Il ruolo della via di segnalazione di PI3K nella cancerogenesi

L'associazione di PI3K con il cancro non è stata chiara fino alla fine degli anni '90, quando è stato dimostrato che l'oncosoppressore PTEN agisce come fosfatasi di PIP3. Analisi genomiche complete sul cancro hanno rivelato che molteplici componenti della via di

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umani324,325,326,266_{sottolineando l'importanza di questo pathway}266_{. Infatti, l'amplificazione}

di PIK3CA, la perdita di PTEN, le mutazioni di AKT e l'amplificazione di RTK promuovono la tumorigenesi attraverso l'up-regolazione della via di segnalazione PI3K / AKT327_.

Una bassa attività di PTEN è solitamente dovuta a proteine troncate o al silenziamento epigenetico spesso dovuto a ipermetilazione del promotore328_{. L'identificazione di}

mutanti di PTEN che presentano difetti nella loro funzione di fosfatasi lipidica o in entrambe le funzioni sia di fosfatasi lipidica che proteica, ha permesso di definire l'importanza di queste mutazioni nell'ambito dell'attività oncosoppressiva di PTEN e degli aspetti della crescita tumorale. Ad esempio, la mutazione C124S inattiva sia la funzione di fosfatasi lipidica che di quella proteica, mentre la mutazione G129E nel dominio catalitico, che interrompe l'attività di fosfatasi lipidica, ma non influisce su quella proteica, si riscontra in pazienti con sindrome di Cowden (malattia caratterizzata da amartomi multipli a livello di cute, mammella, tiroide, tubo digerente, endometrio e da un elevato rischio di sviluppo di tumori maligni), indicando che la perdita della funzione di fosfatasi lipidica sia sufficiente a causare il fenotipo clinico del cancro329,267_.

L'attività della chinasi di PI3K è stata inizialmente associata alle oncoproteine virali330_{, poi}

in studi successivi sono stati impiegati topi knockout sia per la subunità regolatoria, sia per quella catalitica di PIK3, che hanno riportato una serie di deficit tra cui letalità embrionale, difetti delle cellule B, necrosi epatica e cancro del colon-retto331_{. Altre}

ricerche hanno dimostrato che l'amplificazione del locus di PI3K e le delezioni di sequenze nucleotidiche brevi, determinano un'elevata attività della chinasi lipidica della subunità catalitica p110α di PI3K (PIK3CA) in vari tipi di cancro, per cui è stato possibile dedurre il ruolo oncogenico di PIK3CA332,333,334_.

PIK3CA è un gene localizzato sul cromosoma 3q26.3 e che codifica per la subunità

catalitica p110α. Amplificazioni geniche, delezioni e mutazioni somatiche missenso nel gene PIK3CA sono state riportate in molti tipi di tumore umano, inclusi tumori del colon, della mammella, del cervello, del fegato, dello stomaco e dei polmoni. Queste mutazioni somatiche di missenso, raggruppate in due regioni di "hotspot" negli esoni 9 (G1624A:E542K) e 20 (A3140G:H1047R), corrispondenti rispettivamente ai domini

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elicoidale e chinasi di p110α, sembrano aumentare l'attività della chinasi di PIK3CA contribuendo alla trasformazione cellulare. Nell'articolo di Samuels et al.335 _{è stata} inizialmente analizzata la sequenza di otto geni di PI3K e altri otto geni simili in un numero relativamente piccolo di tumori colorettali primari ed è stato scoperto che PIK3CA era l'unico gene ad ospitare mutazioni somatiche. Successivamente sono state ampliate le dimensioni del campione, che includeva tessuti di tumori primari di colon, encefalo, seno, stomaco e polmone. I risultati hanno confermato le osservazioni iniziali e hanno dimostrato che le mutazioni somatiche sono state trovate in tutti questi tessuti a frequenze variabili. In particolare, i tumori del colon-retto, dell'encefalo e dello stomaco risultavano avere un alto tasso di mutazione del gene PIK3CA con frequenze rispettivamente del 32, 27 e 25%. I tumori della mammella e del polmone avevano, invece, un tasso relativamente basso di mutazioni PIK3CA (rispettivamente 8 e 4%)266,336_.

È stato inoltre dimostrato che le mutazioni di PIK3CA si escludono a vicenda con le mutazioni dell'oncosoppressore PTEN, suggerendo che la segnalazione tumorigenica attraverso questa via possa avvenire attraverso l'attivazione di PIK3CA o l'inattivazione di PTEN337_.

In uno studio, Samuels et al. hanno dimostrato la presenza della mutazione del dominio chinasico di PIK3CA nella linea cellulare HCT116 del cancro del colon e la mutazione del dominio elicoidale nella linea cellulare DLD1 del cancro del colon, e questo comportava un aumento dell'attività di PIK3CA e quindi della segnalazione cellulare, della crescita cellulare e dell'invasione338_{. In un altro studio di Ikenoue et al. sono state esaminate le}

mutazioni di PIK3CA più frequenti (E542K, E545K e H1047R) ed è stato individuato un aumento dell'attività chinasica di PIK3CA e della trasformazione cellulare nel momento in cui le sequenze mutanti di PIK3CA sopra menzionate sono state introdotte nelle cellule NIH 3T3 di topo339_{. Analoghi risultati sono stati ottenuti in altri studi in cui, appunto, le}

mutazioni E545K e H1047R sono state associate ad un aumento dei livelli di PIP3, all'attivazione della via di segnalazione di AKT e alla trasformazione cellulare340,341,342_.

L'attività indotta dalle mutazioni E542K e E545K è dipendente dal legame RAS-GTP, mentre il guadagno di funzione enzimatica indotta da H1047R sembra essere dipendente

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dal cambiamento allosterico mediato da p85 e questo cambiamento mima il legame RAS- GTP, rendendo l'attività catalitica di questo mutante indipendente dall'interazione con RAS-GTP. Alcuni studi supportano la teoria secondo la quale il dominio elicoidale mutato (E542K e E545K), impedisca l'interazione inibitoria tra il dominio SH2 N-terminale di p85 e il dominio ad elica di p110α. Per esaminare gli effetti del legame di p85 nell'attività del mutante, sono stati eliminati i legami di p110α a p85 mediante delezione di 72 aminoacidi N-terminali da p110α. L'eliminazione del sito di legame a p85 ha un debole effetto sulla trasformazione dell'attività del dominio elicoidale mutato, ma è completamente abolita la trasformazione indotta dalla mutazione del dominio chinasico H1047R. Tali risultati indicano che un processo non ancora identificato dipendente da p85 possa giocare un ruolo critico nell'oncogeneticità di H1047R11343_.

In una analisi genomica dei glioblastomi (GBM) sono state individuate anche le mutazioni del gene PIK3R1, il quale codifica per la subunità regolatoria p85α. In particolare, la maggior parte di queste mutazioni si trova all'interno del dominio iSH2 di p85α. Nella stessa coorte, le mutazioni di PIK3CA sono state riscontrate nel 7% dei GBM ed è interessante notare come queste si escludessero a vicenda con le mutazioni PIK3R1344,266_.

Uno studio Ollikainen et al. hanno evidenziato come, in 160 tumori del colon e dell'endometrio, le mutazioni e le amplificazioni di PIK3CA insorgano con una frequenza rispettivamente del 9,4 e del 10,4%, ma mai contemporaneamente nello stesso tumore345_.

Zhao e Vogt hanno inoltre dimostrato che le doppie mutazioni del dominio elicoidale sullo stesso allele (E545K/E542K) conferiscono un piccolo effetto additivo, evidenziato attraverso i livelli di fosfo-AKT, mentre la doppia mutazione del dominio elicoidale e del dominio chinasico sullo stesso allele (E545K/H1047R) conferiscono un forte effetto sinergico. Ciò suggerisce che le mutazioni del dominio elicoidale e chinasico possano avere diversi meccanismi di induzione dell'attività di PI3K346_{. Ad ogni modo, la frequenza}

relativamente bassa di mutazioni multiple di PIK3CA osservate nei tumori suggerisce che una sola mutazione sia sufficiente per la tumorigenesi e che le doppie mutazioni possano effettivamente avere effetti negativi302_.

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Le mutazioni RAS e PIK3CA possono coesistere nei tumori del colon-retto, mentre si escludono a vicenda nei tumori dell'endometrio e questo può essere il risultato dell'espressione specifica di regolatori negativi del tessuto. Le mutazioni di RAS possono aumentare la segnalazione di PI3K aumentando la velocità di traslocazione di PI3K sulla membrana plasmatica o l'attivazione diretta dell'enzima stesso.347 _{Inoltre, i tumori guidati}

da RAS sembrano essere altamente dipendenti dalla segnalazione di PI3K durante la fase di iniziazione del tumore302_.

Come già spiegato nei capitoli precedenti, i due pathways che conducono allo sviluppo di CRC più studiati sono la via di segnalazione WNT, che è caratterizzata da alterazioni nell'APC e determina mutazioni in KRAS e p53 e instabilità cromosomica, e la via caratterizzata da mutazioni nel gene BRAF. Il ruolo di PI3K in questi due processi non è chiaramente definito283_{. Tuttavia, l'analisi dei tessuti dei polipi colorettali e del CRC ha}

dimostrato la presenza di mutazioni nel gene PIK3CA nel 6% dei casi e questo suggerisce che queste mutazioni siano eventi primari nella tumorigenesi della CRC348_{. In un altro}

studio, le mutazioni del gene PIK3CA sono state descritte come eventi tardivi nella sequenza adenoma-carcinoma310_.

La mucosa normale del colon e i polipi iperplastici non sovraesprimono l'AKT, che, come precedentemente detto, ha un ruolo fondamentale nella via di segnalazione di PI3K, al contrario degli adenomi e dei CRC che dimostrano frequentemente una forte espressione di questa molecola349_.

La perdita PTEN può verificarsi all'inizio della carcinogenesi come dimostrato da Waniczek et al., infatti un'espressione assente o ridotta di PTEN è stata rilevata nel 46% dei polipi adenomatosi. Nello stesso studio i polipi con più di 25 mm di diametro avevano maggiori probabilità di perdere l'espressione di PTEN rispetto ai polipi che misurano meno di 12,5 mm, a riprova del fatto che i polipi di grandi dimensioni abbiano maggiori probabilità di subire una trasformazione maligna350_.

In uno studio con modelli animali portatori di mutazioni APC, è stato scoperto che la via di segnalazione di mTORC1 era più spesso attivata nei polipi intestinali rispetto alla normale

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mucosa intestinale e che, se trattati con inibitori di mTORC1, la formazione di polipi era significativamente ridotta351_.