Fig. 14: Cellule di lievito viste al microscopio elettronico a scansione, si può
osservare gli eventi di gemmazione e le cicatrici lasciate da questi fenomeni.
Il Lievito Saccharomyces cerevisiae è utilizzato in numerosi studi di citologia e in genetica come organismo modello. Appartiene al Regno dei funghi, Phylum Ascomiceti che contiene funghi chiamati ascomiceti, comunemente noti come funghi a sacco. Un lievito si definisce come un fungo unicellulare contenente un singolo nucleo e avente tallo globoso, ovoidale o sferico, talvolta allungato o irregolre. Ad oggi sono state catalogate più di mille specie di lieviti. La maggior parte appartengono proprio al gruppo degli Ascomiceti. S.cerevisiae è noto fin dall’antichità per la panificazione e la produzione di birra e vino. È un organismo anaerobio facoltativo: in presenza di ossigeno ha un metabolismo di tipo respiratorio, in condizioni anossiche fermenta il glucosio a etanolo e anidride carbonica.
S.cerevisiae, di forma ellissoidale, esiste in tre forme cellulari differenti, due aploidi (a
e α) e una diploide. La cellula diploide oltre ad avere una forma più ellissoidale presenta un volume quasi doppio rispetto alla cellula aploide. La riproduzione può essere asessuata (gemmazione) o sessuata. La gemmazione avviene in entrambe le
ploidie, il tempo di gemmazione del lievito è di circa 90 minuti. Da una stessa cellula madre si possono avere dalle 30 alle 40 divisioni, ciascuna divisione lascia sulla cellula madre una cicatrice ed il numero di cicatrici indica l’età della cellula. La conversione tra lo stato aploide e quello diploide avviene attraverso un processo di accoppiamento detto coniugazione, le cellule aploidi possono essere di due tipi coniugativi (mating type): a ed α. Cellule aploidi di tipo a si possono fondere solo con cellule aploidi di tipo α per generare cellule diploidi di tipo a/α.
Il genoma di S.cerevisiae è stato il primo ad essere sequenziato, nel 1996. Le dimensioni sono di circa 12 Mbp, più un cluster di 9137 bp fatto da circa cento segmenti ripetuti codificanti rRNA. È costituito da 16 cromosomi (n) e circa 6000 geni. Il genoma mitocondriale è circolare e contiene intorno alle 7 Kbp, anche se sono presenti dei ceppi che non lo possiedono, essendo il lievito un aerobio facoltativo. La cellula eucariotica ha il citoplasma organizzato in granuli (apparato di Golgi, citoscheletro, reticolo endoplasmatico, mitocondri, nucleo) ed il lievito ha una parete esterna alla membrana, spessa 100-200 nm che rappresenta il 15-20% della massa secca, costituita dall’80-90% in polisaccaridi e per il 2-4% in chitina, la parte superficiale è ricoperta invece da mannoproteine.
S.cerevisiae offre diversi vantaggi per lo studio della biologia molecolare e cellulare:
o È un organismo eucariote, dotato di un nucleo ed organuli, e può quindi essere usato come modello per lo studio di cellule eucariotiche;
o Ha una rapida velocità di crescita, ed è facilmente e velocemente coltivabile; o Ha un genoma semplice e completamente sequenziato;
o Non è patogeno (è considerato un organismo GRAS, “generally regarded as safe”);
o Ad ogni stadio del ciclo cellulare corrisponde un particolare stato morfologico; o Si divide per gemmazione;
o Possono essere generati facilmente mutanti;
o Può vivere nelle due forme: aploide (n) e diploide (2n);
o Può essere facilmente trasformato, ed inoltre la ricombinazione omologa avviene con alta efficacia, consentendo una manipolazione mirata del genoma.
Grazie a tutte queste caratteristiche il lievito rappresenta un organismo modello utilizzato per numerosi studi di svariato genere, infatti S.cerevisiae è utilizzato per la produzione di proteine umane: viene trasfettato con costrutti plasmidici contenenti cDNA per ottenere proteine sotto il controllo di promotori specifici per il lievito. Il vantaggio di usare il lievito anziché i batteri è da ricercare nell’origine eucariotica di questo organismo modello; questa caratteristica consente infatti alle proteine di subire un appropriato folding e tutta quella serie di modifiche post-traduzionali (fosforilazioni, glicosilazioni etc..) necessarie alla funzionalità delle proteine. Vista l’importanza e la variabilità nell’utilizzo di S.cerevisiae come organismo modello, sono nati dei database aggiornati, dai quali è possibile ricavare informazioni sui geni e sulle proteine di lievito; si ha inoltre anche la possibilità di ordinare ceppi con mutazioni desiderata.
1.3.1 Il lievito S.cerevisiae in campo virologico
S.cerevisiae è capace di sostenere la replicazione di molti virus sia a RNA che a
DNA (Raghavan et al., 2004; Galao et al., 2007) che hanno i loro ospiti naturali sia nelle piante che negli animali, compreso l’uomo. I virus a RNA che riescono a replicarsi nel lievito includono tre virus di piante come Brome mosaic virus (BMW), Carnation Italian ringspot virus (CIRV) e Tomato bushy stunt virus (TBSV), e due virus degli animali come Flock House virus (FHV) e Nodamura virus (NoV). Mentre tra i virus a DNA con genoma circolare sono inclusi: Papilloma virus umano (HPV), Papilloma virus bovino (BPV) e virus Mung bean yellow mosaic Indian (MYMIV) (Alver-Rodriguez et al., 2006; Raghavan et al., 2004), un virus con DNA a singolo filamento circolare. Agli inizi degli anni ’80 S.cerevisiae è stato usato per la produzione del vaccino contro il virus dell’epatite B (antigene di superficie del virus dell’Epatite B), contro il papilloma virus (proteina strutturale L1) (Angeletti et al., 2002) e per studiare le funzioni di proteine virali di virus patogeni umani tra i quali HIV, il virus dell’epatite C e il virus di Epstein-Barr (Alves-Rodriguez et al., 2006; Hughes, 2002).
Data la sua larga applicazione nella produzione di vaccini, risulta essere un ottimo modello per la ricerca biomolecolare e virologica; in particolare riveste un ruolo molto
sono particelle virali simili ai Virus wild type ma non infettive perchè non contengono il genoma virale. Molte VLPs dispongono soltanto dell’esatta conformazione delle proteine strutturali che formano il capside virale, questo permette di ottenere vaccini virali perché è possibile l’auto-assemblaggio delle particelle VLPs senza andare incontro ai rischi associati alla replicazione virale. Proprio per queste caratteristiche VLPs di diversi virus sono già stati prodotti in lievito (Hale et al., 2002; Lowin et al., 2005; Rodriguez-limas, 2011).
È stato recentemente dimostrato nel nostro laboratorio, che il lievito S. cerevisiae è in grado di sostenere la formazione del ssDNA di AAV direttamente da un plasmide a doppio filamento contenente le sequenze in cis necessarie per la replicazione (ITR), qualora venga espressa la proteina regolatoria di AAV Rep68/78 (Cervelli et al., 2011) e la formazione di VLPs di AAV da un plasmine contenente le proteine Vp1, 2 e 3 sotto il controllo di un promotore inducibilie di lievito (Backovivc et al 2012).