MATERIALI E METODI 1 Campionatore per espirato

Il campionatore utilizzato per la raccolta dei campioni di espirato è costituito da:  un boccaglio per spirometria (Spirometry Filter 74 “Plus”);

 una valvola di non ritorno a tre vie (2-way nonrebreathing valve Hans Rudolpf

2700);

 un filtro per COV (Sperian A2 raccordo unificato EN148-1);

 dei raccordi in teflon, torniti presso l’officina tecnica del Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche dell’Università di Trieste, uno dei quali funge da alloggiamento per un agente essiccante;

 una sacca in Nalophan da 8 litri (messa a disposizione da ARCO SolutionS s.r.l) (vedi figura 2.7).

Il metodo utilizzato per campionare l’espirato, in questo caso di studio, è una variante del

mixed expiratory sampling, descritto nella sezione 2.2.1, definita filtered mixed expiratory sampling. Infatti, prima di procedere con la raccolta del campione, l’aria inalata dal paziente

è stata filtrata per 5 minuti attraverso il filtro per COV di cui è dotato il campionatore, in modo da abbattere il contributo del background della stanza. Trascorso il tempo stabilito, il campione è stato raccolto all’interno di una sacca in Nalophan. Si è scelto di utilizzare questo materiale polimerico in quanto non rilascia COV ed è economico al punto da poter utilizzare una sacca nuova per ogni campionamento senza necessità di pulirla per riutilizzarla; inoltre, è possibile ottenere “in house” sacche di qualsivoglia volume. Le sacche di Nalophan registrano perdite di COV dal 30% al 80% nel giro di 24h (Mochalskii et al. 2009) ma la procedura impiegata prevede l’immediata pre-concentrazione dei COV su cartuccia adsorbente Tenax^® e l’analisi entro 24h dal campionamento.

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Figura 2.7: campionatore per espirato utilizzato durante il presente progetto di ricerca con dettaglio sulle

varie parti.

5.2 Cartucce adsorbenti: Tenax® TA

La pre-concentrazione dei COV prima dell’analisi è eseguita mediante l’utilizzo di cartucce adsorbenti di Tenax^® TA. Esse sono costituite da un tubo di acciaio inox del diametro di 8 mm e lunghezza pari a 7 cm, riempito con 250 mg di resina polimerica porosa a base di ossido di 2,6-difenil-p-fenilene. La resina ha un’area superficiale specifica di 35 m²/g ed una dimensione media dei pori di 200 nm. Le cartucce di Tenax^® sono ideali per il campionamento dei COV nell’espirato in quanto presentano elevata idrofobicità, che si riflette in un basso volume di breakthrough per l’acqua. Il volume di breakthrough è il volume di gas (in questo caso specifico di espirato) che deve attraversare la cartuccia adsorbente per eluire completamente un dato composto. Tale valore varia a seconda del materiale adsorbente, della sostanza da eluire e della temperatura alla quale si opera. Facendo riferimento alle cartucce di Tenax^®, il volume di espirato sufficiente ad eluire l’acqua alla temperatura di 20°C è 0,016 litri. Per favorire l’adsorbimento dei COV da parte del materiale adsorbente è stata utilizza una pompa GilAirPLUS® della Gilian; essa è portatile, dotata di una batteria ricaricabile e consente di impostare il flusso di aspirazione da 20 a 5000 ml/min. Queste caratteristiche la rendono idonea per eseguire campionamenti rapidi ed efficaci spostandosi tra diversi luoghi. In questo caso specifico la pompa è stata collegata ad una delle due estremità del Tenax^® mentre dall’altra è stata collegata la sacca contenente l’espirato (vedi figura 2.8).

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Figura 2.8: Schema delle fasi di pre-concentrazione e analisi dei COV nei campioni di espirato.

5.3 Tecnica analitica TD-GC-MS

Le cartucce di Tenax^® contenti i COV dell’espirato, sono state analizzate mediante tecnica TD (Thermal Desorption)-GC-MS. Tale tecnica prevede l’utilizzo di un termodesorbitore per introdurre il campione nel gascromatografo (vedi figura 2.8). Nel caso specifico, è stata utilizzata un’unità di termodesorbimento UNITY serie 2 della

Markes, con una linea di N2 dedicata al desorbimento degli analiti dalla cartuccia. Una volta desorbiti con un flusso di N2 alla temperatura di 200°C per 3 minuti, gli analiti sono rifocalizzati su una trappola di arricchimento (riempita con materiali adsorbenti solidi disposti in ordine di forza crescente) mantenuta ad una temperatura di -10°C grazie ad un sistema di Peltier. Una volta terminata la fase di desorbimento, la trappola viene riscaldata fino ad una temperatura di 300°C e gli analiti vengono trasferiti alla colonna capillare utilizzando un flusso di He a 1,3 ml/min, come gas carrier. Considerando l’intervallo di concentrazione dei COV nell’espirato (ppm-ppt) si è deciso di operare con valori bassi di splittaggio per aumentare la sensibilità dell’analisi (vedi tabella 2.3 per maggiori specifiche sul settaggio della UNITY). Prima e dopo ogni utilizzo le cartucce di Tenax^® sono state condizionate tramite flusso continuo di N2 a 280°C per 5 minuti e conservate in apposite provette, tappate alle estremità, fino al momento dell’utilizzo.

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Tabella 2.3: parametri di settaggio dell’unità di termodesorbimento

- Mode type: standard desorption - Pre-Desorption:

Pre purge time: 1.0 min Trap NOT in line Split on: 20.0 ml/min - Tube/Sample desorption:

3.0 min at 200°C Trap in line

Split on: 20.0 ml/min

- Trap Settings:

Pre-tripe fire purge: 1.0 min Split on: 20.0 ml/min Trap Low: -10°C

Trap High: 300°C – hold: 3.0 min Split on: 20.0 ml/min

- Flow path temperature: 140°C - Split ratio:

Inlet 1.5:1 Outlet 4.8:1 Total 7.3:1

Il gascromatografo impiegato per le analisi è un GC 6890 della Agilent interfacciato con uno spettrometro di massa 5973 della stessa marca. La colonna capillare utilizzata per le analisi è una Agilent 122-1564 DB-VRX (lunghezza 60 m, diametro nominale 250 μm, film

thickness 1,4 μm). L’eluizione degli analiti dalla colonna è stata eseguita in rampa di

temperatura, utilizzando un metodo già impiegato dal gruppo di ricerca per analisi di COV nell’aria ambiente, con le seguenti specifiche: da 35°C a 190°C a 12°C/min (hold time 2 min) e da 190°C a 225°C a 6°C/min (hold time 1 min), per una corsa cromatografica totale di 31 min. Tale rampa di temperatura si è rivelata adatta per la separazione dei COV dei campioni raccolti, con rari eventi di coeluizione di picchi.

Lo spettrometro di massa utilizzato come detector ha una sorgente ad impatto elettronico (EI). Le molecole man mano che vengono eluite dalla colonna sono bombardate con un fascio di elettroni ad elevata energia (70 eV), prodotto da un filamento di Tungsteno caldo (230°C), che le frammenta in ioni con diverso rapporto m/z. I COV vengono separati all’interno di un analizzatore quadrupolare in base al loro rapporto m/z ed impattano contro un elettromoltiplicatore che amplifica il loro segnale. Ciò che si ottiene è uno spettro dell’abbondanza relativa degli ioni in funzione del rapporto m/z, caratteristico per ogni specie. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità Total Ion Current (TIC), monitorando in continuo i rapporti m/z da 35 u.m.a. (unità di massa atomica) a 260 u.m.a. Per l’attribuzione dello spettro di massa ad una determinata specie chimica, è stata utilizzata la libreria NIST08 in dotazione con il software dello strumento. Il software esegue un confronto tra lo spettro di massa dell’analita e gli spettri di massa contenuti nella libreria,

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fornendo come output la percentuale di probabilità sull’entità del composto suggerito. Nel caso specifico sono stati accettati i risultati con una percentuale di probabilità minima del 50%, e sono stati analizzati picchi cromatografici che presentavano un’abbondanza del segnale ≥ 10000.

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6. RISULTATI E DISCUSSIONE

6.1 Messa a punto della procedura analitica

Vengono riportati di seguito i risultati delle prove metodologiche eseguite per stabilire i parametri di campionamento da utilizzare nelle fasi sperimentali successive del progetto di ricerca. Le varie prove metodologiche sono state eseguite in triplicato sullo stesso soggetto tra le ore 9.00 e le 13.00, in quest’arco di tempo il soggetto non ha assunto cibi o bevande che potessero influenzare i risultati delle analisi.

 Utilizzo di un agente disidratante

Durante il primo passaggio di messa a punto del campionamento dei COV è stata valutata la necessità di utilizzare un agente disidratante per trattenere l’umidità della matrice. Si è scelto di utilizzare gel di silice in granuli (granulometria da 2,5 a 5 mm) inserito in un sacchetto di garza sterile e posto all’interno di uno dei raccordi in teflon del campionatore (vedi figura 2.9), previo passaggio in muffola a 220°C per eliminare l’umidità ed eventuali contaminanti.

Figura 2.9: immagine del raccordo contente il gel di silice in granuli.

Sono state eseguite due prove, una con l’utilizzo dell’agente disidratante ed una senza, confrontando i cromatogrammi risultanti (vedi figura 2.10).

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Figura 2.10: sovrapposizione dei cromatogrammi relativi ad un campione di espirato raccolto senza l’utilizzo

dell’agente disidratante (profilo blu) ed un campione raccolto con l’utilizzo dell’agente disidratante (profilo nero) sullo stesso soggetto nello stesso giorno; ingrandimento da 13,5 min a 21,00 min.

Nella figura 2.10 si può notare come il profilo dei COV relativo ai due diversi campionamenti sia simile, ma che l’utilizzo dell’agente disidratante fa sì che l’abbondanza di composti polari (come acido acetico, 2,3-butandione, 1-butanolo, ecc.) sia maggiore. Ciò è dovuto, molto probabilmente, alla capacità della silice di trattenere il vapore acqueo che altrimenti tratterebbe i composti più polari non permettendone il rilevamento. Oltre al gel di silice si è deciso di testare anche un secondo agente disidratante, cloruro di calcio in scaglie, per valutare quale dei due fosse il più efficiente. Nella figura 2.11 è riportata la sovrapposizione dei cromatogrammi ottenuti dai due esperimenti. Come si può osservare il calcio cloruro non mostra la stessa efficienza nel trattenere l’umidità del gel di silice, ed inoltre si ha un peggioramento nella rilevazione della maggior parte dei COV.

Figura 2.11: sovrapposizione dei cromatogrammi relativi ad un campione di espirato raccolto con l’utilizzo di

cloruro di calcio (profilo blu) ed un campione raccolto con l’utilizzo di gel di silice in granuli (profilo nero) sullo stesso soggetto nello stesso giorno; ingrandimento da 13,5 min a 21,00 min.

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 Volume adsorbito

Il volume di espirato adsorbito su cartuccia influenza significativamente la sensibilità dell’analisi successiva soprattutto se gli analiti sotto indagine hanno una concentrazione nell’intervallo tra i ppm e i ppt, come nel caso dell’espirato. Al contempo, il passaggio di un volume eccessivo attraverso il materiale adsorbente può anche eluire alcuni COV già adsorbiti, se viene superato il volume di breakthrough specifico per ogni analita. Nel presente caso è stato valutato l’adsorbimento su cartucce Tenax^® di 3 e 4 litri di espirato provenienti dalla stessa sacca (vedi figura 2.12).

Figura 2.12: sovrapposizione dei cromatogrammi relativi ad un adsorbimento di 3 litri di espirato su Tenax® (profilo rosso) ed un adsorbimento di 4 litri (profilo nero); ingrandimento da 13,0 min a 19,00 min.

Come si evince dalla figura sopra riportata, il passaggio attraverso il materiale adsorbente di 4 litri campione piuttosto che 3, aumenta la quantità di analita adsorbito su cartuccia, non si osserva però una dipendenza lineare tra la quantità di analita adsorbito sulla cartuccia e il volume di gas campionato. Ulteriore conferma di ciò si può avere dai dati riportati in tabella 2.4, relativi alle aree medie dei picchi cromatografici indicati in figura, ottenute nei diversi esperimenti.

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Tabella 2.4: medie e deviazioni standard percentuali relative ai composti indicati in figura 2.12, divise

per tipologie di esperimenti