Materiali e Metod

In questo studio abbiamo arruolato 170 coppie che si sono presentate tra Marzo 2015 e Marzo 2017 presso l'ambulatorio della “gravidanza fisiologica e a rischio” e percorso fertilità dell'Unità Ospedaliera di Ginecologia e Ostetricia 2 di Pisa suddivise sulla base clinica dello stato della gravidanza, fisiologica e fisiopatologica. Nello specifico, dopo un’attenta anamnesi familiare, personale fisiologica e patologica abbiamo selezionato:

 79 coppie che avevano portato a termine la gravidanza con successo

 35 coppie con poliabortività

 39 coppie con infertilità

35 Tabella 1-Storia gravidica e caratteristiche delle coppie

Poliabortività Infertilità Gestosi precoce Controlli

Pazienti 35/91 39/91 17/91 79

Età media 38,7 36,1 31,5 38,5

Etnia caucasica Tutte Tutte Tutte Tutte

Aborti 126/152 13/17 0 0

Nati vivi 26/152 4/17 9 172

Morti prenatali 0 0 2 0

Al termine della visita e dopo aver ottenuto il loro consenso informato, è stato effettuato un prelievo di saliva utilizzando un apposito di estrazione del DNA KIT (Orangene DNA-DNA Genotek Inc, Ottawa, ON, Canada).

Il DNA genomico è stato estratto a partire dalle cellule epiteliali di sfaldamento della mucosa buccale presenti nella saliva. Per questa metodica sono sufficienti 200-500 µl di saliva che vengono introdotti mediante un collettore in un tubo di raccolta.

Fig.8 –DNA KIT per il prelievo di saliva.

Al momento della chiusura dell'imbuto di raccolta, da parte dell'operatore, mediate rottura di una membrana viene introdotto nel tubo un buffer di conservazione. A questo punto il campione raccolto può essere conservato per 2 settimane a 4°C o essere processato immediatamente. Per l'estrazione del DNA si procede utilizzando il metodo manuale del salting-out (metodo di Miller modificato). In breve, 300 µl di soluzione contenente le cellule di

36 sfaldamento viene trasferita in una eppendorf da 2 ml e sottoposta a centrifugazione per 1 min a 10.000 xg. A questo punto, al pellet vengono aggiunti 300 µl di soluzione WCLB (White Cell Lysis Buffer) lisante le cellule, contenente 0,01M di Tris (pH 8.0), 0.4 M NaCl, 0.002M EDTA (pH8.0), 20µl di SDS al 10%. La soluzione è incubata a 60°C per due ore: in questa fase le cellule vengono lisate rilasciando in soluzione il DNA. La precipitazione del DNA è effettuata mediante l'aggiunta alla soluzione di 200 µl di Sodio Acetato saturo; il campione viene agitato vigorosamente per circa 1 minuto e centrifugato a 12.000 g per 4 minuti. Alla fase acquosa, contenente il DNA, sono aggiunti 2 volumi di etanolo al 99.9% per la precipitazione definitiva. Il pellet di DNA, a questo punto visibile, è trasferito in una nuova eppendorf contenente 2 volumi di etanolo al 70% e centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. Eliminare la soluzione di etanolo per inversione e lasciare asciugare il pellet per alcuni minuti. Il pellet di DNA è ricostituito con 100 µl di acqua.

La verifica della qualità e quantità dell’DNA estratto riveste un ruolo cruciale al fine di evidenziare un’eventuale degradazione o una contaminazione che può compromettere le successive fasi di analisi. Per l’analisi quantitativa ci siamo affidati al metodo della lettura spettrofotometrica, che sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d’onda di 260 nm. La tecnica consiste nel preparare una cuvetta di quarzo in cui abbiamo posto 98 µl della stessa soluzione con la quale è stato eluito il DNA più 2 µl del DNA.

Tramite la legge di Lambert-Beer, relazione empirica che correla la quantità di luce assorbita da un mezzo alla concentrazione dello stesso e allo spessore del mezzo attraversato, abbiamo effettuato un'analisi quantitativa dell’DNA estratto.

L’assorbanza A (detta anche densità ottica, DO) per una soluzione viene dunque espressa come:

A= Ɛλl M

Dove Ɛλ è il coefficiente di estinzione molare e si ritiene un parametro costante per una data sostanza ad una lunghezza d’onda; nel caso dell’DNA il coefficiente di estinzione molare assume valore 50 ng/µl; M è la molarità della soluzione; l è il cammino ottico di norma 1 cm.

37

Fig.9 –Un fascio di luce di intensità I0 attraversa uno spessorel di una soluzione a concentrazione c e ne emerge con intensità I1

A questo punto per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione bisogna tenere presente anche la diluizione effettuata. Nel nostro caso i valori ottenuti dalla misurazione spettrofotometrica dei campioni di DNA totale estratti da sangue intero presentavano un range compreso tra concentrazioni di 50 ng/µl e 100 ng/µl.

Per la determinazione della purezza abbiamo utilizzato il rapporto ottenuto tramite l’analisi spettrofotometrica:

- rapporto A260/A280: indica la presenza di eventuale contaminazione di proteine nel templato. Per il DNA un buon valore è rappresentato da un range che va da 1,6 a 1.9 circa, rapporti superiori indicano contaminazioni da proteine.

Un altro fattore molto importante nella valutazione degli acidi nucleici e ribonucleici è l’analisi qualitativa, che è stata effettuata mediante la corsa elettroforetica su gel di agarosio al 1.5-2% con l’ausilio del bromuro di etidio come agente intercalante, e successiva lettura delle bande ricercate mediante analisi ai raggi UV. Questo processo sfrutta le caratteristiche polianioniche degli acidi nucleici che, sottoposti ad un campo elettrico, migrano dal polo negativo al polo positivo attraverso il gel, che presenta una rete di pori in grado di separare le molecole in base alle loro dimensioni; infatti, più esse sono piccole, maggiore è la loro velocità di migrazione. Nei pozzetti del gel sono stati caricati 10 µl di una soluzione contenente 2 µl di DNA totale estratto,2 µl di Loading buffer (es. Blu di Bromofenolo/ Xilene Cianolo) e 6 µl H2O.

Alla fine della corsa elettroforetica, deve essere evidenziabile una banda di elevato peso molecolare a indice di presenza e di integrità del nostro DNA.

38 Tipizzazione molecolare del polimorfismo di 14bp della molecola HLA-G

L’analisi dei polimorfismi delle molecole HLA-G è comunemente effettuata mediante tecniche di biologia molecolare come la PCR (Polymerase Chain Reaction). La reazione consiste in una serie di cicli sequenziali costituiti da 3 fasi: denaturazione, annealing dei primer e sintesi o estensione del DNA. L’enzima usato in vitro è la Taq polimerasi ottenuta dal batterio termofilo Thermophilus aquaticus. Lo scopo della PCR è quello di amplificare e quindi di ottenere un numero elevato di copie ( fino a 10^13) di un determinato target. Successivamente questi ampliconi possono essere utilizzati da un punto di vista qualitativo per valutare la presenza /assenza di un determinato bersaglio o in maniera più approfondita, ad esempio mediante sequenziamento diretto, per l'analisi delle informazioni contenute nella sequenza di DNA.

39 Sequenziamento SBT

È una delle metodologie più moderne che ha permesso di aprire nuovi orizzonti negli studi di biologia molecolare applicata alle discipline mediche. Questa può essere eseguita mediante l'utilizzo di apparecchiature denominate "sequenziatori" che, impiegando gel di acrilamide o capillari, sono in grado di leggere la sequenza nucleotidica del template (stampo) ottenuto con la PCR. "Sequenziare" un frammento di DNA significa stabilire la successione dei nucleotidi che ne formano la molecola. Uno dei primi sistemi di sequenziamento fu sviluppato da Sanger nel 1975, il quale si basava sulla metodica di terminazione della catena di DNA mediato dai dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP) ed è attualmente il metodo più usato per definire mutazioni specifiche. Queste sono molecole molto simili a deossiribonucleotidi (dNTPs) ma mancano dell’ossidrile nel carbonio in posizione 3', per cui possono essere incorporati in una catena di DNA in fase di sintesi ma ad essi non possono essere aggiunti altri dNTPs.

In pratica, la sintesi del DNA viene effettuata per esterificazione dell’ossidrile 3’ di un nucleotide, già incorporato mediante l’estremità 5’ fosfato, sul carbonio in alfa di un dNTP la quale si arresta al momento dell’incorporazione del ddNTP. Statisticamente si otterranno così tanti frammenti abortivi quante sono le volte in cui le basi corrispondenti sono rappresentate nel pezzo di DNA in questione. La dimensione dei frammenti viene poi stimata attraverso un'autoradiogafia, che consiste in un’elettroforesi del DNA marcato con radioisotopi o con molecole fluorescenti. I moderni sequenziatori si basano sul principio di sanger ma utilizzano per il rilevamento dei frammenti fluorocromi non pericolosi e strumentazioni in grado di effettuare un numero elevato di analisi.

40 Fig.11 - Schema metodo di Sanger automatizzato.

Tipizzazione HLA-G

PCR

L’analisi dei polimorfismi di 14bp INS/DEL dell'esone 8 del gene HLA-G è stata effettuata mediante sequenziamento diretto. La reazione di PCR è stata eseguita mediante l’utilizzo di primers locus-specifico in accordo a quanto riportato in letteratura 67. All'estremità 5' di ognuno dei primers è stata inserita una sequenza nucleotidica nota (primer universale M13) utilizzata successivamente per le reazioni di sequenziamento.

41 HLA-G 3’UTR PCR-Primers Amplicon size(bp) HLA-G1 Senso 5'- TGTAAAACGACGGCCAGTGTGATGGGCTGTTTAA AGTGTCACC-3' Antisenso 5'- CAGGAAACAGCTATGACCGGAAGGAATGCAGTTC AGCATGA-3' 209-223 Primer universale M13 forward M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ Primer universale M13 reverse M13R 5’CAGGAAACAGCTATGACC-3’

Tabella 2- Primers di PCR e Sequenziamento dell'esone 8 dell' HLA-G

Per allestire la reazione di PCR è stata preparata una mix con volume di 23µL, contenente:

 50-100 ng di DNA genomico

 dNTP

 buffer

 forward e reverse primers

 Taq DNA polimerasi

A questa mix sono stati aggiunti 2 µL di DNA genomico estratto per un volume finale di 25 µL.

42 Il protocollo utilizzato per la reazione di PCR prevede le seguenti fasi:

1. Denaturazione a 95°C per 2 min 2. Denaturazione a 96°C per 30 sec

3. Annealing a 60°C per 30 sec Per 30 cicli 4. Estensione a 72°C per 50 sec

5. Estensione finale a 72°C per 10 min

L’ amplificato è stato poi controllato mediante elettroforesi su gel d’agarosio al 2% in presenza di bromuro di etidio, ad una concentrazione di 0,5 mg/ml e osservati in seguito ad esposizione con luce Ultravioletta (U.V). Il bromuro di etidio intercalato tra le coppie di basi del DNA diventa fluorescente per illuminazione con UV, emettendo una caratteristica fluorescenza rosso–arancio in corrispondenza delle bande di DNA. Per definire il peso molecolare degli ampliconi è stato caricato, parallelamente ai campioni, un marker di peso molecolare noto con cui effettuare il confronto.

Purificazione

I frammenti amplificati sono stati purificati mediante il sistema enzimatico ExoSap-IT (USB Corporation), che permette di rimuovere i primers e i dNTPs residui. L’ExoSap è composto da due enzimi idrolitici: l’Esonucleasi I che degrada i primers a singolo filamento ed altri singoli filamenti prodotti dalla PCR; e la SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) che defosforila i dNTPs residui.

Il protocollo di purificazione utilizzato è stato il seguente:

1. Dispensare 4 µL di ExoSap-IT ai 26 µL di reazione PCR. 2. Incubare a 37°C per 30 minuti.

3. Incubare a 80°C per 20 minuti per inattivare gli enzimi.

43 Reazione di sequenziamento

Una volta che gli ampliconi sono stati purificati, sono state allestite le reazioni di sequenziamento. Queste reazioni sono state eseguite utilizzando i primers universali M13F (5’TGTAAAACGACGGCCAGT3’) e M13R (5’CAGGAAACAGCTATGACC3’) mediante l’uso della chimica dei BigDye Terminator versione 3.1.

Il protocollo utilizzato per le reazioni di sequenziamento prevede: 1. Denaturazione a 95°C per 5 min

2. Denaturazione 95°C per 10 sec 3. Annealing 60°C per 10 sec 4. Estensione 60°C per 4 min

I frammenti ottenuti sono stati purificati mediante una procedura automatizzata (Agencourt CleanSEQ®), molto semplice e flessibile, che prevede l’utilizzo di biglie magnetiche. Il protocollo prevede che, in una prima fase, i frammenti di sequenza vengano fatti incubare per circa 3 min insieme ad una miscela di biglie magnetiche ed etanolo all’85 %. Successivamente, questa miscela viene trasferita su un magnete in modo da separare le biglie, a cui si sono adesi gli ampliconi, dai nucleotidi, Sali, ddNTPs ed ad altri contaminanti presenti in soluzione. Seguono dei lavaggi con etanolo all’85% ed infine, si effettua una eluizione con buffer (acqua deionizzata).

Fig.12 -Purificazione ampliconi con metodica Agencourt CleanSEQ

I frammenti ora purificati sono stati analizzati mediante elettroforesi capillare eseguita sullo strumento 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Foster City CA), utilizzando un capillare di 36 cm e un particolare polimero POP7.

44 Analisi delle sequenze

Le sequenze sono state esaminate in una prima fase mediante il software Sequencing Analysis per osservarne la qualità e successivamente sono state importate sul software SeqScape v2.7 per effettuarne l'allineamento con la regione dell'esone 8 della molecola HLA-G contenente il polimorfismo.

Il software SeqScape richiede un “project template (PT)” per il gene in questione. Un PT contiene in particolare una libreria (LIB) che per il nostro studio è stata creata con includendo le due varianti (inserzione o delezione di una frammento di 14bp).

Fig.13 -Rappresentazione grafica dei dati analizzati mediante il Software SeqScape. Le sequenze nucleotidiche sono confrontate con la sequenza di riferimento. Nella parte centrale del grafico è possibile visualizzare i picchi degli

elettroferogrammi.

45 Analisi statistica

Le frequenze alleliche e del genotipo della regione 3’ UTR sono state ottenute tramite conta diretta. I singoli confronti delle frequenze alleliche e del genotipo tra le popolazioni sono state eseguite usando il test di Fisher . Le differenze sono state considerate significative per valori di P < 0,05.