2.2 GLI ANTICORPI ANTI PEPTIDI CITRULLINATI
2.2.1 LA CITRULLINAZIONE DELLE PROTEINE E ALTRE MODIFICHE POST-TRADUZIONALI
Si definiscono modifiche post-traduzionali (PTMs) delle proteine quei processi biologici, regolati o meno da enzimi, che producono una trasformazione della catena amminoacidica ottenuta al termine della traduzione proteica operata dai ribosomi. Attraverso questi processi si possono ottenere fino a 140 diversi aminoacidi a partire dagli 20 amminoacidi primari [46].
Le modifiche post-traduzionali possono essere operate da enzimi che aggiungono gruppi funzionali specifici o intere molecole in determinate sedi della catena polipeptidica, come nel caso della glicosilazione (aggiunta di un polisaccaride o di un singolo carboidrato), fosforilazione (aggiunta di un gruppo fosfato), metilazione (aggiunta di un gruppo metilico), acetilazione (aggiunta di un gruppo acetile). Le PTMs non enzimatiche avvengono invece spontaneamente in condizioni di stress quali infiammazione, trauma, malattia acuta o cronica, in cui si liberano radicali liberi dell’ossigeno e agenti ossidanti che catalizzano reazioni che modificano gli aminoacidi delle proteine [23].
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Le modifiche post-traduzionali sono un processo fondamentale nella biosintesi di alcune proteine o nei processi di regolazione delle loro funzioni: la formazioni di ponti disolfuro attraverso l’ossidazione di due residui sulfidrilici -SH è spesso essenziale per la stabilizzazione della struttura della proteina (come nel caso dell’insulina, che presenta un ponte disolfuro intracatenario e due ponti disolfuro intercatenari), così come la fosforilazione o defosforilazione di recettori di membrana o di molecole che agiscono da secondi messaggeri è fondamentale per modularne la funzione in senso attivatorio o inibitorio. Le PTMs hanno un ruolo fondamentale anche in numerose funzioni del sistema immunitario, quali la produzione di citochine e l’attivazione della proliferazione. È invece ancora oggetto di studio la possibilità che le PTMs possano alterare i sistemi di tolleranza e portare a processi autoimmuni. Alla base della normale funzione di questi sistemi esistono infatti continui processi di promozione, regolazione, e modulazione della tolleranza al self, attraverso eventi di deplezione delle cellule autoreattive e induzione di tolleranza periferica; la genesi di neo-antigeni self, originatesi da modificazioni post-traduzionali della proteina mantenute in corso di processazione dell’antigene o viceversa la mancanza di PTMs su determinati antigeni self, potrebbe indurre perdita di tolleranza e portare ad una risposta autoimmune [23].
Una delle malattie autoimmuni che negli ultimi venti anni è stata oggetto di studio da questo punto di vista è l'artrite reumatoide (AR), nella quale vengono prodotti anticorpi diretti contro proteine nelle quali l'Arginina è modificata in Citrullina. Tali anticorpi vengono così definiti ACPA: anti citrullinated proteins/peptides antibodies.
2.2.2 GLI ACPA NEI PAZIENTI CON ARTRITE REUMATOIDE
Dal punto di vista storico, uno dei primi anticorpi caratteristici dell'AR ad essere rilevato è stato l’Anti-perinuclear Factor (APF), così chiamato per il caratteristico quadro di immunofluorescenza generato, che interessa i granuli perinucleari delle cellule della mucosa orale umana. Nel 1964 fu documentata la presenza di APF in pazienti con artrite reumatoide: quasi il 50% dei pazienti risultava positivo, un paziente su dodici dei controlli con Lupus Eritematoso Sistemico era positivo, nessuno dei pazienti di con Spondilite
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Anchilosante risultava positivo e tra la popolazione generale di controllo meno dell’1% presentava positività [47].
Successivamente furono descritti gli Anti-Keratin Antibodies (AKA), diretti contro le cellule epiteliali di esofago murino. La presenza di AKA in pazienti con artrite reumatoide fu dimostrata nel 1979: nello studio risultò positivo agli AKA il 68% dei pazienti, con una importante prevalenza di pazienti con noduli reumatoidi e Sindrome di Sjögren [48]. Successivi studi dimostrarono la presenza di AKA anche in pazienti negativi alla ricerca di FR e in pazienti con AR in stadio precoce [49].
Ulteriori studi su questi autoanticorpi dimostrarono che entrambi legavano la proteina filaggrina e il suo precursore, la profilaggrina. La filaggrina è una proteina filamentosa che si lega alle fibre di cheratina nelle cellule epiteliali [49]. Vennero quindi definiti anche gli AFA, Anti-Filaggrin Autoantibodies. Dal momento che la filaggrina non è una proteina di comune riscontro nel cavo articolare ma è una proteina strutturale tipica delle cellule epiteliali e dello strato
corneo dell’epidermide, venne ipotizzato che la reattività degli AFA fosse il risultato di meccanismi di cross-reattività di anticorpi prodotti in altra sede, probabilmente da plasmacellule localizzate nel cavo articolare. Due importanti studi della fine degli anni ‘90 dimostrarono che tutti questi autoanticorpi legavano epitopi citrullinati [50, 51], ovvero peptidi
o proteine nella cui sequenza amminoacidica una Arginina è stata convertita in Citrullina dall’enzima Peptidilarginina Deiminasi (PAD): APF e AKA divennero quindi i capostipiti di
Tabella 2.1 Principali specificità degli anticorpi anti
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una nuova classe di autoanticorpi, definita Anticorpi anti peptidi citrullinati (Anti- citrullinated peptide antibodies, ACPA). Negli anni successivi è stata dimostrata la presenza nel siero di pazienti con artrite reumatoide di vari tipi di ACPA, con specificità per collagene tipo II [52], fibrina/fibrinogeno [53], fibronectina [54], vimentina [55], α- enolasi [56], Antigeni Nucleari del virus di Epstein-Barr (EBNA) [57, 58].
Negli ultimi venti anni sono stati brevettati e messi in commercio numerosi test diagnostici per rilevare la presenza di ACPA nel siero: il primo basato sull’utilizzo di un peptide sintetico ciclico citrullinato (CCP) derivato dalla filaggrina, il secondo basato sull’utilizzo di numerosi peptidi citrullinati derivati dallo screening di una peptide library e dimostratisi bersaglio di ACPA; nuove metodiche in corso di perfezionamento prevedono l’utilizzo della Vimentina Mutata Citrullinata (MCV), di un peptide dell'α- enolasi deiminata (Eno-1Cit) e di un mix di peptidi derivati da EBV e istoni (anti-CP).
L’importanza del ruolo degli ACPA nella diagnostica dell’artrite reumatoide è stata recentemente confermata dalla decisione dell’American College of Rheumatology (ACR) e della European League Against Rheumatism (EULAR) di inserirli nei criteri diagnostici di artrite reumatoide nel 2010 [59].