La grave ipotonia e la concomitante cataratta congenita riscontrate nella primogenita, avevano posto il sospetto di un’origine genetica del quadro clinico.
Tuttavia, inizialmente, non vennero eseguite le analisi genetiche per il mancato consenso da parte dei genitori.
A seguito della nascita della seconda figlia a poco più di un anno di distanza dalla prima, con cataratta congenita e ipotonia come la sorella maggiore, l’ipotesi dell’origine genetica divenne più forte e i genitori diedero il consenso per le analisi genetiche.
Questa ipotesi veniva formulata anche perché le indagini perinatali risultavano negative per qualsiasi malattia infettiva, o causata da fattori teratogeni, sviluppata durante la gravidanza. Tra queste sono state eseguite le indagini di screening per toxoplasmosi, rosolia, infezioni da parte di citomegalovirus e herpes virus.
Un ulteriore esame eseguito è stata la risonanza magnetica dell’encefalo che ha permesso di evidenziare ipoplasia del corpo calloso in entrambe le sorelle e ingrandimento dei ventricoli laterali e terzo nella maggiore. Dopo aver ottenuto il consenso informato, sono state eseguite le analisi genetiche su campioni di sangue delle bambine e dei loro genitori.
Un totale di 114 geni (vedi tabella 3) sono stati analizzati tramite il kit Agilent SureSelect Custom Target enrichment (congenital cataract v2) e sequenziati tramite il macchinario HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA).
Quest’ultimo utilizza le tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e a differenza del sequenziamento tradizionale col metodo Sanger, consente di sequenziare moltissimi frammenti di DNA in parallelo.
Il DNA viene frammentato in maniera casuale, e i frammenti così ottenuti vengono ancorati al supporto, su cui avverrà il sequenziamento, tramite delle sequenze predefinite dette adattatori.
Ogni frammento di DNA viene amplificato più volte, generando così dei cluster.
Il sequenziamento vero e proprio prevede l’utilizzo di deossiribonucleotidi marcati, ognuno con un gruppo fluorescente di colore diverso: in base a
43
quale nucleotide viene inserito nella sequenza, viene generata una fluorescenza di colore diverso che viene letta da un’apposita telecamera.(60)
Con questa tecnica di sequenziamento sono state identificate due mutazioni eterozigoti del gene RAB3GAP1, che sono state confermate successivamente col sequenziamento bidirezionale di Sanger.
La tecnica ideata da Sanger prevede l’utilizzo di deossinucleotidi e di dideossinucleotidi marcati (radioattivamente o per fluorescenza) che se incorporati nel filamento di DNA in trascrizione, ne determinano la terminazione prima della fine della sequenza stampo.
Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro reazioni diverse, ognuna delle quali presenta tutti e quattro i deossinucleotidi, uno solo dei dideossinucleotidi marcati e la DNA polimerasi.
Si originano in questo modo frammenti di DNA di lunghezza diversa, interrotti nel punto di incorporazione del dideossinucleotide al posto del deossinucleotide.
Successivamente viene fatta una corsa elettroforetica su gel: ognuna delle 4 reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica o sotto luce UV, e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra o sul gel, a seconda del tipo di marcatura dei dideossinucleotidi.(61, 62)
Tabella 3. Geni testati e numero di collocazione della sequenza
Nome del gene Numero di collocazione della sequenza
ADAMTSIO NM_030957.2 LTBP2 NM_000428.2 ADAMTSL4 NM_019032.4 MAF NM_005360.4 AGK NM_0113238.3 MAN2A NM_002372.2 AGPS NM_003659.3 MAN2B1 NM_000528 AKR1E2 NM_001040177.1 MFSDBL NM_152599.3 ALDH18A1 NM_002&30.3 MIP NM_012064.3 B3GALTL NM_194318.3 MIR1B4 NR 029705.1 BOOR NM_017745.5, NM_C011233&5.1, NM 001123384.1 MYH9 NM_002473.4 BFSP1 NM_001195.3 NDP NM_000266.3 BFSP2 NM_003571.2 NF2 NM_000268.3 ,NM_016418.5, NM_181832.2
44 CBS NM_001178008.1 NHS NM_198270.2, NM_001136024.2 CHMP4B NM_176812.4 OCRL NM_000276.3 COL2A1 NM_001844.4 OPA3 NM_001017989.2, NM 025136.3 COL4A1 NM_001845.4 PAX6 NM_091604.4 COL11A1 NM_0011354.3 PEX1 NM_000466.2 CRYAA NM_000394.2 PEX12 NM 000286.2 CRYAB NM_001885.1 PEX13 NM_002618.3 CRYBA1 NM_005208 PEX16 NM_057174.2,NM_004813.2 CRYBA4 NM_001886.2 PEX2 NM_001172086.1 CRYBB1 NM_001887.3 PEX26 NM_017929.5 CRYBB2 NM_000496.2 PEX3 NM_003630.2 CRYBB3 NM_004076.3 PEX6 NM_000287.3 CRYGC NM_020989.3 PEX7 NM000288.x CRYGD NM_006891.3 PEXSL NM_016559.2 CRYGS NM_017541.2 PEX10 NM_153818.1 CYP27A1 NM_000784.3 PEX116 NM_0038462 CYP51A1 NM 000786.3 PEX14 NM_004565.2 DHCR7 NM_001360.2 PEX19 NM_002857.3 EPHA2 NM_004431.3 PITX2 NM_000325.5,NM 153426.1 ERCC2 NM_000400.3 PITX3 NM_0050291 ERCC3 NM_000122.1 POMTI NM_007171.3 ERCC6 NM_000124.2 PONsT2 NM_013332.5 ERCC8 NM_000082.3 PVRt.3 NM_015480.1 EYA1 NM_172058.2, NM 172060.2 PXDN W4_012293.1 FAM126A NM_032581.3 RAB18 NM_021252.3, NM_001256410 FBN1 NM_000138.4 RAB3GAP1 NM_001172435.1 FKRP NM_001039885.2 RAB3GAP2 NM_012414.3 FKTN NM_006731.2 RECQL2 NM_000553.4 FOXC1 NM_001253.2 RNLS NM_0010317092, NM_018363.3 F0XD3 NM_012183.2 SC5DL NM_001024956.2 FOXES NM_012186.2 SEC23A NM_006364.2 FTL NM_000146.3 SIC NM_001037633.1 FYCO1 NM_024513.2 SIXS NM_175875.4 FZD4 NM_012193.3 SIX6 NM_007374.2 CALM NM_000154.1 SLC16Al2 NM_213606.3 GALT NM_000155.2 SLC2A1 NM_006516.2 GCNT2 NM_145649.4, NM_145655.3, NM_001491.2 SLC3341 NM_ 004733.3 GJA1 NM_000165.3 SOLH NM_005632.2 GJA3 NM_021954,3 SOX2 NM_003100.3 GJA8 NM_005267.4 SRD5A3 NM_024592.4 GNPAT NM_0142363 SREBF2 NM_004599.2 HMX1 NM_018942.2 TDR07 NM_014290.2
45
HSF4 NM_001040667.2 TFAP2A NM_003220.2, NM_001042425.1, NM_001032280.2 JAMS NM_032801.3 TMEM70 NM_017866.5 LARGE NM_004737A TMEM114 NM_001146336.1 LMX1B NM_001174146.1 VIM NM_003380.3
46 15. RISULTATI
I dati ottenuti dal sequenziamento, sono stati mappati utilizzando come riferimenti, Genome Analysis ToolkitLite-v2.0.39 e hg19 human genome. Due nuove mutazioni eterozigoti sono state identificate nel gene RAB3GAP1 (sequenza di riferimento NM_001172435) e confermate tramite il sequenziamento bidirezionale di Sanger: c.519G>A, p. (Trp173Ter) e c.2486T>A, p. (Leu829Ter). (vedi figura 3)
Le stesse mutazioni erano presenti in entrambe le sorelle.
L’analisi genetica dei genitori ha dimostrato che sono portatori sani, ciascuno per una delle due mutazioni: il padre è portatore di c.519G>A, p. (Trp173Ter), mentre la madre è portatrice di c.2486T>A, p. (Leu829Ter). (vedi figura 4)
Le mutazioni descritte consistono entrambe in sostituzioni di una singola base che risiede in un esone della sequenza di codificazione (c.519G>A nell’esone 7 e c.2486T>A nell’esone 21, rispettivamente). Lo score PhastCons (tra 0 and 1) e lo score phyloP (tra -14 and +6), che sono metodi per determinare il grado di conservazione di un dato nucleotide, hanno mostrato che i nostri nucleotidi alterati appartengono ad elementi conservati, enfatizzando la loro rilevanza funzionale per il prodotto proteico finale (c.519G>A; phastCons=1 e phyloP =5.15- 5.15- 3.14/ c.2486T>A; phastCons=1 e phyloP =0.087- 4.457- 0.566).
Le analisi eseguite in silico, utilizzando il programma Mutation Taster
(www.mutationtaster.org) hanno predetto che potrebbero essere
responsabili della comparsa di codoni di stop prematuri e potrebbero cambiare i programmi di splicing modificando la attività dei siti di splicing donatori.(63)
Infatti la mutazione c. 519G>A prevede la sostituzione di una Guanina con una Adenosina e di conseguenza il passaggio dalla tripletta TGG a TGA che è una sequenza di stop.
La mutazione c. 2486T>A prevede la sostituzione di una Timina con una Adenosina e quindi la formazione di una tripletta di stop TAG. (vedi figura 3).
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Inoltre si ritiene che queste alterazioni inducano un decadimento mediato da un nonsenso del RNA messaggero.
Le mutazioni identificate non sono mai state descritte finora in letteratura, ma interessano una regione critica del gene e perciò è legittimo pensare ad una relazione causale tra le alterazioni genetiche e il quadro clinico delle pazienti.
Tuttavia mancano degli studi molecolari che consentano di capire gli effetti biologici di queste nuove mutazioni del gene RAB3GAP1.
Come descritto in letteratura le nostre pazienti presentano il seguente quadro clinico.
Dal punto di vista oculare: cataratta congenita bilaterale, microftalmia e pupilla piccola atonica. Non manifestano apparenti danni del nervo ottico, ma sappiamo che questo può svilupparsi durante la crescita dei bambini affetti.
Dal punto di vista neurologico si riporta, come descritto in letteratura, ritardo cognitivo, del linguaggio e alle immagini di risonanza magnetica encefalica anche atrofia del corpo calloso in entrambe le sorelle.
Dalla valutazione clinica tuttavia, entrambe le sorelle hanno presentato progressi dopo la riabilitazione visiva e fisioterapica, ed hanno acquisito la capacità di mantenere la posizione seduta e di afferrare oggetti,
Figura 3. Elettroferogramma dei pazienti e dei loro genitori non affetti. Le basi alterate sono indicate con gli asterischi e i riquadri rossi
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dimostrando un’ipotonia degli arti superiori più lieve di quella riportata in letteratura.
Si sa però che il quadro clinico può evolvere ulteriormente nel tempo, da qui la necessità di continuare i follow up oftalmologici, pediatrici e neuropsichiatrici per poter far fronte alle eventuali nuove esigenze delle bambine.
Tra queste anche la valutazione del corretto sviluppo puberale.
Figura 4. Albero genealogico familiare. (I) Genitori: hanno mutazioni eterozigoti del gene RAB3GAP1 e non sono affetti. (II) Figlie: ereditano entrambe queste mutazioni e presentano una doppia eterozigosi, presentando il fenotipo patologico.
I simboli bianchi e neri indicano rispettivamente, non affetti e affetti da Warburg Micro Syndrome
49 16. CONCLUSIONI
Le nostre pazienti sono affette da Warburg Micro Syndrome che è una sindrome autosomica recessiva. Presentano una mutazione in doppia eterozigosi del gene RAB3GAP1: c.519G>A, p. (Trp173Ter) e c.2486T>A, p. (Leu829Ter).
Le mutazioni identificate non sono mai state descritte in letteratura finora, ma interessano una regione critica del gene e perciò è legittimo pensare che vi sia una relazione causale tra le alterazioni genetiche e il quadro clinico delle pazienti.
La mutazione c. 2486T>A riscontrata nelle nostre pazienti, interessa la regione terminale dei trascritti del gene RAB3GAP1 e per questo è ragionevole pensare che questa mutazione determini la produzione di una proteina tronca ma ancora funzionante. Infatti la regione catalitica e i siti di modificazione post-traduzionale potrebbero non essere interessati, e potrebbero essere inclusi nel prodotto proteico finale.
Le nostre pazienti infatti hanno mostrato qualche lieve progresso dopo la riabilitazione visiva e fisioterapica, ed hanno acquisito la capacità di mantenere la posizione seduta e di raccogliere oggetti, dimostrando un’ipotonia minore a quella descritta precedentemente in letteratura. Tuttavia sappiamo che il quadro clinico può modificarsi nel tempo, e mancano studi molecolari al riguardo che possano sostenere questa ipotesi.
Sarebbe per questo motivo interessante riuscire a ricostruire in laboratorio la proteina RAB3GAP1 che deriva dalle mutazioni c.519G>A, p. (Trp173Ter) e c.2486T>A, p. (Leu829Ter), riscontrate nelle nostre pazienti, per valutare il grado di funzione residua della proteina stessa e quindi gli effetti biologici di queste mutazioni.
Si spera che la ricerca possa continuare, per cercare di definire meglio i meccanismi molecolari alla base di questa sindrome e trovare eventuali terapie.
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