Inibitori dell'anidrasi IX carbonica: solfonammidi fluorescenti come agenti terapeutici e diagnostic

Gli attuali metodi di misurazione dell'ossigenazione del tumore sono invasivi (microelettrodo Eppendorf) o richiedono la somministrazione di agenti chimici. Come già descritto in precedenza, le CA IX e XII sono espresse nelle cellule tumorali e possono essere utilizzate come marcatori per un ampio spettro di

64 tumori ipossici solidi motivo per cui sono state progettate diverse solfonammidi fluorescenti come strumenti interessanti per l'imaging ed ulteriori procedure diagnostiche. La maggior parte di questi composti fluorescenti è stata utilizzata inoltre per comprendere la funzione di CAIX e XII in vivo.

Uno dei composti più promettenti sviluppati fino ad ora è un derivato della fluoresceina sintetizzato attraverso la reazione della fluoresceina tiocianato (FITC) con un’omosulfanilammide aromatica ammino- sostituita. È stato dunque dimostrato che il composto 72 si lega in modo selettivo al tessuto tumorale ipossico rendendolo un candidato importante per l’imaging diagnostico di questo tipo di cancro. Questo composto presenta un Ki nei confronti della isoforma CA IX

di 24 nM e mostra un’impermeabilità di membrana[35]_.

Figura 42. Preparazione della solfonammide fluorescente (72) utilizzata come

strumento diagnostico per l'imaging del tumore ipossico. [35]

65

Introduzione alla

parte sperimentale

66 Le anidrasi carboniche (CA) sono enzimi ubiquitari e la loro presenza in tante isoforme e in tanti tessuti e rappresenta uno stimolo alla progettazione di inibitori con diverse applicazioni biomediche.

Tra i vari inibitori di CA (CAI) attualmente in uso clinico si ritrovano numerosi diuretici e agenti antiglaucoma per uso sistemico. Più recentemente, sono stati scoperti nuovi derivati che possono essere utilizzati come agenti antiglaucoma per uso topico, ma anche come farmaci anti-tumorali, anticonvulsivanti, anti- obesità o anti-infettivi. Di conseguenza, sono state sviluppate diverse classi di CAI, con l’obiettivo di inibire specificamente le isoforme di CA coinvolte nelle varie patologie sopraelencate.

Le CA vengono inibite principalmente da due classi di composti: gli anioni complessanti il metallo (come i carbossilati) e le solfonammidi/sulfamati/ sulfammidi, che generalmente si legano allo ione Zn2+ _{del sito attivo dell’enzima}

(Zinc-binders). Attraverso il “tail-aproach” su cui si basano le nuove strategie di sintesi è stato possibile ottenere solfonammidi in grado di sfruttare regioni di legame più esterne rispetto al sito attivo dell'enzima (oltre al coordinamento dello ione metallico), portando così a composti isoforma-selettivi. I dati più promettenti sono stati ottenuti dalla combinazione con gli studi di cristallografia a raggi X ad alta risoluzione condotti su addotti inibitori/enzima ed utilizzo di nuovi scaffold; tale strategia ha consentito l’identificazione di nuove classi di CAI con le desiderate proprietà fisico-chimiche e farmacologiche [36,37]_.

In questo ambito, il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi ha sviluppato nuovi derivati triciclici caratterizzati da uno scaffold

benzotiopiranopirazolico e piridotiopiranopirazolico sul quale è stata inserita una funzione benzensolfonammidica (composti 73a-e in figura 43)[42]_{. Questi}

composti sono stati progettati quali analoghi rigidi di celecoxib e valdecoxib, che, nati come inibitori delle ciclossigenasi 2 (COX-2), hanno dimostrato di essere anche potenti inibitori delle CA[38-41]_{. Entrambi i composti CLX e VLX possiedono}

un gruppo benzensolfonammidico legato ad un anello eterociclico a 5 termini sostituito. La presenza della funzione SO2NH2 sembra non essere indispensabile

67 per l'inibizione della COX-2, ma essa è essenziale per l'inibizione della CA. Il razionale alla base della progettazione dei nuovi composti 73a-e prevede di mantenere la funzione benzenesolfonammidica per il legame con lo ione Zn(II), e di esplorare chemiotipi alternativi nei quali la porzione pirazolica risulta fusa in un nucleo eterotriciclico con lo scopo di migliorare l’isoforma-selettività osservata con celecoxib e valdecoxib[42]_.

73a-e 73a: X=CH, R=OCH3 73b: X=CH, R=Cl 73c: X=CH, R=CF3 73d: X=N, R=H 73e: X=N R=CH3

Figura 43. Celecoxib (CLX), Valdecoxib (VLX), derivati benzotiopiranopirazolici e

piridotiopiranopirazolici (73a-e)[42]_. N N CF₃ S H₃C O O NH₂ O N H₃C S O O NH₂ S N N X R S O O H₂N CLX VLX

68 I composti 73a-e, così come i composti di riferimento CLX e VLX sono stati saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme umane (h) CA-I/XIV (Tabella 6) presso il laboratorio del Professor Supuran, dell’Università di Firenze.

Dall’analisi dei dati relativi ai composti 73a-e e alle molecole lead CLX e VLX, risulta, come caratteristica principale, l’elevata capacità inibitoria dei derivati 73a- e nei confronti degli isoenzimi α-CA-I e -II, mentre l’attività inibitoria verso gli isoenzimi -III, -IV, -VA, -VB, -VI, -VII, -IX, -XII, -XIII e -XIV risulta essere di due ordini di grandezza inferiore.

Tabella 6. Profilo di inibizione delle 15 isoforme umane di CA da parte dei composti 73a-e, Celecoxib (CLX) e Valdecoxib (VLX[42]_.

CLX VLX 73a-e

enzima

K

i

(nM)

α 73a 73b 73c 73d 73e CLX VLX hCAI 65 212 318 193 155 50000 54000 hCA-II 16 29 210 72 49 21 43

69 Sono stati effettuati studi cristallografici a raggi X combinati con studi di

homology modeling del composto 73e in complesso con CA-II in modo da

comprendere meglio il profilo di inibizione specifico delle pirazolo-solfonammidi verso CA ed è risultato piuttosto differente da quello dei composti di riferimento CLX e VLX. Il composto 73e va a localizzarsi in profondità all’interno della tasca del sito attivo con l'azoto solfonammidico direttamente legato allo ione zinco; l'atomo di zolfo è responsabile di una distorsione nella geometria del nucleo triciclico, ma non è direttamente coinvolto in nessuna interazione con CA-II: pertanto non risulta essenziale per l’attività. Lo scaffold triciclico dell'inibitore, si trova al di fuori del sito attivo enzimatico ed è stabilizzato prevalentemente da

hCA-III 22700 32000 28600 6400 7900 7400 78000 hCAIV 8850 7200 7140 328 7500 880 1340 hCA VA 923 440 327 476 992 794 912 hCA VB 1072 3140 3250 3180 3270 93 88 hCA VI 7116 9280 9340 8055 8140 94 572 hCA VII 609 602 628 873 912 2170 3900 hCAIX 2182 1845 2570 2340 3250 16 27 hCA XII 4550 5620 6755 5540 5870 18 13 hCAXIII 938 2810 714 4300 4630 98 425 hCA XIV 931 797 548 715 844 689 107

70 interazioni di van der Waals con residui idrofobici che rivestono la cavità del sito attivo di CA-II (figura 44) [42]_.

Figura 44. Rappresentazione del sito attivo di CA-II complessato con il composto 73e

(riportato in rosa). Lo ione zinco del sito attivo è raffigurato come una sfera grigia[42]_.

Dalla determinazione della struttura cristallina di 73e nel complesso con CA-II è emerso che tale composto risulta un inibitore altamente efficace delle isoforme CA-I e -II, mentre presenta un’affinità ridotta contro CA-IX e CA-XII, come si può riscontrare dai dati nella tabella 6. Attraverso degli studi di sovrapposizione del complesso CA-II/73e con le strutture cristalline di CA-I, CA-II e CA-XII sono stati evidenziati i residui amminoacidici che portano ad una riduzione dell'idrofobicità nelle tasche all'interno dei siti attivi di CA-IX e CA-XII rispetto ai loro amminoacidi equivalenti in CA-I e- II. Questi potrebbero essere quindi responsabili delle diverse affinità del composto 73e nei confronti delle varie isoforme di CA.

Le benzenesolfonammidi 73a-e costituiscono, pertanto, una classe di composti molto interessante in quanto inibiscono solo un numero limitato di isoforme CA fisiologicamente rilevanti. La maggiore selettività di inibizione porta al vantaggio che tali inibitori dovrebbero provocare minori effetti collaterali rispetto a quelli

71 non selettivi di vecchia generazione. Inoltre, è risultato molto significativo che i composti 73d e 73e abbiano mostrato un buon profilo di inibizione verso le CA dei micobatteri, dato che tali CA sono meno inibite dalle altre classi di solfonammidi, prospettando nuovi scenari di applicazioni terapeutiche per tali composti[42]_.

Successivamente la ricerca è proseguita con lo studio di un’altra serie di composti solfonammidici, caratterizzati da modifiche strutturali dello scaffold dei derivati della serie 73; l’obiettivo finale è sempre quello di identificare CAI quanto più selettivi possibile verso alcune isoforme.

In particolare, la serie 74a-d (figura 45) deriva formalmente dallo shift della funzione benzensolfonammidica dalla posizione 1 alla posizione 2 del sistema pirazolico dello scaffold benzotiopiranopirazolico e piridotiopiranopirazolico dei composti 73. I sostituenti in posizione 7 (R) sono stati scelti considerando i gruppi che hanno maggiormente contribuito all'attività dei composti sopra descritti 73a- e [43]_. 74a-d 74a: X=CH, R=OCH3 74b: X=CH, R=Cl 74c: X=N, R=H 74d: X=N, R=CH3

Figura 45. Composti 74a-d nei quali la funzione benzensolfonammidica si trova in

posizione 2 del sistema pirazolico[43]_.

S N N X R S O O NH₂

72 Contemporaneamente, sono stati studiati composti con uno scaffold eteropoliciclico di tipo piridotiopiranopirimidinico e benzotiopiranopirimidinico, strutturalmente correlati, omologhi superiori, del nucleo pirazolico delle serie 73 e 74. In particolare è stata effettuata la sintesi dei composti 75a-e decorati con una funzione benzensolfonammidica in posizione 2 del sistema triciclico spaziata da un linker NH (figura 46). 75a-e 75a: X=CH, R=H 75b: X=CH, R= OCH3 75c: X=CH, R=Cl 75d: X=N, R=H 75e: X=N, R=CH3

Figura 46. Composti con scaffold piridotiopiranopirimidinico (75a-c) e

benzotiopiranopirimidinico (75d-e) portanti una funzione benzenesolfonammidica legata in posizione 2 del nucleo pirimidinico mediante un linker NH[43]_.

I composti 74a-d e 75a-e sono stati saggiati per la loro capacità inibitoria enzimatica verso quattro isoforme CA fisiologicamente rilevanti, la CA-I, -II, -IX e -XII, utilizzando l’Acetazolamide (AAZ) come composto inibitore di riferimento (Tabella 7). S X R N N NH S O O H₂N

73 Tabella 7. Profilo di inibizione di 74a-d, 75a-e e Acetazolamide(AAZ)[43]_.

AAZ 74a-d 75a-e

Dai dati riportati in Tabella 7 si evince che i composti 74a-d inibiscono significativamente tutte e quattro le isoforme investigate, con costanti di inibizione che si trovano, rispettivamente, nel range di 22.5-68.4 nM verso l’isoforma umana -I, 7.1-8.5 nM verso l’isoforma -II, 6.1-7.7 nM nei confronti

N

X

R

K

i (nM)

CAI

CAII

CAIX

CAXI

74a CH Cl 41.5 8.5 6.1 68.6 74b CH OCH3 68.4 7.4 7.4 38.1 74c N H 22.5 7.1 6.3 66.7 74d N CH3 37.1 7.6 7.7 62.5 75a CH H 80.5 96.0 7.0 75.1 75b CH OCH3 66.9 63.2 22.5 48.9 75c CH Cl 84.0 218 8.7 15.5 75d N H 68.3 9.4 27.6 17.8 75e N CH3 68.9 8.0 8.1 34.4 AAZ - - 250 12 25 5.6

74 dell’isoforma -IX, 38.1-68.6 nM nei confronti dell’isoforma -XII. Dagli studi di relazione struttura- attività (SAR) è emerso che il sostituente R, cosi come l’eteroatomo X, presentano una scarsa influenza sull’attività inibitoria.

Lo shift della porzione benzenesolfonammidica dalla posizione 1 alla posizione 2 del sistema pirazolico (composti 74a-d) ha determinato una riduzione dell’isoforma-selettività di questi composti.

Dall’analisi dei dati relativi ai composti 75a-e riportati nella Tabella 7 emerge che tutte le isoforme CA investigate sono inibite dalle solfonammidi 75. L'isoforma citosolica CA-I è inibita moderatamente, con valori di Ki compresi tra 66.9 e 84.0

nM; anche in questo caso studi di relazione struttura-attività (SAR) dimostrano che la natura del sostituente R e/o dell’eteroatomo X non influenza significativamente l'attività biologica. Questo non è invece il caso dell’isoforma CA-II, per la quale si evidenzia un differente comportamento inibitorio per i composti solfonammidici 75a-e. Infatti, 75d e 75e si sono rivelati inibitori efficaci di CA-II con valori di Ki compresi tra 8.0 e 9.4 nM, mentre lo standard AAZ e i

composti 75a-c presentano un'efficacia ridotta, con Ki comprese tra 63.2 e 218

nM.

La migliore sostituzione si è rivelata quella che incorpora nello scaffold policiclico un anello piridinico e non benzenico, mentre il sostituente R non ha dimostrato avere grande influenza sul profilo di inibizione enzimatica dei composti.

Per quanto concerne l’isoforma transmembranaria CA-IX, un valido target antitumorale, è efficacemente inibita da questi derivati (Ki comprese tra 7.0 e 27.6

nM), sia dai composti con l’anello benzenico (75a-c) che da quelli con l’anello piridinico (75d-e), fusi nel sistema triciclico. Dall’analisi dei risultati emerge che, per quanto riguarda la serie di composti che presentano l’anello benzenico nel sistema triciclico, quando il sostituente R è un metossile (75b) si ha una perdita di efficacia inibitoria di almeno 3 volte rispetto a quando la posizione 2 è non sostituita (75a) o presenta un atomo di Cl (75c). Per quanto riguarda la serie dei composti piridinici (75d,e), invece, si ha un incremento di tre volte dell’attività inibitoria nei confronti di CA-IX quando il sostituente R è un metile (75e) rispetto

75 all’omologo non sostituito (75d). Anche per quanto riguarda l’isoforma transmembrana CA-XII, tali solfonammidi si sono rivelate efficienti inibitori, con valori di Ki compresi tra 15.5 e 75.1 nM. I composti con il profilo di inibizione

migliore si sono dimostrati il 75c (R=Cl) nella serie benzenica e il derivato non sostituito (R=H) 75d nella serie piridinica con valori di Ki rispettivamente di 15.5

nM e 17.8 nM (Tabella 7)[43]_.

Sulla base delle ricerche fin qui discusse, sono state progettate ulteriori modifiche allo scaffold triciclico dei sistemi appena descritti con l’obiettivo di individuare nuovi potenti inibitori isoforma-selettivi. A questo proposito, sono state studiate tre piccole serie di composti polieterociclici 76-78 (figura 47) caratterizzati dalla funzione benzenesolfonammidica primaria, fondamentale per il legame allo ione metallico nel sito attivo enzimatico. In particolare, in tutte le nuove classi, l’atomo di zolfo è stato sostituito con un gruppo metilenico bioisosterico, dal momento che gli studi condotti in precedenza avevano evidenziato che l'atomo di zolfo non fosse necessario per l'interazione di 73e con l'enzima[44]_.

76a-c 77a-c 78a-c

76a: R = H 77a: R1 = R2 = H 78a: R1 = R2 = H

76b: R = CH3 77b: R1 = R2 = CH3 78b: R1 = R2 = CH3

76c: R = C6H5 77c: R1 = C6H5, R2 = H 78c: R1 = C6H5, R2 = H

Figura 47. Benzensolfonammidi primarie in cui l’atomo di zolfo dell’anello

76 Le benzenesolfonammidi 76a-c (Figura 47) mantengono un sistema triciclico 5,6,6 analogo ai derivati 73 e 74, ma presentano un ulteriore atomo di azoto nel nucleo piridinico, convertendolo in una pirimidina; questo potrebbe eventualmente costituire un punto di interazione aggiuntivo o alternativo con l'enzima.

I derivati biciclici con scaffold tetraidroindazolico 77a-c e tetraidrochinazolico 78a-c sono stati progettati come una semplificazione strutturale rispettivamente dei composti 73 e 75, nei quali la porzione fenil- o pirido-fusa è stata rimossa e un gruppo carbonilico è stato aggiunto nell'anello non aromatico. La funzione benzenesolfonammidica, fondamentale per l’interazione con lo ione zinco, è stata mantenuta, direttamente collegata alla posizione 1 dell'anello pirazolico (77a-c) o in posizione 2 dell'anello pirimidinico mediante un linker NH (78a-c), in rigorosa analogia rispettivamente ai derivati 73 e 75.

Infine, i composti triciclici 76a-c e i derivati biciclici 77a-c e 78a-c sono stati decorati in posizione 6 con gruppi metilici o fenilici (R, R1 e R2) per valutare l'effetto di questi sostituenti sull'efficacia e selettività verso diversi isoenzimi di CA.

Tutti i nuovi composti sintetizzati 76a-c, 77a-c e 78a-c sono stati saggiati e valutati per la loro capacità inibitoria enzimatica verso quattro isoforme CA fisiologicamente rilevanti, hCA-I,-II, -IV e -IX, ed anche in questo caso il loro profilo di inibizione è stato confrontato con quello dell’Acetazolamide come composto di riferimento (tabella 8).

77 Tabella 8. Profilo di inibizione del compostio triciclico 76a-c e dei composti biciclici

77a-c e 78a-c verso la hCA-IX e livello di selettività verso tale isoforma comparato con hCA-I, -II e –IV [44]_.

76a-c 77a-c 78a-c

Da un punto di vista generale, i dati elencati nella Tabella 8 mostrano che la sostituzione bioisosterica dell’atomo di zolfo con una gruppo metilenico porta a CAI potenti, confermando la precedente ipotesi sull'assenza di un coinvolgimento diretto dello zolfo nell'interazione con l'enzima. Tutti i composti recentemente

Compd R R1 R2 Ki(nM) hCAI [hCAI/hCAIX] hCAII hCAII/hCAIX hCAIV [hCAIX/hCAIX] hCAIX 76a H 73.5 [129] 4.6 [8.1] 7.1 [12.5] 0.57 76b CH3 429.0 [61.3] 68.6 [9.8] 581.3 [83] 7.0 76c C6H5 >10000 [>1370] 4209.2 [577] 7228.7 [990] 7.3 77a H H 746.3 [143.5] 78.2 [15] 9.5 [1.8] 5.2 77b CH3 CH3 272.2 [309] 8.6 [9.8] 39.7 [45] 0.88 77c H C6H5 295.7 [405] 5.2 [7.1] 213.7 [293] 0.73 78a H H 63.9 [116] 5.2 [9.45] 73.0 [132.7] 0.55 78b CH3 CH3 633.4 [712] 8.2 [9.2] 319.4 [359] 0.89 78c H C6H5 686.3 [869] 6.0 [7.6] 78.0 [98.7] 0.79 AAZ 250 12.1 74 25.8

78 sintetizzati, sono inibitori altamente efficaci per l'isoforma hCA-IX, target associato al tumore, con livelli di potenza nel range del basso nanomolare/subnanomolare (Ki da 7.3 a 0.55 nM) ed un incremento di attività di

diverse volte rispetto al composto di riferimento AAZ (Ki 25.8 nM).

L'isoforma citosolica hCA-I è solo moderatamente inibita dai composti 76-78, mentre attività diverse si osservano nei confronti degli isoenzimi CA-II e -IV. Tutti i derivati agiscono come inibitori preferenziali di hCA-IX, con rapporti di selettività che vanno da 61.3 a> 1370 vs hCA-I, da 7.12 a 577 vs hCA-II, e da 1.8 a 359 vs hCA- IV. In particolare, il passaggio dallo scaffold piridotiopiranopirazolico di 73d-e allo

scaffold pirazolodiidrochinazolinico di 76a-c produce una modifica nel profilo di

inibizione di hCA, che diviene variabile e dipendente dal sostituente in posizione 7. Il composto non sostituito 76a mostra un incremento di attività verso tutte le isoforme testate, ma, in particolare per l'isoforma CA-IX; al contrario, l'inserimento di un gruppo 7-metilico o 7-fenilico su 76a, ottenendo i composti 76b-c, causa una modesta diminuzione della potenza di inibizione per hCA-IX (76a, Ki 0.57 nM; 76b, Ki 7.0 nM; 76c, Ki 7.3 nM). Tuttavia, il sostituente 7-fenilico

conferisce un alto grado di selettività nei confronti dell’isoforma hCA-IX rispetto alle altre hCA testate.

Tutti i composti caratterizzati da uno scaffold semplificato (77b-c e 78a-c), valori Ki compresi tra 0,55 e 0,89 nM), indipendentemente dalla sostituzione del nucleo

centrale sono potenti inibitori dell’isoforma CA-IX, con valori Ki di nel range del

subnanomolare (compresi tra 0.55 e 0.89 nM), con la sola eccezione di 77a (Ki 5.2

nM). Le isoforme hCA-I e -II sono scarsamente (hCA-I) o efficacemente (hCA-II) inibite dai composti 77-78 (con valori di Ki compresi tra 272.2 e 746.3 nM per

l’isoforma I e tra 5.2 e 8.6 nM per l’isoforma II); la sola eccezione a questa tendenza riguarda i composti 78a (con una Ki di 63.9 nM nei confronti di hCA-I) e 78a (con

una Ki di 78.2 nM per hCA-II), mentre valori di Ki più altalenanti sono stati

riscontrati per l’isoforma legata alla membrana hCA-IV[44]_.

Per chiarire le ragioni riguardanti l’attività e la selettività dei nuovi composti, sono stati condotti studi di docking molecolare per i ligandi 76c, 77c e 78c, scelti come

79 composti rappresentativi delle tre serie. A tale scopo, è stata impiegata l'ultima versione di AutoDock 4.2 (AD4)[44 _{in combinazione con la struttura cristallina ad}

alta risoluzione di hCA-IX legata ad un inibitore (PDB 5FL4, 1,82 Å)[45]_{. L'analisi dei}

risultati ottenuti ha rivelato che i composti 76c, 77c e 78c chelano lo zinco catalitico nel sito attivo attraverso l’azoto della porzione solfonammidica caricato negativamente; questo comportamento è coerente con la posizione assunta da tutte le altre solfonammidi testate in complesso con le CA. Inoltre, la solfonammide in ciascun composto è ben posizionata per formare un legame idrogeno con il gruppo NH di T200 (figura 48). Oltre a queste interazioni condivise tra le molecole testate, la diversa natura dello scaffold dei tre CAI selezionati induce modelli di interazione diversi con il resto della struttura proteica dell’enzima [44]_.

Figura 48. (A) Complesso 76c/hCA-IX. La molecola di inibitore è rappresentata in

colore arancio disposta all’interno della tasca del sito attivo, sul fondo della quale è alloggiato l’atomo di Zn(II), rappresentato da una sfera grigia, che viene chelato da

76c[44]_.

In particolare, il composto 76c (Figura 48) adotta preferibilmente una conformazione in cui i due atomi di azoto dell'anello pirimidinico accettano un doppio legame ad idrogeno dalle catene laterali Q71 e Q92. Presumibilmente, la

80 forte attrazione data dalla doppia interazione del legame idrogeno potrebbe spiegare l'alta affinità di 76c per hCA-IX. È interessante notare che l'anello fenilico pendente di 76c è alloggiato in una tasca idrofobica rivestita da residui amminoacidici di L91, L123 e V130. Questi amminoacidi appartengono alla cosiddetta regione "hot spot" che svolge un ruolo chiave nella selettività dei CAI, essendo altamente variabile in termini di sequenza e conformazione tridimensionale all'interno di ogni isoenzima di hCA. A questo proposito, tenendo conto della minore attività inibitoria del composto 76c nei confronti delle isoforme hCA-I e -II si potrebbe ipotizzare che il sostituente fenilico, voluminoso e lipofilo, possa trovare difficoltà ad inserirsi nella cavità piuttosto stretta degli “hot spots” di tali isoenzimi, riducendone quindi l’affinità (figura 49). Per quanto riguarda l’isoforma hCA-IV, essa presenta una regione "hot spot" rivestita da residui piuttosto idrofili, quali, N79, K95 ed E127, in cui il sostituente fenilico non impegnerebbe contatti favorevoli.

Figura 49. (B) 76c in complesso con l’atomo di Zn(II) all’interno del sito attivo di

hCA-I. (C) 76c in complesso con l’atomo di Zn(II) all’interno del sito attivo di hCA-II. In entrambi i casi la molecola di inibitore è raffigurata in arancione e la sua superficie in giallo[44]_.

81 I composti 77c e 78c, indipendentemente dalla loro chiralità, condividono una modalità di legame comune (Figura 50D) formando interazioni idrofobiche mediante forze di van der Waals favorevoli con i residui Q92, V130, L199, T201 e P203. Questi dati indicherebbero l'indipendenza del legame dal tipo di enantiomero dei composti in questione. È interessante notare che una conformazione di legame simile è stata anche verificata sperimentalmente per gli altri ligandi cocristallizzati con hCA-IX [46,47]_{. Inoltre, il loro sostituente fenilico in}

posizione 7 si posiziona nella stessa fessura "hot spot" idrofobica descritta in precedenza. Quindi, la selettività di 77c e 78c verso hCA-IX potrebbe anche essere ascritta alla difficoltà della porzione fenilica, voluminosa e lipofila, ad inserirsi nella fessura di altre hCA.

Figura 50. (D) Sovrapposizione dei composti 77c (rappresentato rosa) e 78c (in blu)

82 L’elevata potenza mostrata dalla maggior parte dei derivati recentemente sintetizzati contro hCA-IX, in combinazione con i loro significativi profili di selettività, potrebbe costituire un interessante punto di partenza per la progettazione di nuovi agenti antitumorali con effetti collaterali limitati. Infatti, a causa del suo ruolo chiave come fattore di sopravvivenza per le cellule tumorali ed il suo coinvolgimento nell'insorgenza della resistenza ai trattamenti antitumorali classici, CA-IX rappresenta un eccellente bersaglio farmacologico per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per il cancro [44]_.

Sulla base degli incoraggianti risultati riscontrati nel corso delle ricerche appena descritte, il presente lavoro di tesi si colloca in un progetto più ampio in cui sulla base della struttura dei derivati tetraidrochinazolici 78a-c, che avevano dato i migliori risultati nel lavoro precedentemente descritto[43]_{, sono state}

razionalmente progettate solfonammidi secondarie recanti un arile variamente sostituito (composti di formula generale 79 in figura 51); l’obiettivo è quello di ottenere inibitori potenti, isoforma-selettivi e con un buon profilo farmacocinetico.

79

R1 = R2 = H; R1= R2 = CH3; R1 = H, R2 = C6H5

R3 = H, 4-OCH3, 4-Cl, 4-NO2, 4-CH3, 3-OCH3, 3-Cl, 3-NO2, 3-Cl

Figura 51. Nuove solfonammidi secondarie con nucleo tetraidrochinazolico recanti

83 I CAI più ampiamente descritti sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo solfonammidico primario, che impegna efficacemente lo ione di zinco nel sito attivo enzimatico. Tuttavia, nonostante le solfonammidi primarie agiscano con un meccanismo del tipo “zinc-binders”, spesso sono associate a mancanza di selettività tra le diverse isoforme. D’altro canto, derivati solfonammidici secondari sono state recentemente riportate in letteratura come inibitori efficaci e selettivi delle isoforme hCA-IX e -XII correlate al cancro, sebbene la loro modalità di legame non sia ancora nota [49]_.

Lo sviluppo di nuovi composti caratterizzati da una solfonammide secondaria potrebbe quindi costituire un importante avanzamento delle conoscenze nel campo degli CAI, sia per quanto riguarda il loro potenziale utilizzo quali innovativi agenti antitumorali, sia per chiarire gli aspetti ancora non noti del meccanismo di

Nel documento Sintesi di nuove benzensolfonammidi secondarie con scaffold tetraidrochinazolico quali potenziali inibitori di anidrasi carbonica (pagine 63-89)