Indigo Naturalis

Erba cinese conosciuta con il nome Qing Dai. Si tratta di un pigmento blu essiccato ottenuto da diverse specie vegetali tra cui Indigofera Tinctoria, Baphicacanthus Cusia e Polygonum

tinctorium.

Figura 20- Indigofera Tinctoria (https://www.foodforests.eu/products/indigofera-tinctoria-indigo)

La droga della pianta è rappresentata dalle foglie. Contengono: Flavonoidi, terpenoidi, alca- loidi, tannini.

I costituenti chimici che presentano attività antipsoriasica sono: Indirubina e Triptantrina L’Indirubina è in grado di inibire la chinasi ciclina-dipendente (Hoessel, et al., 1999) (Leclerc, et al., 2001), e agisce sulla trasduzione del segnale, sull’attivazione della trascrizione-3 (STAT3) (Schwaiberger, et al., 2010)e sulla proliferazione dei cheratinociti in vitro (Lin, et al., 2007) (Lin, et al., 2009) (Hsieh, et al., 2012).

La Triptantrina inibisce la produzione dell’interferone-γ da parte dei linfociti presenti nelle placche di Peyer, la sintesi di ossido nitrico e prostaglandine E2 nei macrofagi.

L’estratto di Indigo naturalis ha inibito la produzione di ossigeno e il rilascio di elastasi dai neutrofili in forma formil-metionil-leucilfenilalanina in vitro.

Triptantrina

Indirubina. Chemical name: 2H-Indol-2-one, 3-(1,3-dihydro-3-oxo-2H-indol-2-ylidene)-1,3- dihydro- (9CI).

L'uso topico di Indigo naturalis sotto forma di unguento ha migliorato lo spessore epidermico, l'infiltrazione dei leucociti e l'angiogenesi della lesione cutanea psoriasica in modo sicuro ed efficace. Allo stesso tempo, permette di modulare la differenziazione e la proliferazione dei cheratinociti umani (Lin, et al., 2009a) migliorandone la funzione di barriera dei cheratinociti (Lin, et al., 2013), inibendo il fattore di necrosi tumorale α ed inducendo l’espressione della molecola-1 della cellula di coesione vascolare in cellule endoteliali vascolari umane in vitro. La triptantrina è stata isolata da Strobilanthes cusia O. Kuntze.asan, un agente antifungino contro i dermatofiti (Honda, et al., 1979); presenta, inoltre, attività antiinfiammatoria, antian- giogenica e di immunomodulatore (Ishihara, et al., 2000) (Recio, et al., 2006) .

La psoriasi ed il cancro condividono la stessa patofisiologia vascolare di angiogenesi, e per questo la triptantrina è stata valutata per il suo potenziale effetto antiangiogenico.

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, fattore di crescita dell’endotelio vascolare) ri- copre un ruolo fondamentale nel controllo dell’angiogenesi essendo un pro-angiogenico. Allo stesso tempo, innesca il processo di proliferazione, migrazione e formazione del tubo delle cellule endoteliali vascolari (Zhou, et al., 2013) e la sua stimolazione provoca la fosforilazio-

ne delle proteine Akt e FAK a valle del processo. Akt è una proteina serina/treonina chinasi, ed è un mediatore della crescita cellulare e della regolazione del ciclo cellulare (Zhang, et al., 2013); la sua attivazione dipende dalla chinasi PI3K (Fosfoinositide 3-chinasi), infatti attra- verso la produzione di secondi messaggeri lipidici PI3K è in grado di attivare Akt dando vita alla via di segnalazione PI3K/Akt (Franke, et al., 1995). FAK (Focal Adhesion Kinase) è una proteina tirosin-chinasica in grado di agire sinergicamente con le vie intracellulari che regola- no la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione ed il differenziamento cellulare e la sopravvivenza nel processo di angiogenesi.

VEGF lo ritroviamo in quantità elevata nella lesione psoriasica infatti incide nella sua patoge- nesi (Perry, et al., 2006). La triptantrina inibisce il VEGF e le cascate di segnalazione PI3K / Akt e FAK provocando un effetto anti-angiogenico (Liao, et al., 2013). Lo studio di Liao et al. 2013, è stato condotto su cellule HMEC-1, ossia cellule endoteliali umane immortalizzate. La via del segnale della chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK), in particolare ERK1, è stata l'unica via che è stata colpita dalla triptantrina.

La triptantrina, inoltre, ha esercitato un effetto inibitorio sulla migrazione cellulare e sulla formazione del tubo delle cellule endoteliali in modo dose-dipendente.

Un ulteriore meccanismo d’azione della Triptantrina, è quello di agire sul ciclo cellulare delle cellule endoteliali vascolari umane, provocando l’arresto di G2/M. Le cicline sono una fami- glia di proteine che controllano la progressione delle cellule attraverso il ciclo cellulare for- mando complessi con CDK (Galderisi, et al., 2003). Le cicline D, E e CDK2 svolgono un ruo- lo chiave nella transizione dalla fase G1 alla fase S del ciclo cellulare (Nigg, 1995) (Resnitzky, et al., 1995), mentre la ciclina B e CDK1 contribuiscono alla transizione G2 / M (Smits V.A., 2001).

La triptantrina ha permesso l’inibizione delle cicline B ed A, ma non ha dato nessun effetto sulle cicline D ed E. Inoltre, la somministrazione più elevata ha permesso di ridurre CDK1 e CDK2.

In conclusione, l'indigo naturalis ha un effetto anti-angiogenico e la triptantrina è il suo prin- cipale componente attivo che ha mostrato questo tipo di attività. Questi risultati indicano che la triptantrina ha un effetto significativo nell’anti-angiogenesi in vivo e in vitro, e potrebbe contribuire al meccanismo terapeutico dell'indigo naturalis nella psoriasi.

L’indirubina è l’altro componente attivo estratto dalle foglie di Indigo Naturalis. Diversi studi si sono concentrati sugli effetti che produce l’indirubina sulla psoriasi, infatti è in grado di inibire la proliferazione dei cheratinociti epidermici in vitro, sopprimendo l'attivazione di

EGFR (Hsieh, et al., 2012) Gli estratti dell’Indigo Naturalis hanno, inoltre, permesso di rego- lare l'espressione di mRNA della proteina claudin-1 e hanno migliorato le giunzioni strette o tight junction nei cheratinociti primari umani (Lin, et al., 2013). Tuttavia, gli effetti dell’Indirubina sull'infiammazione mediata dalle cellule immunitarie nella psoriasi non sono stati completamente caratterizzati.

Per valutare l’efficacia dell’indirubina è stato effettuato uno studio che ha permesso di deter- minare il ruolo della molecola nella regolazione della risposta infiammatoria mediata da cellu- le T γδ nella psoriasi sia in vivo che in vitro.

Utilizzando Imiquimod su un modello di murino è stata indotta una patologia simile alla pso- riasi (van der Fits, et al., 2009).

Per effettuare lo studio, i topi sono stati divisi in sei gruppi. Tutti i gruppi, eccetto quelli nel gruppo di controllo, hanno ricevuto una dose giornaliera di 42 mg di imiquimod, (IMQ, 5%) per 7 giorni consecutivi sul dorso rasato. Mentre i topi appartenenti al gruppo di controllo e al gruppo di modello hanno ricevuto una normale soluzione fisiologica mediante somministra- zione per via intragastrica.

Dopo 7 giorni, la pelle posteriore dei topi trattati con Imiquimod mostrava eritema, ridimen- sionamento e ispessimento. I topi trattati con l'indirubina presentavano una pelle più liscia, eritemi più superficiali e squame ridotte. Il punteggio medio PASI è aumentato durante il trat- tamento con Imiquimod, mentre è diminuito nei topi trattati con indirubina e MTX. Il tratta- mento con indirubina ha permesso di migliorare le caratteristiche patologiche della lesione cu- tanea, ha inibito l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nel modello di topo in cui è stata indotta la psoriasi attraverso Imiquimod.

Per valutare l’effetto inibitorio dell’indirubina, è stata esaminata la sua efficacia sull’infiltrazione delle cellule T CD3+ nel derma, mostrando un numero inferiore delle stesse. L'infiltrazione delle cellule T nel derma e, in misura minore, nell'epidermide, era marcatamen- te più alta nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo. L'espressione di IL-17A, T γδ TCR (marker di γδ T cell) e CD11b (marker di neutrofili) nel derma è stata ridotta nel gruppo in cui è stata somministrata indirubina. Questo suggerisce che il trattamento con indirubina riduce l'espressione di IL-17A e l'infiltrazione di cellule T yδ e neutrofili CD11b+.

Nella regolazione delle risposte immunitarie della psoriasi, ha un ruolo essenziale l’attivazione di Jak/Stat. L'indirubina è in grado di regolare l'espressione e la fosforilazione delle molecole di segnalazione nei percorsi Jak/Stat in un modello di murino. L'espressione e la fosforilazione di Jak1, Jak2, Jak3, Stat1, Stat3, Stat5 e Tyk2 nelle lesioni cutanee sono state

determinate da Western Blot. I risultati hanno suggerito che l’espressione di p-Stat1, p-Stat3 e p-Jak3 sono significativamente elevate nel gruppo modello, mentre quelle di Jak1, Stat1, Stat5, p-Stat5 e Tyk2 non erano alterate. Inoltre, il trattamento con indirubina ha ridotto i li- velli di p-Stat3 e p-Jak3, ma non ha influenzato l'espressione di Jak2, p-Jak2, p-Jak1 e p- Tyk2.

Per mezzo della citometria a flusso, è stato valutato il rapporto tra cellule T γδ e cellule CCR6 + γδT nei linfonodi e nella milza. Il trattamento con indirubina e MTX ha ridotto l’elevata quantità di cellule T γδ e cellule CCR6 + γδT nei linfonodi.

Nei cheratinociti coltivati in vitro, l'indirubina ha inibito l'attivazione dell'EGFR, l'espressione del gene CDC25B indotta dall'EGF e ha soppresso l'attivazione di Stat3 (Chen, et al., 2013) (Gaitanis, et al., 2018).

I principali benefici ottenuti con l’utilizzo dell’indirubina nel trattamento della psoriasi sono:  Migliore progressione della lesione cutanea nel modello murino in cui è stata indotta

una patologia simile alla psoriasi;

 Riduzione dell'infiltrazione delle cellule T γδ, l'espressione di citochine infiammatorie e l'attivazione del pathway Jak / Stat nella lesione cutanea;

 Diminuzione della quantità di cellule T γδ nei linfonodi e nella milza;  Azione sull’espressione e la secrezione di IL-17A, sopprime Jak3 / Stat3.

La somministrazione orale di indirubina, inoltre, ha permesso di regolare la risposta infiam- matoria mediata dalle cellule T γδ, migliorando significativamente la proliferazione dei chera- tinociti, l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e dell’aspetto della lesione psoriasica. La ridotta infiltrazione delle cellule infiammatorie nella lesione può essere attribuibile alla ridotta quantità di cellule T γδ e cellule CCR6 + γδT nella milza e nei linfonodi.

In definitiva, gli studi effettuati hanno permesso di verificare l’efficacia dell’indirubina nella psoriasi, attraverso la somministrazione orale nei topi. Questi risultati sono stati ottenuti, prin- cipalmente inibendo le risposte infiammatorie mediate da cellule T γδ che coinvolgono la se- crezione di IL-17 e l'attivazione di Jak3 / Stat3.

L'Indirubina ha un forte potenziale come antipsoriasico e in altre malattie infiammatorie che coinvolgono l'infiammazione mediata da cellule T γδ.