La via di segnalazione di PI3K

La PI3K (fosfatidilinositolo-3-chinasi) è una chinasi lipidica ubiquitaria, ampiamente espressa nell'organismo, che agisce sia come trasduttore del segnale in differenti vie cellulari a seguito della stimolazione dei recettori presenti sulla superficie cellulare, sia nei processi di smistamento delle proteine. La via di segnalazione di PI3K ha un ruolo importante nelle funzioni cellulari, infatti è implicata nel controllo metabolico, nell'immunità, nell'angiogenesi e nell'omeostasi cardiovascolare ed è una delle vie più frequentemente alterate nel cancro. Tutte le PI3Ks sono enzimi a specificità duale, possiedono, infatti, un'attività lipidico-chinasica necessaria per la fosforilazione in posizione 3‘ dell'anello inositolico del fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato (PI(4,5)P2), e un'attività protein-chinasica288,289,290.

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Le PI3Ks sono suddivise in otto isoforme e in tre classi (Immagine 2): classe I, classe II e classe III che si distinguono per differenze nella struttura e nella funzione. Le PI3Ks di classe I sono ulteriormente suddivise in enzimi di classe IA, attivate dai RTKs (recettori tirosinchinasici), dai GPCRs (recettori accoppiati alle proteine G) e da alcuni oncogeni come la piccola proteina G Ras, e in enzimi di classe IB, regolati esclusivamente dai GPCRs291_.

Il tipo più implicato nell'oncogenesi è la classe IA.

Le PI3Ks di classe IA sono enzimi eterodimerici costituiti da una subunità catalitica p110 e una subunità regolatoria p85. La subunità regolatoria media il legame con il recettore, l'attivazione e la localizzazione dell'enzima. Nei mammiferi ci sono tre geni, PIK3R1,

PIK3R2 e PIK3R3, che codificano per p85α (e le sue varianti p55α e p50α), p85β e p55γ,

rispettivamente. Queste subunità regolatorie sono costituite da tre domini tra cui un dominio di legame per p110 (iSH2) affiancato da due domini Src-homology 2 (SH2), uno N-terminale e uno C-terminale. Le due isoforme più lunghe, p85α e p85β, hanno un dominio Src-homology 3 (SH3) e un dominio BCR omology (BH) situato nella regione N- terminale. I geni PIK3CA, PIK3CB e PIK3CD, invece, codificano per le isoforme catalitiche p110: p110α, p110β e p110δ, rispettivamente. Mentre l'espressione di p110δ è in gran parte limitata al sistema immunitario, p110α e p110β sono espressi in modo ubiquitario. Le isoforme catalitiche p110 sono altamente omologhe e condividono cinque domini distinti: un dominio N-terminale che lega p85 (p85BD), un dominio di legame a Ras (RasBD) che media l'attivazione dei membri della famiglia delle proteine Ras, un dominio C2 di legame alla membrana, il dominio elicoidale e il dominio catalitico.

La classe IB PI3K è un eterodimero composto da una subunità catalitica p110γ e una subunità regolatoria p101. p110γ è principalmente espressa nei leucociti e può essere attivata direttamente dai GPCRs.

Le PI3Ks di classe II sono monomeri con una sola subunità catalitica. Esistono tre isoforme di PI3Ks di classe II, PI3KC2α, PI3KC2β e PI3KC2γ, ognuna delle quali ha un dominio N-

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terminale seguito da un dominio di legame a Ras (RasBD), un dominio C2, un dominio elicoidale e un dominio catalitico con domini PX e C2 in sede C-terminale. I ruoli di segnalazione e biologici delle PI3Ks di classe II non sono chiari.

Le PI3Ks di classe III sono costituite da un'unica subunità catalitica Vps34 e da una subunità adattatrice (p150). Esiste un'unica isoforma PI3K di classe III, che controlla principalmente il traffico di vescicole intracellulari nel contesto di autofagia, endocitosi e fagocitosi. Il PI3K di classe III potrebbe anche essere coinvolto nella trasduzione del segnale, ma questo non è ancora chiaro265,266_.

Nello stato basale, p85 si lega alla parte N-terminale della subunità p110 tramite il suo dominio iSH2, inibendo la sua attività catalitica, perciò nel citoplasma delle cellule a riposo è presente il complesso p85-p110 inattivo. In seguito a stimolazione dei RTKs da parte di specifici ligandi, i recettori dimerizzano e si fosforilano in trans sui residui di tirosina presenti a livello delle loro porzioni citoplasmatiche. La dimerizzazione del recettore e la sua attivazione per fosforilazione permettono il reclutamento alla membrana plasmatica del complesso p85-p110 della PI3K tramite interazione dei domini SH2 di p85 con i residui di fosfo-tirosina della RTK. Il legame della subunità regolatoria p85 al recettore determina, a sua volta, variazioni conformazionali della PI3K che, a livello della subunità catalitica, giunge in prossimità del suo substrato lipidico292_{. Alcuni studi}

hanno dimostrato che p110 può essere attivata anche in maniera indiretta attraverso l'intervento di Ras o di molecole adattatrici, tra cui GRB2 (growthfactor receptor- boundprotein 2)293,294,295_.

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Immagine 3. Modello di attivazione di PI3K di classe Ia267

La principale conseguenza dell'attivazione di PI3K è la generazione di fosfatidilinositolo (3,4,5) -trisfosfato (PIP3) nella membrana, il quale funziona come un secondo messaggero e attiva le vie a valle che coinvolgono AKT e altre proteine. Questo avviene perché la subunità p85 perde il suo effetto inibitorio sull'attività catalitica di p110 e, successivamente, la subunità p110 fosforila il fosfatidilinositolo (4,5)-bisfosfato (PIP2), un fosfolipide localizzato all'interno della membrana cellulare, e genera PIP3267,296_.

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AKT, conosciuta anche come proteina chinasi B o PKB, è una serina/treonina chinasi espressa in tre isoforme, AKT1, AKT2 e AKT3, che sono codificate dai geni PKBα, PKBβ e PKBγ, rispettivamente. Tutte e tre le isoforme possiedono una struttura simile: un dominio PH N-terminale, un dominio catalitico serina/treonina centrale e un piccolo dominio regolatorio C-terminale. La AKT inattiva è localizzata a livello citoplasmatico, per cui l'attivazione dell'AKT avviene a partire dalla sua traslocazione sulla membrana plasmatica mediata dall'aggancio del dominio PH nella regione N-terminale di AKT a PIP3 sulla membrana, questo determina un cambiamento conformazionale di AKT, dal momento che vengono così esposti i due residui amminoacidici per la fosforilazione. A livello della membrana, l'associazione con la proteina CTMP impedisce la fosforilazione dell'AKT e, conseguentemente, la sua completa attivazione. La fosforilazione di CTMP da parte di una chinasi non ancora identificata, porta al distacco della proteina dall'AKT, permettendo dunque a quest'ultima di poter essere fosforilata266_.

Il suo residuo Thr308 viene fosforilato da PDK1, una serina/treonina chinasi contenente un dominio PH. Questa fosforilazione è necessaria, ma non sufficiente alla completa attivazione di AKT, è richiesta pertanto una seconda fosforilazione da parte del complesso mTORC2 (mammalian target of rapamycin)/Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR) sul residuo Ser473 a livello della estremità C-terminale267,297_.

Una volta fosforilato e attivato, l'AKT fosforila molte altre proteine, ad es. GSK3 (glicogeno sintasichinasi 3) e FOXO (una famiglia di fattori di trascrizione), regolando in tal modo una vasta gamma di processi cellulari coinvolti nella sintesi proteica, nella proliferazione e nel metabolismo cellulare 266_.

Le principali conseguenze biologiche dell'attivazione dell'AKT rilevanti per la crescita delle cellule tumorali possono essere suddivise in tre categorie: sopravvivenza, proliferazione (aumento del numero di cellule) e crescita (aumento delle dimensioni delle cellule). L'AKT ha effetti anche sull'angiogenesi tumorale267_.

L'apoptosi, o morte cellulare programmata, è una funzione cellulare normale che controlla l'eccessiva proliferazione eliminando le cellule "non necessarie". Le cellule tumorali hanno messo a punto diversi meccanismi per inibire l'apoptosi. Il meccanismo

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mediante il quale AKT protegge le cellule dalla morte è probabilmente multifattoriale, può agire ad esempio fosforilando BAD, un membro della famiglia delle proteine BCL2 che promuove la morte cellulare formando un etero-dimero con il fattore di sopravvivenza BCL-XL, impedendo così questa interazione e ripristinando l'azione anti-apoptotica di BCL- XL298_{. Analogamente, l'AKT inibisce l'attività catalitica di una proteasi pro-apoptotica, la}

caspasi-9, attraverso la sua fosforilazione299_{. Infine, la fosforilazione di FKHR da parte di}

AKT impedisce la sua traslocazione nucleare e l'attivazione di bersagli genetici FKHR38 che includono diverse proteine pro-apoptotiche come il ligando BIM e FAS300_{. AKT può}

influenzare la sopravvivenza cellulare anche attraverso l'azione su due regolatori centrali della morte cellulare: fattore nucleare di κB (NF-κB)301,302_{e p53. AKT può esercitare un}

effetto positivo sulla funzione dell'NF-κB mediante fosforilazione e attivazione della chinasi IκB (IKK), una chinasi che induce la degradazione dell'inibitore di NF-κB. AKT può anche influenzare l'attività di p53, attraverso la fosforilazione della proteina MDM2, un regolatore negativo della funzione p53. L'MDM2 fosforilato si trasloca in modo più efficiente al nucleo, dove può legare p53, determinandone una migliore degradazione303,304_{. Uno studio ha individuato inoltre un'altra interazione tra il pathway di}

PI3K e p53, sembra infatti che p53 possa regolare positivamente il promotore PTEN305_.

AKT può anche influenzare la proliferazione attraverso il controllo del ciclo cellulare, ha infatti un ruolo importante nella prevenzione della degradazione della ciclina D1 attraverso la regolazione dell'attività della chinasi glicogeno sintasi chinasi-3β (GSK3β). Normalmente, dopo la fosforilazione da parte della GSK3β, la ciclina D1 viene indirizzata verso la degradazione da parte del proteasoma. L'AKT fosforila direttamente GSK3β e blocca la sua attività chinasica, permettendo così alla ciclina D1 di accumularsi306_{. AKT può}

anche influenzare negativamente l'espressione dei CKIs (inibitori dell'attività delle CDKs), come KIP1 (noto anche come p27) e WAF1 (noto anche come CIP1 o p21)307_.

AKT sembra avere anche un ruolo per quel che concerne la crescita cellulare, infatti un suo bersaglio è mTOR (il bersaglio della rapamicina dei mammiferi, noto anche come FRAP1), una serina/treonina chinasi che fa parte della famiglia delle chinasi correlate alle PI3K e mostra un dominio catalitico COOH-terminale con un'alta omologia di sequenza

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con PI3K308_{; questa omologia spiega il perché vi sia una cross-inibizione di mTOR da parte} di farmaci diretti verso PI3K309_{. La mTOR ha un ruolo centrale nella regolazione della}

crescita e della proliferazione cellulare, a livello traduzionale, e nella progressione del ciclo cellulare, aumenta, inoltre, la sintesi proteica attivando mTORC1 e mTORC2310_.

La mTOR è la subunità catalitica di due complessi multiproteici: mTORC1 (mTOR/raptor/mLST8/PRAS40/FKBP38) e mTORC2 (mTOR/rictor/mLST8/SIN1/proctor). MTORC1 è un effettore a valle di AKT e la sua attività è controllata da una rete di segnali che include RAS/RAF/MEK/ERK e una cascata di segnale LKB/AMPK, è sensibile alla rapamicina e ai suoi analoghi che sono inibitori allosterici di mTORC1; non si legano al dominio catalitico, ma si associano a FKBP-12 portando al disassemblaggio del complesso mTORC1, inducendo l'inibizione della sua attività. MTORC1 controlla la traduzione fosforilando la chinasi p70S6 (p70S6K) e 4E-BP1. A sua volta P70S6K fosforila la proteina ribosomiale p40S6, che partecipa alla traduzione di mRNA e fosforila anche eIF4B (eucariotic initiation factor 4B) che è coinvolto nella traduzione. MTORC1 regola diversi passaggi chiave della sintesi proteica e controlla l'espressione di proteine che promuovono la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, come c-Myc, ciclina D1, STAT3, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 etc. AKT regola il complesso mTORC1 fosforilando e inibendo il gene TSC-2 (tuberous sclerosis 2) che è una proteina GAP (GTP-ase activating protein) che si lega a TSC-1 (tuberin) formando un complesso e bloccando la proteina G Rheb. L'inibizione di TSC-2 permette alla proteina Rheb di accumularsi in uno stato legato a GTP e di attivare mTORC1. Il meccanismo che controlla mTORC2 non è ancora ben noto, ma l'attivazione di questo complesso è comunque collegata alla via di segnale PI3K. MTORC2 fosforila AKT sulla Ser473. AKT e mTOR sono regolati tra loro da circuiti a feedback sia positivi che negativi: quando AKT attiva mTORC1, quest'ultimo a sua volta regola AKT inibendola, attraverso un meccanismo di controllo negativo; infatti se mTORC1 viene inibito si ha un'iperattivazione di AKT e dei suoi substrati311,312,313,314_.

Tuttavia, è improbabile che la via PI3K-AKT sia l'unico stimolo che porta all'attivazione di mTOR nelle cellule tumorali. Infatti, mTOR può anche funzionare come sensore per ATP. Nei tumori che hanno un tasso aumentato di metabolismo glicolitico, mTOR potrebbe

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rilevare il successivo aumento del livello di ATP e avviare il segnale per un aumento della biogenesi ribosomiale che è comunemente osservata in questi tumori315_.

Immagine 5. La via di segnalazione di PI3K/AKT267

I livelli di PIP3 sono appena rilevabili nelle cellule di mammifero in condizioni di crescita non stimolata e sono strettamente controllati, grazie agli effetti della azione della PI3K e di diverse fosfatasi (PTEN, SHIP1 e SHIP2)267_.

La PIP3 fosfatasi che è più chiaramente coinvolta nell'oncogenesi è PTEN (Phosphatase and TENsinhomologuedeleted on chromosome 10, chiamato anche MMAC1), fosfatasi a doppia specificità che ha attività contro i substrati lipidici e proteici. Converte il PIP3 in PIP2, inibendo in questo modo l'attivazione dell'AKT ad opera della PI3K e regolando, perciò, negativamente l'attivazione del pathway oncogeno PI3K/PDK1/AKT.

Le fosfatasi SHIP agiscono anche sul PIP3, ma rimuovono il fosfato dalla posizione 5 anziché dalla posizione 3, creando PtdIns(3,4)P2, il quale può anche essere generato da PI3K di classe II. PtdIns (3,4) P2 può funzionare come un secondo messaggero (come PIP3) per reclutare proteine contenenti il dominio pleckstrin-homology (PH), come AKT.

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Sebbene sia il PTEN che lo SHIP1 riducano il livello di PIP3 nelle cellule, il PTEN sembra avere la responsabilità primaria per il controllo degli effetti mitogeni dei fosfoinositidi. Ad ogni modo, i topi knockout di SHIP1 possono sviluppare sindromi mieloproliferative, a riprova del fatto che PtdIns (3,4) P2 possa attivare determinate vie mitogeniche267,316,317,318_.

Diversi studi hanno inoltre dimostrato come il pathway PI3K/AKT possa essere regolato anche mediante defosforilazione della stessa AKT. Esempi delle fosfatasi coinvolte in questo tipo di meccanismo sono la PP2A (ProteinPhosphatase 2A)319 _{e la famiglia di}

fosfatasi PP2C (nota come PHLPP) in grado di rimuovere il fosfato dalla Ser473 di AKT320_.

Nonostante si parli comunemente del pathway PI3K/AKT, AKT non è l'unico effettore che contribuisce alle azioni di PI3K, infatti PI3K e PIP3 possono attivare pathways differenti con proprietà biologiche importanti per l'oncogenesi. Ad esempio, CDC42 e RAC1, che sono solitamente correlati al pathway di RAS ed hanno un ruolo nella regolazione del citoscheletro e della motilità cellulare, risultano anche essere regolati da PI3K, indipendentemente dall'AKT. Infatti, le cellule che hanno una delezione di PTEN mostrano una maggiore attività di CDC42 e RAC1 ed un'aumentata motilità e questo potrebbe rappresentare un collegamento tra la perdita di PTEN e l'invasione del tumore 321,322_.

Un altro target di PI3K è rappresentato dalla famiglia delle SGKs, serina/treonina chinasi che hanno un'elevata omologia con le AKTs e simili effetti funzionali sulle vie di segnalazione della sopravvivenza cellulare323_{. Tuttavia, il meccanismo di attivazione delle}

SGKs guidato da PI3K differisce dall'attivazione di AKT, poiché le SGKs non contengono un dominio PH, necessario invece per il reclutamento di AKT a livello della membrana plasmatica267_.