3 1 Fasi preliminar
3.7 Incubazione con anticorp
In biochimica, gli anticorpi costituiscono uno strumento per la valutazione su base strutturale, grazie alla loro capacità di discriminare tra strutture molto simili. Gli anticorpi, infatti, si legano ad un preciso epitopo (circa 25 amminoacidi) della proteina che si vuole mettere in evidenza.
Nel dettaglio, una volta terminato il trasferimento del gel sulla membrana, si procede con il blocking della membrana coprendola con circa 15 mL di milk 5%. Si lascia in incubazione in un agitatore basculante, in continuo movimento, per 1 ora a temperatura ambiente.
Questa operazione permette di minimizzare i legami aspecifici degli anticorpi primari. Il milk 5% copre tutti i siti disponibili; in questo modo, dunque, una volta aggiunto l’anticorpo, che è più affine all’epitopo della proteina rispetto al
milk 5%, quest’ultimo viene scalzato dall’anticorpo che si lega alla proteina di
interesse.
Come precedentemente accennato, l’α-syn è una proteina la cui struttura può essere descritta da tre porzioni: la regione C-terminale, N-terminale e la regione centrale che è conosciuta come la componente non-amiloide-β (NAC).
Dopo il periodo di incubazione in milk, è stato utilizzato l’anticorpo primario specifico per la regione N-terminale della proteina. In particolare, l’anticorpo specifico che è stato utilizzato è α-syn 514908 (mouse) di cui è stata fatta una diluizione 1:200 in milk 5%. A questo punto è stato aggiunto l’anticorpo primario alla membrana, lasciata ad incubare a 4°C per tutta la notte in continuo movimento.
Dopo aver lavato la membrana con TBS-TWEEN (per ottenere 1L di TBS si utilizzano 1.21 g/L di Trizma, 8.77 g/L NaCl, 1L di acqua bidistillata, il pH deve essere aggiustato fino ad ottenere un valore uguale ad 8; per ottenere il TBS-
TWEEN si aggiunge a 500mL di TBS 250µL di TWEEN), per eliminare eventuali
residui di anticorpo primario, precedentemente recuperato, è stato aggiunto alla membrana l’anticorpo secondario (mouse) anch’esso precedentemente diluito in
milk 5% 1:10’000. La membrana è stata lasciata in incubazione per 2 ore a
temperatura ambiente in continuo movimento.
Terminata l’incubazione con l’anticorpo secondario sono stati effettuati dei lavaggi della membrana in TBS-TWEEN per eliminare, anche in questo caso, qualsiasi residuo di anticorpo secondario. La membrana a questo punto è pronta per essere sviluppata al Chemidoc.
La membrana è stata recuperata e su di essa è stato effettuato uno strip. Su un supporto contenente la membrana è stato aggiunto lo stripping buffer. Successivamente, l’intero supporto è stato immerso nel bagnetto a caldo a 50°C per 30 minuti.
Lo stripping buffer serve a rimuovere tutti gli anticorpi ed è costituito da Tris- HCl 50 mM (pH 7) con SDS 2% e ditiotreitolo 50 mM (DTT).
Lo stripping della membrana è stato eseguito con lo scopo di eliminare completamente l’anticorpo specifico per la regione N-terminale dell’α-syn in modo da poter aggiungere alla membrana l’anticorpo specifico per la regione C- terminale.
Dopo aver lavato la membrana con TBS-TWEEN, si procede nuovamente al
blocking della membrana con milk 5%. A questo punto si può aggiungere
l’anticorpo primario specifico per la porzione C-terminale α-syn (211) sc-12767 (mouse) con una diluizione 1:200 in milk 5%, lasciata ad incubare a 4°C per tutta la notte in continuo movimento. A questo punto si procede nello stesso modo descritto precedentemente per l’anticorpo primario specifico per la porzione N- terminale. La membrana a questo punto è pronta per essere sviluppata al ChemiDoc.
Il ChemiDoc è uno strumento che è prodotto dall’azienda Bio-Rad. È un sistema d’imaging, in grado di rilevare segnali colorimetrici, chemiluminescenti, fluorescenti, nel rosso, nel verde, nel blu e a UV.
Il sistema è caratterizzato da 3 elementi principali, che dall’alto verso il basso sono:
• la telecamera ad accoppiamento di carica per l’acquisizione di immagini real- time,
• la camera a tenuta di luce, basata sulla tecnologia “Universal Hood III” • il supporto estraibile per l’inserimento dei campioni.
La camera a 16 bit super-sensitive presenta un sistema di raffreddamento per la rivelazione dei segnali più̀ deboli, basata su una cella di Peltier, un dispositivo termoelettrico costituito da molte giunzioni ad effetto Peltier in serie, che assorbono calore da un lato e lo rilasciano dall’altro, in base al verso di
FIGURA 13: Rappresentazione del ChemiDoc (https://www.medicalexpo.it/prod/bio- rad/product-80676-750844.html).
scorrimento della corrente. La camera monta uno zoom motorizzato (MZL), che consente la regolazione a distanza delle funzioni di controllo dell’obiettivo, quali lo zoom, la messa a fuoco e la regolazione del diaframma. Un algoritmo controlla lo MZL, permettendo la messa a fuoco automatica, mentre una lente con diottria 6+1, è installata all’interno del MZL, permette al campione di essere sempre visibile.
La tecnologia Universal Hood III permette la cattura di immagini fluorescenti e chemiluminescenti senza il passaggio in camera oscura. L’involucro è dotato di luce bianca per l’epi-illuminazione, permettendo l’illuminazione del campione in qualsiasi modalità̀, e un trans-illuminatore a raggi UV. Può̀ contenere fino a sei filtri d’emissione diversi per le applicazioni in fluorescenza, mentre un filtro standard è utilizzato per le applicazioni meramente colorimetriche.
Il sistema è, inoltre, capace di rilevare accuratamente la posizione del campione, in modo da ottimizzare la rivelazione dell’immagine automaticamente. Anche il campo è regolato autonomamente in modo da ottenere una profondità̀ di campo nulla (campo piatto), per un’uniformità̀ di immagine superiore e una quantificazione più̀ accurata.
Grazie alla tecnologia impiegata, il rapporto “segnale-rumore” dei trasferimenti è, dunque, incrementato fino all’83% rispetto alla rivelazione su pellicola.
La procedura di acquisizione dell’immagine è totalmente guidata, tramite protocolli pre-configurati o definiti dall’utente, utilizzando il software Image Lab.
Il software permette di definire tutti i parametri di acquisizione, monocanale o multicanale, per una rivelazione ottimale dell’immagine. È possibile, quindi, selezionare il tipo di supporto (“Nucleic Acid gels”, “Protein gels”, “Blots”), il tipo di reagente utilizzato, in base ai quali il sistema definirà̀ automaticamente la sorgente di illuminazione e il filtro da utilizzare. Seguono le impostazioni
relative al tempo di esposizione e alla tipologia di colore con cui elaborare l’immagine (es. scala di grigi).
È utilizzabile anche uno strumento per l’esposizione automatica, che stima un tempo di esposizione ottimale e garantisce il miglior utilizzo del range dinamico, per la rivelazione di tutte le bande (“Intense Bands”) o per la rivelazione anche dei segnali più̀ deboli (“Faint Bands”), a discapito di una possibile saturazione dei segnali più̀ forti.
Il sistema è anche in grado di visualizzare in rosso, eventuali porzioni di blot, in cui il segnale si è saturato.
Per la rivelazione di un segnale chemiluminescente è possibile, invece, utilizzare il “signal accumulation mode” (SAM), un sistema utilizzato per semplificare la cattura di una buona immagine da un campione chemiluminescente. Questo tipo di campione richiede spesso lunghi tempi di posa, per ottenere un'immagine che rappresenti la migliore gamma di tutti i segnali, comportando quindi una perdita di tempo. Il SAM permette l’acquisizione di un immagine del campione, in diversi istanti, fissati i tempi di esposizione (minimo e massimo) e il n° di frame da realizzare.