UNIVERSITA’̀ DI PISA
Dipartimento di Farmacia
LAUREA SPECIALISTICA in FARMACIA
α-sinucleina e cortisolo:
studi cinetici di aggregazione fibrillare.
Relatore:
Prof.ssa Eleonora Da Pozzo
Correlatore:
Dott. Lorenzo Germelli
Candidata:
Carlotta Biondi
ANNO ACCADEMICO 2019/2020 SSD: BIO/10
INDICE
RIASSUNTO
7
CAPITOLO 1: INTRODUZIONE
9
1.1 α-sinucleina
9
1.1.1 Famiglia delle sinucleine
9
1.1.2 Struttura di α-syn
11
1.1.3 Misfolding e aggregazione della α-syn
13
1.1.4 Oligomeri di α-syn
15
1.1.5 Fibrille di α-syn
17
1.1.6 Mutazioni di α-syn
19
1.1.7 Funzioni intracellulari di α-syn
21
1.1.7.1 α-syn nel traffico di vescicole e trasmissione
sinaptica
21
1.1.7.2 α-syn nella formazione e regolazione del canale
23
1.1.7.3 α-syn nella funzione del reticolo mitocondriale/
endoplasmatico e nella regolazione del calcio
25
1.1.8 α-syn extracellulare
27
1.1.8.1 Secrezione di α-syn
27
1.1.8.3 Interiorizzazione e trasporto di α-syn
30
1.1.9 Formazione e meccanismi di propagazione di α-syn
31
1.2 α-sinucleinopatie
33
1.2.1 Definizione delle α-sinucleinopatie
33
1.2.2 Eziologia delle α-sinucleinopatie
33
1.2.3 Aspetti clinici
34
1.2.3.1 Morbo di Parkinson
34
1.2.3.2 Morbo di Parkinson con demenza
35
1.2.3.3 Demenza dei corpi di Lewy
36
1.2.3.4 Atrofia multisistemica
36
1.2.3.5 Corpi accidentali di Lewy
37
1.3 Approcci terapeutici che hanno come target l’α-syn
38
1.3.1 Riduzione della produzione di α-syn
38
1.3.2 Inibizione dell’aggregazione di α-syn
40
1.3.3 Promuovere la degradazione degli aggregati di
α-sinucleina intracellulari
42
1.3.4 Aumentare la degradazione extracellulare di α-syn
45
CAPITOLO 2: SCOPO DELLA TESI
48
CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI
49
3.1 Fasi preliminari
49
3.1.1 Solubilizzazione e conservazione di α-syn
49
3.1.3 Preparazione della madre di Tioflavina T
50
3.2 Lettura al lettore di piastre multimediale EnSight
dell’autofluorescenza di α-syn
52
3.3 Solubilizzazione del cortisolo
56
3.4 Lettura al lettore di piastre multimediale EnSight della
cinetica di fibrillazione con ThT e cortisolo
58
3.5 Corsa su gel dei campioni contenenti α-syn e ThT, del
monomero di α-syn e della proteina fibrillata
60
3.6 Trasferimento del gel su membrana e sviluppo della
membrana
65
3.7 Incubazione con anticorpi
68
CAPITOLO 4: RISULTATI E DISCUSSIONE
73
4.1 Valutazione dell’autofluorescenza di α-syn
73
4.3 Cinetica di fibrillazione di α-syn e cortisolo come
modulatore della fibrillazione di α-syn
76
4.4 Risultati del Western-Blot
80
RINGRAZIAMENTI
86
RIASSUNTO
L’α-sinucleina (α-syn) è una proteina appartenente alla famiglia delle sinucleine, proteine piccole e solubili espresse principalmente nei tessuti neurali e nelle cellule tumorali. Alla famiglia delle sinucleine appartengono, oltre l’α-syn, anche la β-syn e la 𝛾-syn.
L’α-syn è una piccola proteina (14 kDa) che si trova prevalentemente a livello cerebrale, dove è localizzata nei terminali pre-sinaptici. La proteina è stata osservata per la prima volta nel 1988 negli elettrociti di Torpedo Californica (K.
Uéda et al. 1993).
L’α-syn, dal punto di vista strutturale, è caratterizzata da tre domini: • La regione N-terminale (1-60)
• La regione C-terminale (95-140)
• La regione centrale (61-94), che è la porzione della proteina che è indispensabile per l’aggregazione di α-syn stessa.
L’aggregazione dell’α-syn ha un ruolo chiave nei processi patologici ed ha inizio quando i monomeri si riuniscono per formare i nuclei di aggregazione (fase di latenza). Successivamente, nella fase di allungamento, le fibrille crescono in maniera esponenziale. Il processo di aggregazione termina con la fase stazionaria, quando si ha un esaurimento dei monomeri che porta ad una diminuzione della crescita delle fibrille. L’aggregazione dell’α-syn a livello dei neuroni e delle cellule gliali porta all’insorgenza di disturbi neurodegenerativi che prendono il nome di “α-sinucleinopatie”. Con il termine α-sinucleinopatie si fa riferimento ad un grande numero di patologie, quali morbo di Parkinson, morbo di Parkinson con demenza, demenza con corpi di Lewy.
L’α-syn ed i suoi aggregati possono essere considerati come uno dei principali target terapeutici nelle sinucleinopatie. Infatti, esistono diversi approcci
terapeutici in fase di sperimentazione, che hanno lo scopo di ridurre la produzione di α-syn, o inibirne l'aggregazione all'interno delle cellule, o di promuovere la sua degradazione.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare la cinetica di aggregazione dell’α-syn in presenza di cortisolo, mediante il saggio della Tioflavina T (ThT), una sonda comunemente utilizzata per monitorare in vitro la formazione di fibrille amiloidi; il cortisolo è stato scelto in quanto è un ormone con una grande importanza fisiologica, soggetto a fluttuazioni legate all’età e allo stato psicofisico, e inoltre precedente letteratura aveva dimostrato come gli estrogeni siano in grado di modulare l’aggregazione della α-syn. Prima di valutare l’aggregazione della proteina con ThT, sono state effettuate letture di autofluorescenza dell’α-syn usando il lettore di piastre multimediale EnSight. Dai saggi cinetici di aggregazione è stato osservato che la proteina fibrilla in 5 giorni e che il cortisolo è capace di modulare in senso negativo il processo di aggregazione. È stata anche utilizzata la tecnica del western blotting in modo da valutare alternativamente la presenza di aggregati proteici di α-syn.
Questo lavoro di tesi può rappresentare un interessante punto di partenza sia per studi di indagine di meccanismi di aggregazione che per lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a modulare l’aggregazione della proteina.
C A P I T O L O
1 :
INTRODUZIONE
1.1 α-sinucleina
1.1.1 Famiglia delle sinucleine
Le sinucleine (syn) sono una famiglia di proteine piccole e solubili espresse principalmente nei tessuti neurali e nelle cellule tumorali. All’interno della famiglia delle sinucleine possiamo individuare tre membri:
• α-syn • β-syn •𝛾-syn
L’α-sinucleina (α-syn) è una proteina che si trova prevalentemente a livello cerebrale, dove è localizzata nei terminali pre-sinaptici, e a questo livello si può associare a lipidi e proteine. La proteina è stata osservata per la prima volta nel 1988 negli elettrociti di Torpedo Californica (K. Uéda et al. 1993). Possiede diversi nomi, tra cui i più importanti sono sinucleina, NACP (non-Aβ component precursor protein), PNP-14 e sinelfina. Il nome NACP deriva dal fatto che alcuni suoi prodotti di degradazione sono stati trovati associati agli aggregati amiloidi presenti nel morbo di Alzheimer. Il gene che codifica per l’α-syn è il SNCA. La
proteina ha capacità aggreganti ed è in grado di formare aggregati amiloidi, denominati corpi di Lewy, che sono l’elemento che contraddistingue il morbo di Parkinson e le altre malattie neurodegenerative che coinvolgono gli aggregati della α-syn, definite α-sinucleinopatie (K. Uéda et al. 1993).
La β-sinucleina (β-syn) è una proteina più piccola di α-syn; si trova a livello dei terminali pre-sinaptici ed è secreta ed espressa in livelli simili alla α-syn. La β-syn, anche se identica al 78% alla α-syn, non si trova a livello dei corpi di Lewy e proprio per questo motivo non è coinvolta nelle patologie neurodegenerative, come la α-syn. La struttura di β-syn è caratterizzata dall'assenza del dominio NAC (componente non amiloidea), altamente idrofobo. La mancanza di questo dominio nella struttura della proteina fa si che la β-syn sia in grado di ridurre l’aggregazione α-syn, prevenendo la neuro degenerazione (Shi Z et al., 2015 e Braun AR et al., 2014). Diversi studi hanno mostrato come l’antagonismo tra α-syn e β-syn sia alla base dell’inibizione dell’aggregazione di α-syn sia in vivo che in vitro (Hashimoto M. Et al., 2004). Nello studio di Janowska et al., ad esempio, si è evidenziato che β-syn è in grado di inibire l’aggregazione di α-syn attraverso l’interazione diretta tra le molecole in siti specifici. Tale interazione si traduce nella formazione di eterodimeri, che implica che l'equilibrio tra la specificità e l'affinità delle interazioni α-syn/β-syn è cruciale per mantenere tassi di riduzione favorevoli dell'aggregazione α-syn (Janowska MK et al,. 2015).
La 𝛾-synucleina (𝛾-syn) è stata identificata in vari tessuti umani e la sua espressione è sovra regolata nel carcinoma ovarico, epatico e cervicale. Dal punto di vista strutturale è simile a β-syn e, inoltre, 𝛾-syn si trova anche nei neuroni periferici. La presenza di 𝛾-syn a livello centrale, però, non è correlata a malattie neurodegenerative, sebbene siano state riportate differenze nella sua espressione (Rockenstein E. Et al., 2009). 𝛾-syn si trova nella pelle, in particolare
nello strato granuloso, dove potrebbe avere un ruolo nella modulazione della cheratina (Ninkina NN. Et al., 1999). Questo membro della famiglia delle sinucleine si trova anche nelle cellule gangliari della retina (RGC) in cui la sua ridotta espressione è stata inizialmente correlata allo sviluppo del glaucoma (Surgucheva I. Et al., 2002); successivamente è stato evidenziato che 𝛾-syn abbia un ruolo nella sottoregolazione delle chinasi coinvolte nell'attivazione delle vie di segnalazione pro-apoptotiche negli RGC, giocando quindi un ruolo regolatore chiave nella progressione di questa malattia (Surgucheva I. Et al.,
2008).
1.1.2 Struttura di α-syn
L’α-syn è una piccola proteina di 14 kDa (140 amminoacidi; 4.7 pK). È caratterizzata da tre domini caratteristici:
• La regione N-terminale (1-60), ricca di lisina, è caratterizzata da un motivo conservato (KTKEGF) tipico della classe A2 delle apolipoproteine. Questa parte della proteina ha un ruolo cruciale nella modulazione delle interazioni di α-syn con le membrane (Ueda K. et al. 1993).
• La regione C-terminale (95-140), caratterizzata da una coda carbossilica disordinata, è implicata nella regolazione della localizzazione nucleica di α-syn e nelle sue interazioni con metalli, piccole molecole e proteine (Ulmer, T. S.
et al., 2005).
• La regione centrale (61-94) è stata per la prima volta purificata dalle placche amiloidi nei pazienti con malattia di Alzheimer (AD) nel 1993. Contiene una struttura molto idrofobica che comprende residui amminoacidi 61-94 ed è conosciuta come la componente non-amiloide-β NAC delle placche amiloidi
nel morbo di Alzheimer (Spillantini M.G. et al. 1997). La regione NAC è la porzione della proteina che è indispensabile per l’aggregazione di α-syn stessa.
L’ α-syn è caratterizzata da una flessibilità tale da permettere alla proteina di assumere diverse conformazioni e di interagire allo stesso tempo con altri composti e altre proteine. Vari studi con l’utilizzo di diversi metodi biofisici hanno dimostrato come α-syn, in condizioni denaturate, esista
prevalentemente in forma di monomeri unfolded (non ripiegati) e stabili (Ueda K.
et al. 1993); nonostante ciò, a causa della sua particolare struttura, la proteina
tende ad aggregarsi in aggregati o oligomeri.
L’ α-syn è in grado di adottare strutture diverse in specifiche condizioni stress-indotte o quando interagisce con altre proteine, ligandi specifici, lipidi e/o
FIGURA 1: Rappresentazione della struttura di α-syn (Hilal A. Lashuel et al.,
membrane biologiche (Hilal A. Lashuel et al., 2013). L’accumulo di α-syn e la conseguente formazione di particolari stati di aggregazione, come ad esempio gli oligomeri o le fibrille, sono dannosi per la cellula, mentre la normale presenza della proteina è fisiologicamente utile e protettiva (Vekrellis et al., 2004).
1.1.3 Misfolding e aggregazione della α-syn
Il dominio NAC dell’α-syn è la regione della proteina più propensa all’aggregazione. Nonostante ciò, questa regione dell’α-syn risulta essere protetta dall’aggregazione, seppur in parte, dalle cariche positive e negative delle regioni N- e C-terminale della proteina.
In realtà, l’ α-syn sembra possedere una conformazione dinamica che è stabilizzata da long-range interactions che provvedono a conferire alla proteina un grado sostanziale di compattezza (Bertoncini et al. 2005b). Più precisamente, le long-range interactions hanno luogo tra la regione C-terminale e la regione NAC e tra le regioni N- e C-terminale. Infine, tali interazioni sono probabilmente dovute a contatti idrofobici ed elettrostatici, e sembra che impediscano l’aggregazione (Bertoncini et al. 2005b). Nonostante ciò, ci possono essere delle situazioni, come mutazioni oppure cambiamenti delle condizioni esterne, che possono andare a disturbare la compattezza dell’ α-syn, determinando, come conseguenza, il mal ripiegamento e la conseguente aggregazione.
Il processo di aggregazione dell’ α-syn può essere suddiviso in tre fasi:
• La fase di latenza, in cui i monomeri si riuniscono per formare nuclei di aggregazione.
• La fase di allungamento, in cui le fibrille crescono in maniera esponenziale. • La fase stazionaria, durante la quale si ha un esaurimento dei monomeri che
porta ad una diminuzione della crescita delle fibrille (Wood et al. 1999).
La prima fase del processo di aggregazione dell’ α-syn è molto importante perché la velocità di questa fase può andare ad incidere sulla velocità delle due fasi successive.
Come dimostrato nell’articolo di Buel et al. 2014, si può ottenere una accelerazione della fase di latenza (che diventa quindi più breve) del processo di aggregazione dell’ α-syn grazie all’aggiunta di seeds, che si comportano come nuclei preformati per l’aggregazione. Gli oligomeri si convertono in protofibrille, le quali si associano per formare una fibrilla amiloide matura. Durante la fase di allungamento, le fibrille amiloidi crescono velocemente grazie all’aggiunta di monomeri alle estremità delle fibrille. La fase di allungamento è favorita dal punto di vista termodinamico vista la compattezza della proteina.
Nella fase stazionaria si possono descrivere due avvenimenti molto importanti: si assiste alla privazione dei monomeri ed, inoltre, la maggioranza dei polipeptidi risulta essere assemblata in fibrille (Invernizzi et al. 2012; Buell et al.
2014).
In tutte e tre le fasi, però, è presente un equilibrio dinamico in cui coesistono simultaneamente differenti conformazioni e stati di aggregazione.
1.1.4 Oligomeri di α-syn
Le specie oligomeriche sono caratterizzate da una marcata eterogenicità, instabilità, esistenza transitoria e variabilità e proprio per questi motivi la caratterizzazione di questa specie di proteine risulta essere piuttosto difficile. Gli oligomeri di α-syn possono essere preparati grazie a differenti protocolli di preparazione e purificazione, che permettono di ottenere oligomeri composti da meno di cinque a più di un centinaio di catene polipeptidiche, con diverse morfologie (sferiche, ellittiche, circolari, tubolari e sagomate) (Conway et al. 2000;
Lashuel et al. 2002; Cremades et al. 2012; Bousset et al. 2013). Inoltre, come riportato
nello studio di Ghosh et al. 2015, sono stati identificati oligomeri con differenti strutture secondarie; in particolare, dalla fase iniziale alla fine della fase di aggregazione, la struttura della popolazione di intermedi oligomerici si sposta da un alfa-elica verso una struttura beta-foglietto (Ghosh et al. 2015).
Il ruolo degli oligomeri di α-syn come intermediari del processo di aggregazione è stato oggetto di numerosi studi, durante i quali sono state isolate specie definite on-pathway e off-pathway. Gli oligomeri on-pathawys sono stati osservati durante le reazioni di fibrillazione in vitro ed hanno esibito specifiche proprietà strutturali, suggerendo così percorsi di aggregazione multipla. Tuttavia, l’esistenza di questi oligomeri potrebbe essere transitoria e si potrebbero facilmente convertire in monomeri e/o fibrille insolubili (Kaylor et al.
2005; Paslawski et al. 2014; Ghosh et al. 2015). L’importanza degli oligomeri off-pathways di α-syn non è ancora del tutto chiarita (Ehrnhoefer et al. 2008; Zhou et al. 2010; Fagerqvist et al. 2013), anche se sembra che possiedano un grado di
stabilità che porta all’inibizione della formazione di fibrille (Parvez Alam et al.
(folding) delle proteine, in cui si ipotizzava che le proteine si ripiegassero attraverso un unico e definito "pathway" attraverso un complesso potenziale energetico che rappresentava le loro possibili conformazioni.
Secondo numerosi studi, la maggior parte degli oligomeri di α-syn possono essere considerati come elementi patologici (Roberts e Brown 2015). Alcuni laboratori hanno rilevato la presenza di specie oligomeriche di α-syn nei pazienti affetti da sinucleinopatie (Sharon et al. 2003; Paleolo- gou et al. 2009;
Roberts et al. 2015). Sono state identificate varianti di α-syn inclini
all'oligomerizzazione, ma non alla fibrillazione, portando all’ipotesi che le specie oligomeriche potrebbero essere le forme più tossiche di α-syn (Rockenstein et al. 2014). Questa ipotesi è avvalorata da studi che, utilizzando una specie ben definita di α-syn ricombinante, dimostrano come complessi pre-fibrillari possano causare una vasta gamma di effetti dannosi (Diogenes et al.
2012; Choi et al. 2013; Prots et al. 2013; Luth et al. 2014; Pacheco et al. 2015).
Infine, si deve far riferimento all’esistenza di oligomeri fisiologici che recentemente è stata suggerita dallo studio di Bartels et al. 2011 nella forma di tetrameri. Inoltre, sono stati descritti anche multimeri, composti da più di 8 molecole di α-syn e arricchite da una struttura alfa-elicoidale (Burré et al. 2014). Questi ultimi sono presumibilmente formati dal monomero in seguito al legame con la membrana e sono correlati alla funzione biologica α-syn nell'assemblaggio complesso SNARE. Sebbene siano necessari ulteriori studi, sembra che la loro formazione possa prevenire l’oligomerizzazione di α-syn patologica (Burré et al. 2015).
1.1.5 Fibrille di α-syn
L’ α-syn è in grado di autoassemblarsi in fibrille amiloidi caratterizzate da una struttura prevalentemente a beta-foglietto come si evince da vari studi (Serpell et
al. 2000; Qin et al. 2007; Celej et al. 2012). Gli studi NMR suggeriscono che il
nucleo delle fibrille di α-syn vari principalmente dai residui 30–38 ai residui 95-110. Tali residui comprendono la regione NAC e parte del dominio N-terminale, che sono assemblati in 5-6 filamenti beta separati da più loop. Parte della regione N-terminale e la regione C-terminale si trovano al di fuori del nucleo.
FIGURA 2: Durante il processo di aggregazione i monomeri di a-syn formano
inizialmente oligomeri, ancora solubili, di dimensioni variabili, e,
successivamente, l’α-syn assume una conformazione a β-foglietto, che si assembla in fibrille o aggregati all’interno delle cellule, presenti sia nel
citoplasma che sulla superficie del reticolo endoplasmatico, definite inclusioni (o corpi di Lewy). Ci sono anche aggregati definiti amorfi, che derivano da assemblaggi di porzioni proteiche disordinate(S. Mehra, et al. 2019).
Grazie alla microscopia elettronica e alla microscopia atomica è stato possibile studiare e capire la morfologia delle fibrille di α-syn; più in particolare, è stata misurata la larghezza della fibrilla, che varia da un minimo di 6 nm e un massimo di 18 nm, e la lunghezza, che varia da 0,1 $m a più di 5 $m. Grazie a tali tecniche microscopiche, inoltre, sono state descritte fibrille attorcigliate e non attorcigliate, curve e diritte, periodiche e non periodiche (Raaij et al. 2008;
Sweers et al. 2011, 2012a, b; Bousset et al. 2013). Tale variabilità è una conseguenza
delle differenti condizioni sperimentali di aggregazione.
Molti studi, infatti, si sono focalizzati nel capire in che modo i fattori esterni possano essere dei fattori determinanti nella struttura fibrillare dell’α-syn, inclusa la composizione del tampone, le condizioni di aggregazione o l’effetto delle mutazioni.
Sono in corso numerosi studi a supporto della tossicità delle specie fibrillari e mature di α-syn, dove hanno assemblato α-syn fibrillari o frazioni insolubili di proteina per indurre una sinucleinopatia (Luk et al. 2012; Masuda-Suzukake et al.
2013; Recasens et al. 2014). Una teoria ipotizza che la formazione di aggregati
potrebbe essere protettiva; ad esempio, l’interferenza dell’oleuropeina (polifenolo che si trova nelle foglie di olivo e nelle drupe) porta alla formazione di aggregati di α-syn che presentano proprietà biofisiche modificate. La formazione di questo tipo di aggregati è accompagnata da una diminuzione della citotossicità (Bodner et al. 2006). Gli aggregati di α-syn maturi conferirebbero resistenza al mal ripiegamento proteico, che agisce come un meccanismo di scavenging per intrappolare le specie oligomeriche tossiche. Esperimenti eseguiti in un modello cellulare di aggregazione di α-syn dimostrano che le inclusioni di α-syn possono mostrare un aggresome (un'aggregazione di proteine ripiegate in modo errato all'interno della cellula) cellulare protettivi (Tanaka et al. 2004).
1.1.6 Mutazioni di α-syn
Come già accennato, il gene che codifica per l’α-syn è il gene SNCA. Tale gene può essere soggetto a mutazioni puntiformi che sono correlate alla forma ereditaria autosomica dominante del morbo di Parkinson (PD). Le mutazioni puntiformi meglio caratterizzate sono quelle che ospitano le sostituzioni di aminoacidi A53T (Polymeropoulos et al., 1997), A30P (Kruger et al., 1998) ed E46K (Zarranz et al., 2004). La mutazione più frequente è la A53T. I portatori di tale mutazioni sviluppano la sintomatologia del Parkinson intorno ai 40-60 anni e una volta che la malattia si è conclamata subiscono una progressione nei successivi dieci anni (Spira et al., 2001).
Accanto alle “vecchie" mutazioni puntiformi, possiamo descrivere tre nuove mutazioni missenso H50Q (Appel-Cresswell et al., 2013; Proukakis et al., 2013), G51D (Kiely et al., 2013) e A53E (Pasanen et al., 2014), che hanno recentemente ampliato la famiglia di mutanti associati a PD.
In particolare, la mutazione H50Q è correlata ad una insorgenza tardiva della malattia con una deficienza cognitiva (Khalaf et al., 2014); la mutazione G51D è associata ad una forma di Parkinson precoce che risponde moderatamente al trattamento con levodopa ed è caratterizzato da una progressione rapida (Lesage
et al., 2013); infine, la mutazione A53E è anche associata a PD atipico che inizia
presto con intorpidimento e iper reflessia e si traduce quindi in parkinsonismo associato a grave spasticità, scatti mioclonici e disturbi psichiatrici (Pasanen et
al., 2014).
È molto importante lo studio delle forme mutanti di α-syn in modo da dare una svolta nella terapia del morbo di Parkinson e delle altre sinucleinopatie. In generale, le forme di α-syn mutate tendono ad accumularsi maggiormente
rispetto alle forme che non hanno subito tale processo. È stato osservato che le mutazioni puntiformi A53T, E46K e la mutazione missenso H50Q hanno come conseguenza un miglioramento della fibrillazione di α-syn; invece, le mutazioni missenso G51D e A53E determinano una diminuzione del processo di fibrillazione parallelamente ad un aumento della formazione di aggregati amorfi (Fares et al., 2014; Ghosh et al., 2014; Rutherford and Giasson, 2015).
Il mutante A30P favorisce il processo di oligomerizzazione (migliore) rispetto alle forme di α-syn non mutata (Conway et al., 2000; Fredenburg et al., 2007;
Khalaf et al., 2014).
È stato evidenziato che la specie mutata G51D forma oligomeri di α-syn più lentamente e forma fibrille più tossiche (Lesage et al., 2013). Inoltre, questa forma mutata assieme al mutante A30P mostrano un’interazione difettosa con le membrane (Fares et al., 2014; Jo et al., 2002), al contrario della forma mutata E46K che è in grado di aumentare l’affinità di legame di α-syn con i fosfolipidi di membrana (Choi et al., 2004).
È interessante notare che recentemente è stato riportato che i mutanti A30P, E46K, H50Q, G51D e A53T esibivano identiche propensioni all'oligomerizzazione nelle cellule viventi, ma avevano capacità distinte per formare inclusioni. Mentre il mutante A30P ha ridotto la percentuale di cellule con inclusioni, il mutante E46K ha avuto l'effetto opposto (Lazaro et al., 2014), offrendo così diversi modelli sperimentali per studiare la tossicità cellulare indotta da oligomeri/aggregati.
1.1.7 Funzioni intracellulari di α-syn
1.1.7.1 α-syn nel traffico di vescicole e trasmissione
sinaptica
α-syn risulta essere espressa nel terminale pre-sinaptico dei neuroni (Iwai et al.,
1995; Maroteaux et al., 1988). A seconda del livello di espressione eterologa di
α-syn possiamo avere o meno casi di neurotossicità. Se α-α-syn è espressa a basse concentrazioni è localizzata a livello della membrana plasmatica, ma quando espressa maggiormente può formare inclusioni citoplasmatiche (Auluck et al.,
2010).
E’ stato dimostrato che le cellule di lievito che sovraesprimono α-syn presentano un difetto nel traffico di vescicole dal reticolo endoplasmatico (RE) all’apparato di Golgi. In particolare, la proteina va ad interferire con la via secretoria inibendo l'attività di Rab GTPase YPT1 e, anche se le vescicole si sono unite correttamente a livello del RE, non riescono a fondersi con la membrana del Golgi determinato un loro accumulo (Cooper et al., 2006).
Questa osservazione è stata estesa ai mammiferi, in particolare ai neuroni glutamatergici ippocampali e ai neuroni primari dopaminergici mesencefalici, dove è stato scoperto che un moderato aumento dell'espressione α-syn è in grado di inibire il rilascio di glutammato e dopamina, rispettivamente, senza generare tossicità né inclusioni cellulari di α-syn (Nemani et al., 2010). Monitorando il ciclo della vescicola sinaptica, è stato stabilito che le vescicole difettose che si riclassificano dopo eventi di endocitosi sono responsabili di una
riduzione della loro densità nella zona attiva e, di conseguenza, anche del rilascio di neurotrasmettitori (Nemani et al., 2010).
Sudof e collaboratori hanno scoperto che l’ α-syn ha un ruolo nella trasmissione
sinaptica come chaperone nella formazione del complesso della proteina attaccante il fattore sensibile alla N-etilmaleimide solubile (NEM), un sistema necessario per la fusione delle vescicole e per il rilascio di neurotrasmettitori alla sinapsi (Burre et al., 2010). La fusione della vescicola è controllata dall’interazione tra le proteine del complesso SNARE, ovvero la sinaptobrevina, una proteina di membrana associata alla vescicola, VAMP2, e le proteine della membrana plasmatica pre-sinaptiche (SNAP5). Durante ogni rilascio di ogni neurotrasmettitore, il complesso SNARE si assembla e disassembla. Questa operazione ciclica deve essere controllata: ecco che in questo ambito l’α-syn interagisce direttamente con VAMP2 e promuove l'assemblaggio complesso SNARE (Burre et al., 2010). L’azione di controllo di α-syn è essenziale per l’omeostasi neuronale, come dimostrato negli studi di Burre et al., 2010 e
Greten-Harrison et al., 2010 in cui topi, privi di tutti e tre i tipi di sinucleine, hanno
sviluppato un danno neurologico e sono morti prematuramente.
Lo stesso gruppo di ricercatori ha evidenziato che la funzione di controllo di α-syn sul complesso di proteine SNARE è garantito solo dalla proteina che si assembla in forma multimerica al legame con la membrana (Burre et al., 2014). Al terminale pre-sinaptico, α-syn si trova in equilibrio tra una forma solubile e una forma legata alla membrana: la prima forma porta a neurotossicità perché non riesce ad agire come chaperone del complesso SNARE, azione svolta invece dalla seconda forma (Burre et al., 2015).
1.1.7.2 α-syn nella formazione e regolazione del
canale
Le specie oligomeriche di α-syn sembra che siano in grado di formare canali transmembranali, ma anche di aumentare la permeabilità della membrana a causa di un assottigliamento del nucleo idrofobo del doppio strato lipidico (Stockl et al., 2013), facilitando la diffusione di molecole a basso PM. La forma oligomerica di α-syn sembra che abbia un ruolo nella modulazione del canale endogeno per α-syn.
Uno studio volto a capire il meccanismo d’azione di diverse proteine amiloidi non fibrillari patologicamente rilevanti a mettere in evidenza la peculiarità di syn di formare canali (Quist et al., 2005). In questo studio è stato visto che α-syn è in grado di assemblarsi in strutture simili a canali con fino 8 subunità disposte a formare un anello che mima l’attività di canale ionico dopo la ricostituzione in doppio strato lipidico planare, mostrando conduttanze eterogenee a canale singolo (fino a circa 300 pS in 100 mM KCl). La formazione di particelle proteiche "a forma di ciambella" è stata confermata anche da altri studi (Tsigelny et al., 2012).
La conduttività ionica indotta dalla forma oligomerica di α-syn ha mostrato eventi a canale singolo non risolvibili, solo in presenza di lipidi anionici nella membrana, la forma monomerica di α-syn, nelle stesse condizioni, ha dato origine a differenti livelli di conduttanza che vanno fino a più di 1 nS in 100 mM KCl, con 400 pS come valore prevalente (Zakharov et al., 2007).
Zakharov e colleghi hanno studiato casi in cui α-syn si trova in forme mutanti. In
particolare, le forme mutanti E46K ed A53T hanno incrementato l’attività del canale, a differenza della forma mutante A30P, che ha soppresso la sua attività.
Di Pasquale e colleghi hanno identificato due sostanze che sono in grado di
prevenire la formazione del canale: • baicaleina (Schmidt et al., 2012);
• anle138b (Wagner et al., 2013), che è in grado di rallentare la progressione del Parkinson (Levin et al., 2014).
Inoltre, secondo uno studio di Kim et al., l'epigallocatechina gallato (catechina del tè verde) può fermare l’attività del canale indotta dalle forme oligomeriche di α-syn.
Feng e colleghi hanno generato una linea cellulare dopaminergica immortalizzata
(MN9D), che esprime α-syn umana wild-type in maniera doxiciclina dipendente e hanno osservato che l'espressione della proteina risulta essere voltaggio indipendente. (Feng et al., 2010).
α-syn, inoltre, sembra che sia in grado di alterare l’omeostasi ionica, con alterazione dell’attività dei canali endogeni. Grazie all’immunoprecipitazione, è stato visto che α-syn è in grado di interagire con la proteina mitocondriale VDAC 1 (canale selettivo agli anioni voltaggio dipendente). E’ stato visto anche che il livello di espressione di VDAC1 era significativamente diminuito nei neuroni di pazienti con PD, contenenti inclusioni positive di α-syn (Chu et al.,
2014). In particolare, Rostovtseva et al., del 2015 mette in evidenza che
concentrazioni di α-syn nella sua forma monomerica sono in grado di fermare in maniera reversibile l’attività del canale VDAC1 nel doppio strato lipidico. Secondo gli autori, α-syn, quando raggiunge lo spazio intermembrana mitocondriale, agisce negativamente sulla fosforilazione ossidativa, determinando un aumento della produzione di ROS che a loro volta aumentano la trasformazione della proteina nella sua forma fibrillare (Rostovtseva et al., del
2015).
Oltre a VDAC1 possiamo citare altre proteine canale che interagiscono con l’ α-syn; ad esempio, α-syn si lega direttamente ai canali del canale potassio (KATP)
ATP-dipendenti nei granuli insulino-secretori stimolandone l’attività (Geng et
al., 2011 e Mironov, 2015). L’ α-syn, inoltre, interagisce anche con due proteine,
ENSA e sorcina, modulatori del canale KATP (Woods et al., 2007).
α-syn extracellulare è in grado di attivare il canale al calcio a tensione variabile Cav 2.2, determinando un aumento del rilascio di dopamina (Ronzitti et al.,
2014). Cav 2.2 si sposta nelle zone povere di colesterolo della membrana
plasmatica in seguito al trattamento con la proteina e α-syn potrebbe avere un ruolo nel rimodellamento dei microdomini della membrana plasmatica (Ronzitti
et al., 2014).
1.1.7.3 α-syn nella funzione del reticolo
mitocondriale/endoplasmatico e nella regolazione
del calcio
Diversi modelli cellulari e animali che presentano α-syn mutante oppure una sovraespressione della proteina sono caratterizzati da alterazioni mitocondriali. Secondo numerosi studi, in effetti, gli accumuli di α-syn portano ad una disfunzione del complesso mitrocondriale I (Chinta et al., 2010; Devi et al., 2008b;
Loeb et al., 2010b; Luth et al., 2014) e a difetti nella normale attività mitocondriale
come morfologia alterata, perdita di potenziale di membrana, aumento del ROS (Devi et al., 2008, Chinta et al., 2010).
Numerosi articoli dimostrano che la proteina interagisce direttamente con i mitocondri (Devi et al., 2008a; Li et al., 2007; Parihar et al., 2008). In particolare, α-syn si lega alle membrane ad alta curvatura e resistenti ai detergenti arricchite in colesterolo, sfingolipidi e fosfolipidi acidi (Jensen et al., 2011; Middleton e
Rhoades, 2010) e cardiolipina, un lipide presente quasi esclusivamente nei
mitocondri (Kubo et al., 2005).
Nonostante tutto l’ α-syn wild-type ha un ruolo importante nella modulazione della relazione tra RE e mitocondri (Calì et al., 2012; Guardia-Laguarta et al., 2015). Piccole sovraespressioni di α-syn regolano in senso positivo i livelli mitocondriali di calcio favorendo il legame dei mitocondri con il RE.
Tuttavia, sovraespressioni importanti della proteina determinano la sua ridistribuzione in luoghi localizzati e riduce la capacità dei mitocondri di accumulare il calcio e, inoltre, altera la morfologia mitocondriale. La sovrespressione fa ridurre il legame tra RE e mitocondri, fenomeno che comporta un aumento dei flussi autofagici, compromettendo la sopravvivenza cellulare (Calì et al., 2012). α-syn è stata appunto individuata a livello delle membrane del RE associate ai mitocondri (MAM), zone in cui questi compartimenti cellulari sono a stretto contatto fisico e biochimico
(Guardia-Laguarta et al., 2014). A questo livello, α-syn regola un numero di funzioni
metaboliche chiave. Sorprendentemente, è stato evidenziato che le mutazioni patologiche di α-syn determinano la sua ridotta associazione alle zone MAM, e di conseguenza un grado inferiore di apposizione RE-mitocondri e una maggiore frammentazione mitocondriale (Calì et al., 2012; Guardia-Laguarta et al.,
2014). Questa funzione biologica di α-syn è particolarmente interessante poiché
le alterazioni nelle zone MAM stanno emergendo come un elemento comune in una serie di malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer
(Area-Gomez et al., 2012; Hedskog et al., 2013; Zampese et al., 2011) e la sclerosi laterale
1.1.8 α-syn extracellulare
È chiaro che α-syn sia una proteina presente a livello citosolico, ma numerosi studi hanno dimostrato la presenza extracellulare della proteina in diversi modelli animali e cellulari.
Nel 1993 Uèda e colleghi identificarono una proteina da preparati amiloidi ottenuti dalla corteccia di pazienti con AD. Inizialmente, la proteina è stata nominata NAC (componente non Aβ dell'amiloide) (Ueda et al., 1993), ma solo poco dopo è stata riconosciuta come un frammento di α-syn presente a livello extracellulare (Jakes et al., 1994).
1.1.8.1 Secrezione di α-syn
Per quanto riguarda il processo di secrezione di α-syn, è emersa la possibilità che la trasmissione mediata da esosomi possa avere un ruolo nella secrezione di α-syn. Gli esosomi sono piccole vescicole, generate dagli endosomi tardivi o dai corpi multi-vescicolari (MVB) (Piper e Katzmann, 2007), che vengono rilasciati dalle cellule nello spazio extracellulare. Gli MVB contengono proteine cellulari, piccoli RNA e miRNA e si dirigono verso i lisosomi. In seguito a situazioni particolari o stimoli, gli MVB formano gli esosomi che sono rilevabili grazie all’utilizzo di marcatori specifici che vengono indirizzati verso la membrana plasmatica e l’ambiente extracellulare. Sono stati isolati dal liquido cerebrospinale (Street et al., 2012) ma anche dal cervello umano adulto (Banigan
materiale di scarto dalle cellule, ma come mediatori della comunicazione intercellulare (Mittelbrunn et al., 2015; Rajendran et al., 2014).
La quantità di α-syn associata all’esosoma costituisce una piccola quantità dell’ α-syn secreta; nonostante ciò, questa via è considerata il principale meccanismo alla base dell'estrusione e della diffusione di α-syn (Danzer et al., 2012;
Emmanouilidou et al., 2010a). Gli esosomi che derivano dal plasma dei pazienti
con Parkinson presentano livelli maggiori di α-syn rispetto a quelli dei controlli (Schneider e Simons, 2013; Shi et al., 2014). Inoltre, i lipidi contenuti negli esosomi sono in grado di favorire l’aggregazione di α-syn (Gray et al., 2015). La secrezione di α-syn viene aumentata in caso di compromissione genetica o farmacologica delle funzioni lisosomiali e proteasomali (Lee et al., 2013).
Una volta rilasciata, la proteina potrebbe subire due diversi destini: la degradazione da parte delle proteasi extracellulari o l'interiorizzazione da parte di altre cellule.
L’ α-syn che si trova a livello extracellulare può legarsi alla membrana plasmatica inducendo tossicità, dovuta alla permeabilizzazione della membrana e all’alterazione dell’omeostasi degli ioni (Gallegos et al., 2015; Pacheco et al.,
2015). Tale legame può essere anche un sito di enucleazione utile per il processo
di aggregazione (Mahul-Mellier et al., 2015).
Cellule non neuronali come astrociti o microglia sono in grado di assorbire l’ α-syn, che va a contribuire in questo modo al processo di neuroinfiammazione caratteristico nel cervello dei pazienti affetti da Parkinson. Sono state trovate tracce di α-syn in oligodendrociti e astrociti di pazienti con atrofia multisistemica (MSA), suggerendo che la proteina trovata in queste cellule hanno un'origine esogena. Forse la proteina dai neuroni viene assorbita dagli oligodendrociti (Reyes et al., 2014; Tu et al., 1998). Proprio per questo motivo, un target importante potrebbe essere l’α-syn extracellulare alla microglia attraverso la sua rimozione mediante l’attivazione della fagocitosi (Lee et al.,
2008b). Questa strategia non può essere impiegata per tempi lunghi (come
richiederebbe il trattamento per questo tipi di patologie) perché una continua infiammazione potrebbe favorire l’accumulo di α-syn (Giasson et al., 2000), contribuendo alla patogenesi del PD (Dzamko et al., 2015; Stojkovska et al., 2015).
1.1.8.2 Propagazione di α-syn
Anche se i processi di diffusione della proteina sono oggetto di dibattito, il consenso generale concorda sul fatto che la diffusione ad ampio spettro degli aggregati di α-syn richieda un trasporto assonale (George et al., 2013;
Ubeda-Banon et al., 2014). Tuttavia, è stato dimostrato che nei pazienti affetti da
Parkinson il trasporto assonale viene meno alle sue funzioni (De Vos et al., 2008;
Millecamps e Julien, 2013). Facendo riferimento al trasporto di α-syn, esistono tre
tipologie di trasporto:
• Il trasporto di α-syn appena sintetizzata dal sito di produzione (il corpo cellulare) che, come per altre proteine sinaptiche, si verifica con trasporto anterogrado (Utton et al., 2005).
• Il trasporto di α-syn sintetizzata al sito della sua azione fisiologica (l'assone distale e i terminali nervosi in cui si verifica la sinapsi), trasporto che è mediato sia dal trasporto assonale anterogrado che retrogrado (Freundt et al.,
2012; Jang et al., 2010) o tramite trasmissione trans-sinaptica (Masuda-Suzukake et al., 2014).
• Il trasporto di α-syn da un neurone all’altro.
Il trasporto assonale più lento della proteina verso il sito distale potrebbe essere la chiave del suo accumulo e della sua aggregazione a livello del corpo cellulare
(Roy, 2009). Inoltre, la formazione di oligomeri di α-syn a questo livello potrebbe interferire con i microtubuli, influenzando il trasporto anterogrado, aumentando il deficit nel trasporto assonale di α-syn nel sito sinaptico (Prots et
al., 2013), ma lasciando il trasporto retrogrado.
È di fondamentale importanza chiarire i meccanismi di propagazione di α-syn in modo da studiare una terapia con lo scopo di rallentare o frenare la progressione dei sintomi della malattia di Parkinson.
1.1.8.3 Interiorizzazione e trasporto di α-syn
L’assorbimento dell’ α-syn monomerica avviene grazie alla diffusione della proteina attraverso la membrana plasmatica (Lee et al., 2008a). Le specie oligomeriche e fibrillari di α-syn sembra che vengano assorbite tramite il processo di endocitosi perché in seguito al trattamento con sostanze in grado di inibire questa via si va ridurre in maniera costante l’assorbimento di α-syn da parte delle cellule (Desplats et al., 2009; Hansen et al., 2011). Accanto al processo di endocitosi, è stato proposto un recettore di legame per l’α-syn in forma oligomerica e fibrillare che possa assorbire la proteina. Tale ricerca però non ha avuto alcun successo (Holmes et al., 2013).
È probabile che α-syn possa, in maniera simile ai prioni, passare da una cellula all’altra tramite il tunneling di nanotubi, ovvero tubi contenenti F-actina che collegano il citoplasma di due cellule, anche se non sono state fornite prove dirette (Agnati et al., 2010).
1.1.9 Formazione e meccanismi di propagazione
di α-syn
Dal 2003 è emerso che l’α-syn può avere un comportamento simile ad un prione: come la proteina prionica, infatti, la conversione dell’α-syn da α-elica a β-foglietto è coinvolta nella patogenicità della proteina (Angot and Brundin,
2009; Angot et al., 2010; Wood et al., 1999; Yonetani et al., 2009).
Proprio per questo motivo le patologie causate da α-syn si pensa siano dovute a particolari tipi di proteina che presentano caratteristiche più aggressive (Bousset et al., 2013), la cui diffusione in tutto il cervello è correlata alla progressione dei sintomi clinici nel Parkinson (Braak et al., 2003a). Braak nel suo lavoro ha definito la progressione delle lesioni causate da α-syn: prima nel tronco encefalico e nel bulbo olfattivo, poi procedono caudo-rostralmente al mesencefalo e alle aree corticali (Braak et al., 2006). Inoltre, poiché è stato scoperto che la somministrazione intra-gastrica di rotenone nei ratti ha provocato una patologia di Lewy, apparsa prima nel sistema nervoso enterico e poi diffusa nella sostantia nigra degli animali (Pan-Montojo et al., 2010), è stato supposto che α-syn possa agire come agente patogeno esogeno all’inizio del morbo di Parkinson, attraverso cambiamenti strutturali, formazione di aggregati intracellulari, meccanismi di propagazione (Braak et al., 2003b; Hawkes
et al., 2009).
Secondo gli studi di Kordower et al., 2008 e Li et al., 2008 è emerso che cellule dopaminergiche embrionali umane trapiantate nello striato di pazienti affetti da Parkinson hanno sviluppato corpi di Lewy, evidenziando la possibile trasmissione da cellula a cellula di α-syn. Per studiare il processo di propagazione di α-syn in vivo sono stati utilizzati modelli Parkinson di roditori, indotti inoculando in topi asintomatici omogenati cerebrali ottenuti da
animali che sovraesprimono A53T α-syn mutante (Luk et al., 2012b; Mougenot et
al., 2012) o fibrille di α-syn umana (Luk et al., 2012a; Masuda-Suzukake et al., 2013; Paumier et al., 2015). In entrambi i casi, la proteina esogena è stata trovata in aree
cerebrali distanti dal sito di iniezione, suggerendo così che l’ α-syn iniettata è in grado di propagarsi. Un altro dato che ha supportato la propagazione di α-syn è stata la comparsa di inclusioni della proteina sia nel cervello che nel midollo spinale insieme a difficoltà motorie in seguito all’iniezione intramuscolare e gastrica di α-syn (Holmqvist et al., 2014; Sacino et al., 2014). Un altro dato importante che è emerso da questi studi è che α-syn è in grado di attraversare la barriera emato-encefalica e di accumularsi nei neuroni corticali e nel midollo spinale inducendo un'attivazione microgliale diffusa (Peelaerts et al., 2015). Inoltre l’α-syn umana che deriva dai corpi di Lewy di pazienti affetti da Parkinson è in grado di indurre sinucleinopatie nelle scimmie in seguito alla sua somministrazione a livello della substantia nigra (Recasens et al., 2014). Tuttavia, non ci sono prove per un'infettività tra gli organismi dovuta a α-syn, quindi, al momento, e secondo l'attuale definizione di prione, non è possibile stabilire che α-syn segua completamente un meccanismo simile a un prione per indurre la patologia (Irwin et al., 2013).
1.2 α-sinucleinopatie
1.2.1 Definizione delle α-sinucleinopatie
Con il termine “α-sinucleinopatie” si fa riferimento a dei disturbi neurodegenerativi caratterizzati da un'alterazione della α-syn nei neuroni e/o nelle cellule gliali. Le α-sinucleinopatie sono patologie che comprendono sia disturbi sporadici che genetici; inoltre, le alterazioni della proteina si osservano spesso in associazione ad altre malattie neurogenerative (Kovacs et al., 2008). Dal 1997, con lo sviluppo delle tecniche immunoistochimiche (IHC), è stato possibile individuare le α-sinucleinopatie sia nel cervello, che negli altri organi (Spillantini et al., 1997). Grazie alle tecniche immunoistochimiche, i neuropatologi hanno scoperto un numero relativamente alto di soggetti che presentavano filamenti di α-syn ma che, al tempo stesso, erano privi di sintomi clinici (Parkkinen et al., 2005a, 2007; Zaccai et al., 2015 ; Elobeid et al., 2016).
1.2.2 Eziologia delle α-sinucleinopatie
L'eziologia delle α-sinucleinopatie non è ancora del tutto chiara, ma sembra che comprenda sia fattori genetici che ambientali. Per verificare l’impatto dei vari fattori ambientali e dello stile di vita sull’insorgenza delle α-sinucleinopatie sono necessari studi prospettici, nonché una valutazione dettagliata dei fattori
genetici, seguita da una valutazione sistematica delle alterazioni neuropatologiche.
Per quanto riguarda i fattori genetici, sono stati individuati numerosi geni di interesse, che possono causare disturbi autosomici dominanti o recessivi (Wirdefeldt et al., 2011; Houlden e Singleton, 2012). Tra i fattori ambientali che sono stati studiati quelli più interessanti sono pesticidi, erbicidi, insetticidi, fungicidi, metalli, solventi organici, campi magnetici, fumo, alcool, indice di massa corporea e fattori dietetici (Wirdefeldt et al., 2011).
1.2.3 Aspetti clinici
Il termine malattie dei corpi di Lewy (LBD) è stato utilizzato per la prima volta nel 1980 da Kosaka e colleghi ed oggi comprende un vasto numero di patologie, quali morbo di Parkinson, morbo di Parkinson con demenza, demenza con corpi di Lewy (Kosaka, 2014). Accanto alla LBD, esiste un’altra patologia chiamata atrofia multisistemica (MSA), caratterizzata dalla presenza dell’ α-syn patologica, soprattutto a livello delle cellule gliali.
1.2.3.1 Morbo di Parkinson
Il morbo di Parkinson è la più comune delle α-sinucleinopatie. E’ una malattia neurodegenerativa cronica che colpisce il Sistema Nervoso Centrale ad andamento lento e progressivo. È causata dalla degenerazione dei neuroni
dopaminergici che sono localizzati a livello della substantia nigra e che producono come neurotrasmettitore la dopamina. Questo neurotrasmettitore agisce da messaggero chimico sulle cellule nervose del tessuto striato portando informazioni fondamentali per il controllo dell’equilibrio, dei movimenti e della postura. La minor produzione di dopamina comporta uno squilibrio tra i meccanismi che promuovono e, al tempo stesso, inibiscono il movimento.
È stato riportato che l'età minima di insorgenza varia da 28 a 87 anni, con un'età media di insorgenza a 65 anni (Lawton et al., 2015). Il morbo è caratterizzato da tre sintomi clinici significativi: bradicinesia asimmetrica (rallentamento dei movimenti volontari), rigidità muscolare e tremore a riposo. Altri sintomi clinici caratteristici del Parkinson comprendono problemi sensoriali, del sonno ed emotivi, disturbi della motilità gastrointestinale, scialorrea, ortostatismo, disturbi del sonno con movimento rapido degli occhi, parestesie sensoriali o dolore, nonché disturbi cognitivi. I pazienti possono essere suddivisi in quattro tipologie principali: quelli con instabilità posturale e difficoltà di andatura, morbo di Parkinson a tremore, a insorgenza giovane ed a esordio tardivo (Van
Rooden et al., 2010; Thenganatt e Jankovic, 2014).
1.2.3.2 Morbo di Parkinson con demenza
Quando un soggetto con Parkinson sviluppa deficit cognitivo durante la progressione allora si definisce morbo di Parkinson con demenza. La prevalenza è stata segnalata come lo 0,3%; tuttavia, nei casi di Parkinson avanzato, la prevalenza della demenza è stata suggerita come ancora più elevata (Kovari et al., 2009; Vasconcellos e Pereira, 2015).
1.2.3.3 Demenza dei corpi di Lewy
La Demenza dei Corpi di Lewy è la seconda forma più comune di demenza dopo la malattia di Alzheimer (AD) (Heidebrink, 2002; Mayo e Bordelon, 2014): lo studio di Zhang et al. 2015 ha dimostrato che il 25% dei casi di demenza sono dovute proprio alla LBD. Dal punto di vista clinico, i pazienti affetti da LBD presentano livelli di attenzione variabili, allucinazioni e parkinsonismo (Mayo e
Bordelon, 2014). Nella LBD il declino cognitivo si manifesta circa un anno prima
del declino motorio. La prevalenza di LBD è più alta (0,7%) rispetto alla prevalenza del Parkinson con demenza (0,3%) (McKeith et al., 2004).
1.2.3.4 Atrofia multisistemica
Il termine atrofia multisistemica (MSA) è stato coniato da Graham e Oppenheimer nel 1969. L'MSA incorpora disturbi come l'atrofia olivopontocerebellare, la sindrome di Shy-Dragers e la degenerazione striatonigrale.
La prevalenza di MSA si aggira intorno ai 4-5 casi ogni 100.000 persone (Vanacore et al., 2001). L'età di insorgenza è compresa tra 40 e 60 anni e colpisce prevalentemente gli individui di sesso maschile. L’MSA è una malattia progressiva sporadica con un tasso di sopravvivenza medio di 6-10 anni dopo l’insorgenza della malattia (Wenning et al., 2013).
I sintomi dell'MSA comprendono parkinsonismo, atassia cerebellare, insufficienza autonomica, debolezza motoria e declino cognitivo (Gilman et al.,
2008). Gli ultimi criteri diagnostici proposti per un probabile MSA includono
caratteristiche come l'insufficienza autonomica e almeno uno dei seguenti: parkinsonismo o sindrome cerebellare (Fanciulli e Wenning, 2015). In particolare, quando un soggetto presenta come sintomo prevalente la sindrome cerebellare, si parla di MSA-C; viceversa, se il soggetto presenta una sintomatologia parkinsoniana si parla di MSA-P (Gilman et al., 2008). L’incidenza della MSA-C e della MSA-P non è la stessa: secondo gli studi di Ozawa et al. del 2004 e di Geser et
al. del 2006, è stato evidenziato che l’MSA-P sembra predominare in Europa
(58%) rispetto all’MSA-C che, invece, è più diffusa in Asia (84%). Quando la malattia si trova in uno stato avanzato, la distinzione tra MSA-P e MSA-C potrebbe essere difficile (Gilman et al., 2008). La diagnosi definitiva di MSA si ha solo post-mortem, in seguito ad una conferma tramite autopsia.
1.2.3.5 Corpi accidentali di Lewy
I corpi di Lewy e le inclusioni citoplasmatiche gliali (oligodendrocitiche) possono essere osservate nel cervello di soggetti privi di sintomi clinici (Parkkinen et al., 2005a, 2007; Zaccai et al., 2015; Elobeid et al. ., 2016). Filamenti di α-syn sono stati osservati negli organi periferici di soggetti clinicamente non affetti (Gray et al., 2014; Aldecoa et al., 2015). Inoltre, i corpi di Lewy e l’α-syn patologica possono essere osservati come un'alterazione concomitante in altre malattie neurodegenerative.
1.3 Approcci terapeutici che hanno
come target l’α-syn
L'accumulo patologico dell’α-syn e dei suoi aggregati ha un ruolo centrale nella patogenesi della malattia di Parkinson e delle altre α-sinucleinopatie correlate e l’α-syn può essere considerata come uno dei principali target terapeutici nelle sinucleinopatie.
Esistono diversi approcci terapeutici in fase di sperimentazione. Possiamo descrivere, in particolare, approcci volti a ridurre la produzione di α-syn, ad inibirne l'aggregazione all'interno delle cellule, a promuovere la sua degradazione all'interno o all'esterno delle cellule.
1.3.1 Riduzione della produzione di α-syn
La riduzione della produzione di α-syn ha un ruolo fondamentale nella patologia di Parkinson, dal momento che la duplicazione e la triplicazione del gene di α-syn causano la patologia (Chu and Kordower, 2007; McCormack et al.,
2012). Ridurre i livelli di α-syn nel citoplasma può ridurre il rischio che la
proteina oligomerizzi e adotti una conformazione atta allo sviluppo della patologia.
Una strategia che permette di ridurre la produzione di α-syn prevede l’utilizzo di un RNA interferente (RNAi). Una prima ricerca ha testato le molecole di RNA che hanno come target l’α-syn attraverso l’utilizzo di RNAi in colture cellulari simili a neuroni e in modelli murini.
Secondo gli studi di Lewis et al., del 2008 e di Sapru et al., del 2006, l'RNA dell’α-syn a forcina corta (sh), attraverso un vettore lentivirale, silenziava l'espressione ectopica dell’ α-syn umana nel nucleo striato del ratto. Inoltre, il piccolo RNA (shRNA) interferente diretto contro l’α-syn riduceva l'espressione dell’α-syn endogena, dopo un'infusione di due settimane nell'ippocampo di topo. Con questi trattamenti non sono stati segnalati segni di tossicità.
In un altro trial, Burton e colleghi hanno ridotto la quantità di α-syn del 35% nei ratti che ricevevano infusioni di shRNA (Zharikov et al., 2015). In seguito a questi trattamenti, non sono stati osservati segni di grave tossicità; tuttavia, sono stati trovati dei cambiamenti strutturali e funzionali nel cervello dei ratti trattati di tipo negativo.
L’α-syn, però, ha un ruolo estremamente importante nel sistema nervoso centrale e per questo motivo si deve operare cautamente nella progettazione di terapie volte a ridurre drasticamente i livelli della proteina con lo scopo di ridurre eventuali neuro tossicità. Nello studio di Manson e colleghi, infatti, è stato possibile osservare una degenerazione del sistema nigrostriatale in seguito all’utilizzo di vettori virali che permettevano di ottenere marcate riduzioni ( > 90%) di α-syn nella substantia nigra di ratti e primati non umani (Collier et al.,
2016; Gorbatyuk et al., 2010; Kanaan e Manfredsson, 2012).
È di fondamentale importanza anche che le terapie volte a ridurre i livelli di α-syn siano mirate specificamente al cervello, le conseguenze di una riduzione della concentrazione di α-syn in altri distretti non è ancora del tutto chiara. Un altro metodo per ridurre la produzione della proteina è quello di modificare la trascrizione del gene SNCA dell’α-syn. In una pubblicazione, Scherzer e colleghi (Mittal et al., 2017) hanno identificato l’agonismo del beta-2-adrenorecettore come un meccanismo utile per ridurre l'espressione genica dell’α-syn. Gli agonisti del beta-2AR come il clenbuterolo, farmaci attualmente utilizzati per la cura dell’asma, hanno ridotto l'espressione dell’α-syn di oltre il
35%, in modo dose-dipendente, in una linea cellulare di neuroblastoma e nei neuroni corticali del ratto. Dal punto di vista del meccanismo, i ligandi beta-2AR modulano la trascrizione del gene SNCA attraverso l’acetilazione dell'istone 3 a livello della lisina 27. Questo studio pre-clinico è supportato dai risultati di due studi epidemiologici condotti in Norvegia. Tali studi hanno messo in evidenza che trattamenti con salbutamolo, agonista beta-2AR, sono associati ad un minor rischio di insorgenza di Parkinson e che, al contrario, il propanololo antagonista beta-2AR è associato ad un aumentato rischio di sviluppo (Mittal et al., 2017).
1.3.2 Inibizione dell’aggregazione di α-syn
Utilizzando delle strategie volte ad inibire l’aggregazione dell’α-syn, si può evitare tutti quei fenomeni di tossicità che derivano da un mal ripiegamento (misfolding) della proteina stessa. Il processo di aggregazione delle proteine può essere ostacolato dalle proteine dello shock termico (HSP), in particolare dalle piccole HSPs (chaperoni molecolari). Gli chaperon molecolari hanno una struttura complessa e agiscono realizzando un ambiente chiuso per le proteine in fase di ripiegamento che le protegge totalmente durante il processo. Numerose HSP hanno mostrato peculiari capacità nella riduzione dell'aggregazione di α-syn sia in vitro che in vivo; in particolare, le piccole HSPs sono più efficaci quando la formazione degli aggregati è lenta (come accade nelle malattie degenerative) (Gorenberg e Chandra, 2017; Klucken et al.,
prevedono l’utilizzo di strategie volte a studiare i livelli delle HSPs nel Parkinson.
Un ulteriore approccio per ridurre l’aggregazione di α-syn all’interno delle cellule prevede l’utilizzo di anticorpi che, legandosi ai monomeri di α-syn, impediscono l’aggregazione della proteina. Diversi anticorpi, in vitro, sono in grado di legare in modo specifico diverse forme di α-syn (monomeriche, oligomeriche, fibrillari) e diversi target di α-syn, come ad esempio componente non amiloide, ovvero NAC; regione C-terminale(Bhatt et al. 2013).
Dati emergenti suggeriscono che gli anticorpi possano essere neuroprotettivi attenuando, neutralizzando e modulando l’α-syn aggregata, attraverso l’interferenza con la regione soggetta ad aggregazione (NAC). Ad esempio, il nanobody-VH14*PEST ha come target la regione NAC dell’α-syn e il nanobody NbSyn87 è specifico sia per la regione C terminale dell’α-syn sia per le forme fibrillari della proteina (De Genst et al., 2010). É stato dimostrato che i nanobody VH14*PEST e NbSyn87 possono essere in grado di diminuire la concentrazione di α-syn solubile e, di conseguenza, prevenire l’aggregazione della proteina stessa; in particolare, tali nanobody hanno dimostrato di essere in grado di proteggere la degenerazione nigrostriatale nei ratti iniettati per via intranigrale con un vettore virale che sovraesprime α-syn. Entrambi gli anticorpi hanno riportato ai livelli iniziali la dopamina striatale, eliminato la proteina aggregata e migliorato la funzionalità motoria. Gli anticorpi, per poter essere utilizzati a livello terapeutico, devono trovarsi nel sistema nervoso centrale ad alte concentrazioni e per periodi prolungati di tempo.
In letteratura si trovano inoltre altre sperimentazioni volte ad inibire l’aggregazione di α-syn. Per esempio, il progetto Neuropore, in collaborazione con UCB Pharma, prevede lo studio di piccole molecole guida NPT200-11, che sembra siano in grado di prevenire la formazione di aggregati tossici attraverso
l’inibizione del misfolding della proteina (Sardi S. P. Et al,. 2018) e di migliorare le misure di esito comportamentale, neuro patologico e biochimico in modelli di topi transgenici che sovra esprimono α-syn (Koike et al., 2014). Secondo gli ultimi aggiornamenti la molecola è sottoposta a studi di fase 1 in soggetti sani. Lo scopo di questo studio è determinare la sicurezza, la tollerabilità e i livelli ematici di NPT200-11 somministrato per via orale in soggetti sani. Inoltre, verrà determinata la dose massima tollerata (ClinicalTrials.gov Identifier:
NCT02606682).
Un altro progetto, Clara Bioscence, prevede invece lo studio di NPT088, una proteina di fusione che unisce l’immunoglobulina umana e un motivo di interazione amiloide generale (o GAIM). NPT088 è in grado di intervenire contemporaneamente su più proteine misfolded. In particolare, NPT088 lega aggregati di α-syn, riduce l'accumulo di proteine resistenti alla proteinasi K e ha un effetto positivo sui livelli di tirosina idrossilasi in un modello murino transgenico che sovra esprime α-syn (Krishnan et al., 2014).
1.3.3 Promuovere la degradazione degli
aggregati di α-sinucleina intracellulari
L’autofagia assume un ruolo importante nel processo di degradazione degli aggregati tossici di α-syn intracellulari (Decressac e Björklund, 2013; Decressac et
al., 2013; Spencer et al., 2009b); proprio per questo motivo si pensa che
migliorando i processi autofagici si potrebbe migliorare la clearance dell’α-syn patologica. La ripamicina e i suoi analoghi, ad esempio, sono in grado di aumentare la funzione macrofagica agendo su mTOR. Numerosi studi hanno confermato che questa classe di farmaci è in grado di ridurre l’aggregazione di
α-syn e la sua tossicità in vari modelli cellulari e animali basati sull'espressione eccessiva (Moors et al., 2017). La ripamicina e i suoi analoghi, però, non hanno un’azione specifica sull’α-syn e possiedono diversi effetti collaterali. Proprio per questo motivo il loro uso nel trattamento del Parkinson è piuttosto limitato. Un’altra molecola in grado di aumentare la funzione autofagica è il trealosio, una molecola di zucchero presente in molti organismi. Il trealosio, in particolare, agisce sulla biogenesi lisosomiale, determinando un aumento della clearance degli aggregati proteici (Ghavami et al., 2014). Uno studio, tuttavia, ha riferito che il trealosio non è in grado di proteggere i neuroni corticali in coltura dalla tossicità in un modello che prevede l'esposizione a fibrille preformate α-syn (Redmann et al., 2017).
Un'altra strategia per ottenere l'inibizione di mTOR funziona riducendo il trasporto di piruvato nei mitocondri, attraverso l’utilizzo di un modulatore del carrier di piruvato microcondriale chiamato MSDC-0160. Questo farmaco ha effetti immediati sul consumo di ossigeno mitocondriale nelle cellule stressate (neuroni del mesencefalo esposti a un inibitore della catena di trasporto degli elettroni,) (Ghosh et al., 2016). Dopo 24 ore, si ha la conseguente inibizione di mTOR e una aumentata autofagia nei neuroni. Di conseguenza, MSDC-0160 protegge i neuroni del mesencefalo dalla morte indotta dall’inibitore della catena di trasporto degli elettroni (Ghosh et al., 2016), migliora l'autofagia e protegge i neuroni della dopamina naturale in un modello di topo genetico "cronico" di Parkinson.
Il Nilotinib è un farmaco approvato per la leucemia mieloide cronica (tumore dei globuli bianchi) ed ha come target proteico il c-abl, che viene inibito. Il c-abl è un oncogene virale di leucemia murina Abelson trovato nelle cellule, ed, inoltre, c-abl assume un ruolo fondamentale nella regolazione di numerosi processi fisiologici come la crescita cellulare, differenziamento, proliferazione, sopravvivenza e fosforilazione delle proteine a valle (Brahmachari et al., 2017;
