L’espressione di GLUT-1 nel tumore al pancreas

Il trasportatore del glucosio GLUT-1 risulta sovraespresso in numerosi tipi di neoplasie, quali tumore al fegato, al pancreas, al seno, all’esofago, al cervello, ai reni, al polmone, alla pelle, al colon retto, all’endometrio, alle ovaie e alla cervice [Yamamoto et al,

1990; Nishioka et al, 1992; Brown e Whale, 1993; Nagase et al, 1995; Baer et al, 1997; Haber et al, 1998; Wang et al, 2000; Cantuária et al, 2001; Rudlowski et al, 2003].

68

La presenza in alte concentrazioni di questa proteina nelle cellule maligne, rivelata dall’analisi immunoistochimica, e il conseguente aumento di consumo di glucosio ad essa collegato, denotano un aumento dell’attività proliferativa delle cellule, delle loro richieste energetiche e dell’aggressività tumorale [Birnbaum et al, 1986; Fukumoto et

al, 1988b], riflettendo la capacità di adattamento delle stesse alle avverse condizioni

dell’ambiente tumorale.

Questi cambiamenti metabolici hanno un importante valore diagnostico e prognostico e, sebbene le conseguenze di ciò non siano ancora del tutto conosciute, si può attribuire alla sovraespressione del trasportatore del glucosio GLUT-1 una significativa responsabilità clinica in numerose tipologie di neoplasia [Kátia et al, 2011].

L’analisi dell’espressione di GLUT-1 nel tumore al pancreas offre la possibilità di capire la correlazione esistente tra il trasportatore stesso e vari fattori prognostici quali il grado istologico della neoplasia, la sua dimensione, lo stato dei linfonodi e dei margini e il tasso di sopravvivenza [Basturk et al, 2011].

Basturk et al, in un’analisi immunoistochimica hanno valutato l’espressione di GLUT-1

in 94 casi di DA (pancreatobiliary-type adenocarcinoma) del pancreas e nel tessuto pancreatico normale adiacente ai DA stessi. Per ogni caso una sezione di tessuto rappresentativa è stata usata per costruire la sezione di tessuto microarray.

3.4.1 GLUT-1 nei tessuti pancreatici normali e nelle lesioni duttali non invasive

I risultati dello studio hanno mostrato che il trasportatore GLUT-1 è espresso nelle insule pancreatiche, nelle cellule perineurali, endoteliali, nei globuli rossi, ma non negli acini e nei dotti nel normale tessuto pancreatico.

69

Inoltre, è stato evidenziato un progressivo aumento nell’espressione del GLUT-1 passando da lesioni displasiche di basso grado (risultati negativi o bassi livelli di espressione limitatamente a livello subnucleare) ad alto grado, con alti livelli di espressione rilevabili in maniera evidente a livello citoplasmatico e membranoso.

3.4.2 GLUT-1 nel DA

L’espressione di GLUT-1 è stata individuata in 70 casi di DA, 31 dei quali (33%) hanno mostrato un grado minimo di espressione, 15 (16%) un grado moderato e i restanti 24 (25,5%) una significativa immunomarcatura a livello citoplasmatico e membranoso, così come anche tutti e 4 (100%) i casi di DA a cellule chiare.

3.4.3 GLUT-1 e grado istologico

In funzione del grado istologico si può rilevare un progressivo aumento dell’espressione del trasportatore GLUT-1.

Una significativa espressione è stata trovata in 5 (15%) su 33 tumori di grado 1, in 6 (19%) su 32 tumori di grado 2 e in 13 (45%) su 29 tumori di grado 3, con differenze statisticamente significative tra i tre gruppi (p=0,016).

3.4.4 GLUT-1 e parametri di stadiazione

3.4.4.1 GLUT-1 e dimensione del tumore

Un aumento dell’espressione di GLUT-1 è correlabile alla dimensione del tumore. La dimensione media dei tumori, ricavata da 90 casi, è 3,56 cm (range 0,8-10 cm). Tra questi, 18 pazienti presentano lesioni di 2 cm o meno e solo 3 (17%) mostrano una significativa espressione del trasportatore, mentre i restanti 72 pazienti presentano lesioni di dimensioni maggiori di 2 cm, con 20 casi (28%) con significativa espressione di GLUT-1.

70

La differenza tra i due gruppi è statisticamente significativa (p=0,03).

3.4.4.2 GLUT-1 e stato dei linfonodi

Le informazioni circa lo stato dei linfonodi sono reperibili in 91 casi: 25 casi hanno linfonodi negativi e di questi 7 (28%) hanno una espressione significativa di GLUT-1, 66 pazienti hanno linfonodi positivi di cui 17 (26%) presentano significativa espressione di GLUT-1.

Dai risultati si può evincere che non esistono differenze statisticamente significative tra i due gruppi (p=0,35).

3.4.4.3 GLUT-1 e stadio del tumore

Su 92 casi l’espressione di GLUT-1 si può definire significativa per 6 (33%) di 18 tumori di stadio I, 14 (31%) di 45 tumori di stadio II, 4 (15%) di 27 tumori di stadio III, 9 casi di autopsia di tumore di stadio IV, con differenze non statisticamente significative tra i gruppi (p=0,79).

3.4.4.4 GLUT-1 e stato dei margini tumorali

Dalle informazioni ricavate da 91 casi, è stato visto che 56 pazienti hanno margini negativi, 14 (25%) dei quali con significativa espressione di GLUT-1, mentre 35 pazienti hanno margini positivi, 10 (28,5%) dei quali mostrano una significativa espressione di GLUT-1.

Non ci sono differenze statisticamente significative tra i due gruppi (p=0,69).

3.4.4.5 GLUT-1 e tasso di sopravvivenza

Il tasso di sopravvivenza globale in pazienti con DA resecabile, come riportato nella letteratura, è circa 11 mesi. In particolare, la sopravvivenza mediana risulta essere 12 vs. 10,5 mesi per i casi che non esprimono o esprimono GLUT-1, rispettivamente, anche se

71

dalla curva di sopravvivenza Kaplan-Meier non emergono differenze statisticamente significative tra i due gruppi (p=0,35).

Così come non emergono differenze di sopravvivenza mediana tra i gruppi di pazienti che esprimono GLUT-1 in maniera minima, moderata o significativa (7,16, 11 mesi, rispettivamente).

3.4.4.6 GLUT-1 e mutazione K-ras

Su 20 casi di DA 16 presentano la mutazione K-ras e di questi 4 (25%) mostrano significativa positività a GLUT-1, mentre 9 pazienti che non sono colpiti da mutazione presentano lo stesso significativa positività al trasportatore.

Purtroppo, visto il limitato e non sufficiente numero di casi non è stato possibile compiere un’analisi statistica.

Come precedentemente affermato, numerosi studi hanno già dimostrato la relazione tra l’espressione del trasportatore GLUT-1, l’aggressività del tumore e la prognosi infausta, in carcinomi a cellule squamose della testa e del collo e in tumori al polmone, allo stomaco, alla cistifellea, al colon retto, al rene, alla vescica, al seno, all’ovaia e alla cervice [Younes et al, 1997a; Younes et al, 2001; Reisser et al, 1999; Haber et al, 1998;

Lidgren et al, 2008; Airley e Mobasheri, 2007; Ozbudak et al, 2009].

Di particolare importanza è però l’evidenza emergente che permetterebbe di considerare il trasportatore GLUT-1 come marker della trasformazione maligna in certi tipi di cellule [Kato et al, 2007], così come il suo aumento di espressione nel tumore al pancreas, associato sia in vitro che in vivo, con la sua invasività [Ito et al, 2004].

A seguito di queste nuove scoperte è possibile affermare che il trasportatore GLUT-1 potrebbe essere un potenziale target terapeutico il cui fine sia limitare l’uptake di

72

glucosio e il suo metabolismo e, conseguentemente, l’elevato potenziale proliferativo delle cellule maligne, inibendo infine la progressione del tumore al pancreas.

Nonostante la letteratura circa il significato biologico dell’espressione di GLUT-1 nel tumore al pancreas sia limitata e controversa e, in alcuni casi i tentativi per identificare il suo valore prognostico siano falliti [Lyshchik et al, 2007], lo studio di Basturk et al ha mostrato risultati più soddisfacenti.

La sopravvivenza mediana dei casi che non esprimono GLUT-1 è risultata più alta rispetto ai casi che lo esprimono (12 mesi vs. 10,5 mesi), anche se con differenza non statisticamente significativa.

Inoltre, lo studio ha potuto stabilire la correlazione esistente tra espressione di GLUT-1 e marker dell’aggressività tumorale, quali dimensioni del tumore e grado istologico, constatando un più alto uptake di glucosio nelle cellule pancreatiche maligne.

3.5 Target Antitumorali Nel Metabolismo Glicolitico: Inibitori Del

Trasportatore GLUT-1

Numerosi studi hanno mostrato come il trasporto del glucosio sia upregolato a seguito della sovraespressione dei trasportatori GLUTs [Kang et al, 2002; Godoy et al, 2006;

Tran et al, 2005; Amann et al, 2009; Rogers et al, 2003b; Krzeslak et al, 2012] e, dal

momento che un’aumentata concentrazione di glucosio è la responsabile della migliorata crescita cellulare tumorale, della loro sopravvivenza e della resistenza ai farmaci, l’inibizione di tali trasportatori rappresenta un’importante e un valido intervento terapeutico (Tab. 3.2).

73

Inibitori di

GLUT-1 Stato

WZB117 Studi sugli animali

STF-31 Studi sugli animali

Fasentina Studi in vitro

Apigenina Studi di fase II

Genisteina Studi di fase II/III

Derivati ossimici Studi sugli animali Derivati

pirrolidinonici Studi in vitro

Tabella 3.2 Inibitori del trasportatore del glucosio GLUT-1 (Qian et al, 2014)

Le prime molecole che hanno mostrato una certa capacità di inibizione dei trasportatori del glucosio e di attività antiproliferativa nella linea cellulare H1299 del tumore al polmone fanno parte della classe degli esteri polifenolici [Zhang et al, 2010; Liu et al,

2010b].

Il primo risultato in questo campo ha portato alla sintesi di WZB117 (Fig. 3.1), il quale è in grado di inibire per il 93% l’uptake di glucosio in un saggio standard e per il 41% il tasso di crescita delle cellule tumorali nel tumore al polmone, con una attività antiproliferativa particolarmente marcata in condizioni ipossiche e particolarmente selettiva nei confronti delle sole cellule maligne, senza alcun effetto sulla controparte non- tumorigenica.

Nel modello xenografato A549 del tumore al polmone umano, WBZ117 riduce del 70% le dimensioni della neoplasia, senza causare alcun effetto collaterale, eccetto una moderata e reversibile iperglicemia.

74

Ulteriori studi sui globuli rossi, i quali esprimono specificatamente il trasportatore GLUT-1, hanno confermato la selettività di WBZ117 per il GLUT-1 stesso e hanno visto che questo inibitore, in associazione con l’inibitore mitocondriale oligomicina, per sinergismo, può ridurre la proliferazione di cellule maligne nel modello A549; inoltre l’oligomicina a basse dosi permette di sensibilizzare le cellule stesse all’inibitore del trasportatore GLUT, portando, in co-somministrazione con WBZ117, all’induzione dell’arresto del ciclo cellulare, alla senescenza ed infine alla necrosi. Effetti sinergici sono stati dimostrati anche con cisplatino e paclitaxel [Liu et al, 2012].

Sulla base della struttura di WBZ117 sono in via di sintesi e in via di sperimentazione una nuova generazione di molecole inibitrici del trasportatore GLUT-1, con maggiore potenza d’azione e stabilità.

Un’altra piccola molecola, il cui target è rappresentato dal gene von Hippel-Lindau (VHL) difettoso nel carcinoma delle cellule renali (RCC), è STF-31, la quale inibisce selettivamente le cellule cancerose attraverso l’inibizione del trasportatore GLUT-1. L’aberrante stabilizzazione di

HIF dovuta a VHL causa una diminuita attività dei mitocondri, portando le cellule a divenire altamente dipendenti dall’uptake di

glucosio per la glicolisi e la produzione di energia.

STF-31, a seguito dell’inibizione di GLUT-1 e, di conseguenza, dell’uptake di glucosio, agisce sul carcinoma delle cellule renali, con limitata tossicità nei confronti delle cellule

75

renali normali, le quali non sono strettamente dipendenti né dalla glicosi, né dal trasportatore GLUT-1 [Chan et al, 2011].

Nonostante tutto, STF-31 rimane di spettro d’azione limitato.

La fasentina (Fig. 3.3) inizialmente era stata studiata come un composto che aumentava la morte cellulare mediata da recettori FAS in cellule cancerose FAS resistenti

[Schimmer et al, 2006].

Il suo meccanismo d’azione è stato ulteriormente delineato al momento della scoperta dell’alterata espressione dei geni associati con la privazione di glucosio e nutrimenti. Culture cellulari in mezzi con bassa concentrazione di glucosio mostrano gli stessi risultati ottenuti con la fasentina e sensibilizzano le cellule al FAS, supportando la teoria secondo la quale la fasentina sia un inibitore dell’uptake di glucosio [Wood et al, 2008].

Studi di chimica computazionale suggeriscono che la molecola interagisca con il trasportatore GLUT-1 a livello di un unico sito di legame, sul suo dominio intracellulare.

Numerosi studi chimici sostengono il ruolo della fasentina nell’inibizione del trasportatore del glucosio, nonostante studi in vivo non siano ancora comparsi in letteratura.

Un composto di origine naturale, abbondantemente presente in natura in frutta e verdura

[Patel et al, 2007], è l’apigenina (Fig. 3.4), la quale ha dimostrato avere importanti

attività antimutagene, antiossidanti, antitumorali e antiinfiammatorie [Kuo et al 1992;

Myhrstad et al, 2002; Ye et al, 2010; Shukla et al, 2010].

76

Nello studio di Melstrom et al. questo composto è stato in grado di inibire, nelle linee cellulari CD18 e S2-013 del tumore al pancreas

umano, l’uptake di glucosio in maniera dose- dipendente, agendo inibendo indirettamente, attraverso l’inibizione della cascata del segnale PI3K/Akt, sia la proteina sia l’mRNA del trasportatore GLUT-1 [Melstrom et al, 2008].

Un’altra molecola inibitrice del trasportatore GLUT-1 è la genisteina (Fig. 3.5), un isoflavone naturale presente nei semi di soia [Tarkowski et al, 2013; Nagaraju et al,

2013]. Inizialmente era conosciuta come inibitore tirosinchinasico, con effetti

terapeutici particolarmente soddisfacenti su patologie quali diabete, obesità e neoplasia, tanto da essere considerata una molecola con un promettente futuro nel trattamento delle malattie metaboliche [Behloul e Wu, 2013; Li et al, 2012].

Ad oggi la genisteina è anche un potente inibitore del trasportatore GLUT-1, poiché agisce sul trasporto di esosi e di acido deidroascorbico nella linea cellulare umana HL-60, in maniera dose-dipendente e altera il legame del glucosio a livello dello stesso trasportatore, attraverso competizione diretta [Vera et al, 1996; Pèrez et al, 2011]. Sfortunatamente, la genisteina non presenta specificità esclusiva nei confronti del trasportatore GLUT-1.

Degno di nota è anche il (+)-criptocarione (Fig. 3.6), una molecola naturale recentemente identificata tra i componenti di un estratto isolato dalle foglie e dai rami

Figura 3.4 Apigenina

77

della pianta tropicale Cryptocarya rubra, appartenente alla famiglia delle Lauraceae

[Ren et al, 2014].

L’estratto è risultato citotossico nei confronti della linea cellulare HT-29 del tumore al colon e tale citotossicità è attribuita proprio al composto diidrocalcone, così come la sua abilità nell’indurre l’apoptosi, per attivazione di una caspasi, nelle cellule maligne del tumore alla prostata

[Kurniadewi et al, 2010, Chen et al, 2010].

Inoltre, sulla stessa linea cellulare HT-29, è il responsabile di una significativa riduzione dell’uptake di glucosio, facendo quindi ipotizzare una sua attività antiproliferativa dovuta in parte alla capacità della molecola di inibire i trasportatori GLUTs.

Recentemente, alcuni membri della classe dei derivati delle ossime (derivato 1 e 2) (Fig. 3.7) hanno evidenziato una certa attività inibitoria del trasportatore del glucosio GLUT-

1, mostrando, per la presenza del gruppo OH fenolico periferico, somiglianze farmacoforiche con l’inibitore WBZ117, così come una stessa potenza di inibizione del trasporto del glucosio e dell’attività proliferativa delle cellule

tumorali, pur mantenendo però una struttura chimica di base differente così da costituire un nuovo potenziale gruppo di composti inibitori del trasportatore GLUT-1 stesso

[Tuccinardi et al, 2013].

Figura 3.6 (+)-criptocarione

78

Grazie alle moderne tecniche di simulazione al computer è stato possibile rilevare il sito di legame dei derivati delle ossime sul trasportatore, il quale corrisponde a quello della genisteina [Afzal et al, 2002].

Dai risultati della simulazione e dalla conoscenza della struttura base di questa classe di composti è possibile porre le basi per la realizzazione di una futura generazione di inibitori GLUT-1.

Utilizzando tecniche di screening ad alto rendimento, accoppiate con saggi per il lattato, l’arresto del ciclo cellulare e l’ATP, sono stati identificati due importanti inibitori GLUT-1 di derivazione pirrolidindionica, i quali agiscono selettivamente sul trasporto del glucosio mediato da vescicole di membrana di derivazione eritrocitaria

[Ulanovskaya et al, 2011].

Purtroppo, ad oggi, non ci sono ancora studi in vivo su questi composti.

Un’altra importante classe di composti è rappresentata dai tiazolidindioni (derivati 3 e 4) (Fig. 3.8), sviluppati dopo aver osservato che l’agonista del recettore della proliferazione perossisomale γ (PPARγ)

esercita parte della sua azione attraverso l’inibizione del trasporto del glucosio [Wang

et al, 2012].

Il derivato 3 mostra un’eccellente attività inibitoria dell’uptake del glucosio e antiproliferativa nella linea cellulare LNCaP nel tumore alla prostata, con nessuna evidente tossicità nei confronti del tessuto sano.

79

Studi hanno mostrato come questo composto abbia una selettività preferenziale sul trasportatore GLUT-1 e solo debole attività su GLUT-3, GLUT-4 e GLUT-9.

Il derivato 4, con attività leggermente più bassa rispetto al derivato 1, è stato testato in vitro in associazione con gemcitabina, con il fine di ristabilire la sensibilità al farmaco nelle cellule tumorali pancreatiche resistenti, contrastando l’attivazione e l’espressione dei geni coinvolti nella riparazione del DNA come risposta al trattamento chemioterapico, e stimolando, al contrario, il danno al DNA e la morte cellulare.

I risultati di studi in vivo sul trattamento combinato derivato 2/gemcitabina hanno mostrato un significativo sinergismo, senza tossicità rilevante nei topi trattati [Lai et al,

2014].

Ulteriori inibitori del trasportatore del glucosio GLUT-1 sono i membri della famiglia delle metilxantine (derivati 5, 6 e 7) (Fig. 3.9), a cui appartengono composti naturali come la caffeina e la teofillina e derivati di sintesi come la pentossifillina.

Queste molecole sono in grado di spiazzare l’inibitore GLUT-1 citocalasina B dal suo legame con la proteina, confermando quindi la loro interazione diretta con il trasportatore stesso, in un sito di legame tuttavia differente da quello del ᴅ- glucosio [Ojeda et al, 2012].

L’ultima molecola che prenderemo in analisi e che, come riportato in letteratura [Breen

et al, 2008; Vetterli et al, 2011; Witte et al, 2013], influenza il metabolismo del

glucosio è il resveratrolo (Fig. 3.10), una fitoalessina naturale.

80

Il resveratrolo è in grado di bloccare l’uptake di glucosio e impedirne l’accumulo nelle linee cellulari HL-60 e U-937, che esprimono

specificatamente l’isoforma 1, nella leucemia. Nei globuli rossi il resveratrolo spiazza la citocalesina B dal suo sito di legame sulla proteina, mostrando la capacità della fitoalessina di interazione diretta con il GLUT-1 [Salas et al,

2013].