell’HIF-2α IREs. Nota. Con la freccia viene indicato il nucleotide aggiuntivo spaiato. La numerazione dei residui IRE è in accordo con Walden et al..
Studi strutturali e biochimici hanno rivelato che la formazione del loop si è verificata in conseguenza di un appaiamento delle basi del primo e del quinto nucleotide della sequenza CAGUGN ed è fondamentale per il legame della IRP1. L’elevata risoluzione delle strutture cristalline della IRP1 che sono legate alla ferritin IRE ed al TfR1 B IRE provvedono a fornire delle importanti informazioni sulla natura di questa insolita elevata affinità dell’RNA (Fig.7).
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Figura 7. Viene mostrata la struttura a forma di cristallo della c-aconitasi e del complesso IRP1:IRE (Walden
et al., 2006). (A) Struttura dell’aconitasi citosolica con dominio 1 (yellow ), dominio 2 (green), dominio 3 (blue) e dominio 4 (red) con il cluster [ 4Fe-4S] nel centro (orange balls). (B) Struttura del complesso IRP1:IRE con domini che vanno dall’ 1 al 4 cosi’ come evidenziati in ( A ). Viene rappresentata anche la ferritin IRE helix (purple) con i due maggiori siti di contatto di C8 (sinistra) ed le basi A16G17U18 del pseudotriloop (destra) di forma ovale ingrandita.
La IRP1 si lega alla IRE attraverso due serie di interazioni separate di circa 30 Å. La IRP1 si lega in quantità maggiore alla IRE in una specifica sequenza. Per cui, i nucleotidi esposti, compresa la sequenza AUG del loop terminale ed i residui del C8 spaiato nello stelo della IRE, rappresentano 15 dei 22 contatti con la IRP1. Gli altri sette legami aggiuntivi si trovano con i siti nel fosfodiestere centrale dello stelo della IRE. La modalità di legame dei due siti della IRP1, che ha forti analogie con il riconoscimento dell’tRNA attraverso la tRNA sintetasi, consente una maggiore specificità di riconoscimento dell’RNA, e probabilmente contribuisce alla insolita elevata affinità di interazione (Walden et al., 2006). I residui all'interno della IRP1/c-acon, che influenzano la capacità di interconversione tra queste due forme, possono spiegare la capacità che hanno alcune aconitasi di legarsi all’RNA.
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3.7 La regolazione ferro-mediata della stabilità della IRP2.
La IRP2 è regolata soprattutto attraverso la stabilità della proteina. La deplezione del ferro e l’ipossia stabilizzano la IRP2, mentre il ferro promuove l’ubiquitinazione della IRP2 e la degradazione proteosomale. Uno dei primi studi su IRP2 ha sottolineato l’importanza della necessità di una cisteina con un dominio di 73 amminoacidi per la degradazione ferro-mediata della IRP2. Sono stati proposti diversi modelli in cui il ferro o l’eme ossidano specifici residui di cisteina del dominio di 73 amminoacidi, promuovendo l’ubiquitinazione e la degradazione della IRP2. È stata poi identificata la proteina HOIL-1 (heme-oxidized IRP2 Ub ligase), in grado di legarsi ai residui eme-ossidati all’interno del dominio di 73 amminoacidi. Successivi studi, effettuati su diversi gruppi, hanno dimostrato che la mutazione dei residui di cisteina all'interno del dominio di 73 amminoacidi, o la cancellazione dell’intero dominio di 73 amminoacidi, non influenzano la degradazione ferro-mediata della IRP2. Inoltre, il silenziamento di HOIL-1 o la sovraespressione nelle colture cellulari non hanno effetto sulla degradazione della IRP2 attraverso il ferro. Di recente, un nuovo complesso E3 ligasi, SKP1-CUL1-FBXL5, è stato identificato come E3 ligasi responsabile della degradazione ferro-mediata della IRP2 (Fig. 8).
Figura 8. I meccanismi per la regolazione ferro-dipendente e ferro-indipendente della IRP2. La degradazione
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emeritrina promuovendo un cambiamento conformazionale che aumenta la stabilità dell’FBXL5. L’FBXL5 si lega lega alla IRP2 ed il complesso FBXL5-IRP2 si associa con il complesso SKP1-CUL1, catalizzando l’ubiquitinazione e la degradazione proteosomale della IRP2. Quando i livelli di ferro e di ossigeno sono imitati, la FBXL5 è destabilizzata e rappresentando un bersaglio per la degradazione da parte di una E3 ligasi non ancora identificata.
Il percorso ferro-indipendente della IRP2: la IRP2 viene fosforilato dalla CDK1/ciclinB1 (cyclin-dependent Kinase 1) durante la fase G2/M e poi defosforilata alla CDC14A allafine della mitosi. La fosforilazione di S157 è ferro-indipendente ed è associata alla ridotta attività dell’RNA binding. Le IRP2 fosforilate e non-fosforilate sono soggette alla degradazione ferro-mediata da parte della FBXL5.
FBXL5 è un membro della famiglia F-box di proteine adattatrici che conferiscono specificità di substrato alla ligasi SCF E3 Ub. FBXL5 è conservato nei vertebrati, contiene un dominio hemerythin N-terminale, un dominio F-box che media la sua associazione con SKP1 e quattro ripetizioni ricche di leucina che hanno probabilmente una funzione nella IRP2 binding. Le emeritrine sono proteine di trasporto dell’ossigeno negli organismi marini che legano l’ossigeno attraverso un centro L diferrico. Domini hemerythrin-like, sono stati identificati nelle proteine batteriche in cui forse rivestono il ruolo di sensori di ossigeno. FBXL5 è stata la prima proteina eucariotica individuata che possiede questo dominio.
Diversi esperimenti hanno dimostrato che FBXL5 regola la stabilità della IRP2. Innanzitutto, FBXL5 forma un complesso SCF che interagisce con la IRP2 in vitro. La regione della IRP2 che lega FBXL5 non è ancora nota, ma uno studio ha dimostrato che sono necessarie le sequenze nella regione C-terminale della IRP2, anche se non sono sufficienti per la degradazione della IRP2. Il silenziamento della FBXL5 stabilizza l’IRP2, mentre la sovraespressione della FBXL5 promuove la degradazione della IRP2. FBXL5 è stabilizzata nelle cellule con abbondante ferro e destabilizzata dall’esaurimento del ferro e dall’ipossia. Il dominio dell’emeritrina è necessario per la stabilità della FBXL5, mentre le mutazioni nei residui di istidina e glutammato all'interno di questo dominio riducono sia i livelli della FBXL5 che la stabilità ferro-dipendente. Infine, la diminuzione della stabilità della FBXL5 durante l’esaurimento del ferro o dell’ipossia fornisce una spiegazione per l'accumulo della IRP2 durante l'ipossia. Allo stesso modo, sia la degradazione della IRP2 attraverso
