Risultati del Western-Blot

Con la corsa su gel di poliacrilammide è stata valutata la presenza o meno di aggregati proteici di peso molecolare differente. Successivamente, le proteine vengono trasferite dal gel dove è stata eseguita la corsa elettroforetica alla membrana di nitrocellulosa. Infine, dopo aver effettuato il blocking della membrana con il milk 5%, è stato aggiunto l’anticorpo primario specifico per la regione N-terminale della proteina.

In figura 18sono riportati i risultati del Western-blot:

A destra possiamo vedere nelle due lanes i risultati del Blot relativi all’α-syn prima dell’aggregazione e all’α-syn aggregata.

L’anticorpo specifico che è stato utilizzato è α-syn sc-514908 (mouse). In particolare, è stato utilizzato un anticorpo monoclonale murino specifico per la mappatura di un epitopo tra gli amminoacidi 2-24 all'estremità N-terminale dell'α-syn di origine umana. Secondo il datasheet dell’anticorpo utilizzato, quest’ultimo dovrebbe riconoscere la proteina a 21kDa. Infatti, nella colonna relativa all’α-syn monomero possiamo vedere una linea più marcata a 21 kDa rispetto alla colonna relativa all’α-syn aggregata dove invece risulta più marcata la porzione relativa all’α-syn presente in vari stati di aggregazione. Per comodità questa porzione è stata chiamata “Aggregation Band”. Nella prima colonna è stato possibile osservare anche la banda a 42 kDa (dimero) e a 63 kDa (trimero), indice che la sinucleina che è stata acquistata non è del tutto in forma monomerica, sebbene per la maggior parte lo sia.

Sulla sinistra della figura 18, invece, abbiamo i risultati del controllo dell’α-syn aggregata, in presenza di etanolo, e dell’α-syn aggregata in presenza di cortisolo. E’ evidente dal blotting che già di per sé l’etanolo è in grado di influenzare il processo di aggregazione. E’ stato dimostrato, infatti, che l’etanolo induce la trasformazione dell’α-syn verso la formazione di una struttura ricca di beta-sheet, stabile (Larissa A. Munishkina et al., 2002).

Per ciascuna banda di peso molecolare è stata condotta un’analisi semiquantitativa densitometrica delle bande del blot ed i risultati sono riportati come % dell’α-syn presumibilmente monomero (α-syn before aggregation) posta al 100%.

Per quanto riguarda la banda di 21 kDa, dal grafico possiamo osservare come questo valore si riduca significativamente nell’α-syn aggregata rispetto alla proteina prima dell’aggregazione. L’analisi densitometrica della banda a 21 kDa rappresenta quindi un buon mezzo per la valutazione dello stato di aggregazione dell’α-syn. Inoltre, possiamo vedere come il valore del trattamento dell’α-syn con il cortisolo dopo aggregazione ritorna ad essere molto simile all’α-syn prima dell’aggregazione e l’analisi statistica di fatto non ha mostrato avere significatività. Per quanto riguarda il valore di α-syn dopo l’aggregazione con etanolo (CTRL) in questa banda si può vedere che la sua intensità si riduce rispetto a quella di α-syn dopo aggregazione con cortisolo, e risultando non statisticamente significativa verso l’α-syn dopo aggregazione.

Figura 19: Rappresentazione

della densitometria delle bande a 21kDa

In figura 20 viene fatta l’analisi del dimero, quindi della densitometria della banda a 42 kDa. L’analisi non ci ha permesso di valutare e apprezzare gli effetti del cortisolo sull’α-syn aggregata come per la banda del monomero. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la situazione del dimero (come quella del trimero), rappresentano una situazione intermedia. È possibile che la banda dell’α-syn dopo aggregazione abbia un valore inferiore rispetto a quella di α- syn prima dell’aggregazione, poiché la maggior parte della proteina si trova già nella sua forma aggregata. Allo stesso tempo, l’α-syn trattata con cortisolo tende a disgregarsi e proprio per questo motivo i suoi valori sono più bassi rispetto a quello di α-syn dopo aggregazione con etanolo (CTRL).

Nel complesso i valori densitometrici e l’analisi statisitica delle bande di 21 e 42 kDa ci fanno pensare ad uno stato di aggregazione dell’α-syn trattata con cortisolo più simile a quello dell’α-syn prima dell’aggregazione, rispetto al suo controllo.

Figura 20:

Rappresentazione della densitometria delle bande a 42 kDa

Per quanto riguarda l’analisi della banda a 63 kDa (Fig 21), è possibile osservare come l’aumento risulti altamente significativo nell’α-syn dopo aggregazione rispetto a quella prima dell’aggregazione. E’ possibile osservare inoltre una leggera differenza tra α-syn + cortisolo e il suo controllo. Quest’ultimo risulta infatti meno statisticamente significativo (p<0,001) rispetto all’α-syn + cortisolo

(p<0,0001) se confrontate con l’α-syn dopo aggregazione.

Figura 21: Rappresentazione

della densitometria delle bande a 63 kDa

Dalla figura 22, in cui viene descritta la banda di aggregazione, possiamo vedere che in tutti e tre i campioni l’aggregazione è avvenuta: infatti tutte e tre le bande risultano altamente significative rispetto ad α-syn prima dell’aggregazione. La differenza fra α-syn dopo aggregazione con cortisolo risulta più significativa rispetto ad α-syn dopo aggregazione con etanolo (CTRL) nei confronti di α-syn dopo aggregazione, indice che comunque anche in questo caso è possibile osservare un effetto del cortisolo sul processo di aggregazione dell’α-syn.

Dai risultati ottenuti possiamo sperare che questo lavoro di tesi possa rappresentare un interessante punto di partenza sia per studi di indagine di meccanismi di aggregazione che per lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a modulare l’aggregazione della proteina.

Figura 22: Rappresentazione

della densitometria della banda di aggregazione (Aggregation Band)

RINGRAZIAMENTI

A conclusione di questo elaborato, vorrei dedicare qualche riga a tutti coloro che mi sono stati vicini in questo percorso di crescita personale.

Ringrazio la mia relatrice Da Pozzo Eleonora, che in questi duri mesi di lavoro, oltre ad avermi guidato nella stesura di questo lavoro, mi ha trasmesso la passione e l’entusiasmo necessari affinché la tesi prendesse forma giorno dopo giorno. Grazie anche a Germelli Lorenzo per i suoi preziosi consigli e per la sua immensa pazienza.

Ringrazio di cuore i miei genitori e i miei nonni, perché è grazie a loro sostegno e al loro incoraggiamento se oggi sono riuscito a raggiungere questo traguardo.

Un grazie va alle mie compagne di studi, Giulia e Federica con le quali ho condiviso gioie e fatiche di questi cinque anni trascorsi insieme.

Un pensiero devo riservarlo a Francesco, che mi è stata accanto durante tutto il mio percorso di studi, e a tutti i miei compagni di laboratorio e amici, che mi hanno dato consigli e incoraggiamenti.

E infine ringrazio, soprattutto, me stesso per la determinazione e l'impegno attuo a raggiungere questo traguardo, la voglia di sfidarmi, per averci provato ed esserci riuscito

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