I° Scenario: Confronto tra pazienti che hanno portato a termine la gravidanza con successo- Pazienti con gravidanza a termine (PGT) "versus" pazienti con poliabortività (PP), infertilità (PI) e gestosi precoce (PG).
Nella prima fase dello studio abbiamo effettuato un confronto fra le frequenze alleliche e genotipiche del totale delle pazienti (PP+PI+PG) a confronto con le PGT.
Gli alleli presi in esame sono 14bp+ e 14bp-, mentre i possibili genotipi sono 14bp+/14bp+, 14bp-/14bp- e 14bp+/14bp-.
Dal confronto delle frequenze alleliche sembrerebbe che ci sia una leggera differenza nella distribuzione degli alleli nelle due popolazioni oggetto dello studio: per l'allele di 14bp+ si ha rispettivamente 0.56 vs 0.46 e per l'allele 14bp- 0.44 vs 0.54. L'analisi statistica dimostra che non esiste alcuna differenza statisticamente significativa per quanto riguarda la frequenza allelica (p=0,081).
Sulla stessa popolazione abbiamo effettuato un'analisi delle frequenze genotipiche. L'analisi statistica ha messo in evidenza una differenza significativa (p=0,0215) nella distribuzione dei genotipi. In particolare sembrerebbe che i genotipi 14bp+/14bp+ e 14bp+/14bp- siano maggiormente presenti nella popolazione delle pazienti.
Questo primo risultato ci porta ad ipotizzare che la diversa distribuzione genotipica nelle due popolazioni sia in realtà dovuta ad un evento di selezione.
46 Tabella 3-Calcoli delle frequenze alleliche e genotipiche della regione polimorfica 3’UTR dell’HLA-G in PP+PI+PG e PGT.
PP+PI+PG PGT Allele n (%) n (%) 14bp+ 102 (0,56) 73 (0,46) 14bp- 80 (0,44) 85 (0,54) Tot (n) 182 (1,00) 158 (1,00) Genotipi 14bp+/14bp+ 26 (0,29) 9 (0,11) 14bp-/14bp- 15 (0,16) 15 (0,19) 14bp-/14bp+ 50 (0,55) 55 (0,70) Tot (n) 91 79
Fischer's exact test PP+PI+PG vs PGT
Allele p=0,081
Genotipi P=0.0215
Abbiamo riportato i nostri calcoli su due grafici per dimostrare visivamente i risultati ottenuti. Nel primo grafico abbiamo messo in ascisse le popolazioni scelte per lo studio, ovvero PP+PI+PG e PGT, e in ordinata le frequenze alleliche.
Grafico 1-Distribuzione delle frequenze alleliche a confronto tra PP+PI+PG e PGT.
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 PP+PI+PG PGT 14bp+ 14bp-
47 Sebbene la distribuzione grafica degli alleli 14bp+ e 14bp- appare graficamente invertita, l'analisi statistica che si avvicini alla significatività minima rimane non significativa. Per chiarire questo aspetto sarebbe necessario aumentare la numerosità dei campioni.
Nel secondo grafico abbiamo riportato invece in ascisse i polimorfismi genetici presi in considerazione e in ordinate le loro relative frequenze calcolate sempre nelle due popolazioni. Quello che si nota è appunto una differenza delle distribuzioni genotipiche 14bp+/14bp- e 14bp+/14bp+ nelle due popolazioni.
Grafico 2-Distribuzioni delle frequenze dei polimorfismi genetici nelle PP+PI+PG e nei PGT.
II° scenario: Confronto tra coppie che hanno portato a termine la gravidanza con successo (Coppie PGT) e coppie con poliabortività (P), infertilità (I) e gestosi precoce (G) (Coppie P+I+G).
Come precedentemente spiegato, poiché il genotipo dell’embrione dipende sia dal padre che dalla madre per stimare le potenzialità dell’embrione a produrre la proteina sHLA-G è utile che l’analisi delle varianti del gene HLA-G sia eseguita su entrambi i partners28
. Così abbiamo esaminato la coppia cioè abbiamo incluso anche le frequenze alleliche e genotipiche dei partners. Sostanzialmente quello che abbiamo osservato è che i valori restano in proporzione pressoché invariati rispetto a quelli delle pazienti.
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 14bp+/14bp+ 14bp-/14bp- 14bp-/14bp+ PP+PI+PG PGT
48 Tabella 4-Calcoli delle frequenze alleliche e genotipiche della regione polimorfica 3’UTR dell’HLA-G in Coppie
P+I+G e Coppie PGT.
Coppie P+I+G Coppie PGT
Allele n (%) n (%) 14bp+ 184 (0,51) 148 (0,47) 14bp- 180 (0,49) 168 (0,53) Tot (n) 364 (1,00) 316 (1,00) Genotipi 14bp+/14bp+ 44 (0,24) 30 (0,19) 14bp-/14bp- 40 (0,22) 37 (0,23) 14bp-/14bp+ 98 (0,54) 91 (0,58) Tot (n) 182 (1,00) 158 (1,00)
Fischer's exact test Coppie P+I+G vs Coppie PGT
Allele p=0.36
Genotipi P=0.52
Sulla base dei risultati possiamo ipotizzare che dal punto di vista dei polimorfismi, l'introduzione del contributo genetico paterno, strettamente correlato al polimorfismo INS/DEL di 14bp della regione 3’ UTR, sembrerebbe non influenzare in maniera significativa l’esito favorevole o sfavorevole della gravidanza. In una visione diversa si potrebbe ipotizzare che il maggiore contributo sia strettamente dipendente dalla madre. Inoltre, in accordo con i dati della letteratura, sarebbe interessante valutare il ruolo degli antigeni paterni nell'embrione.
A questo punto abbiamo messo a confronto i nostri dati (PP+PI+PG e PGT) con una popolazione di donatori di sangue cordonale allo scopo di stimare la frequenza del polimorfismo di 14bp nella popolazione generale – Donatori di Sangue Cordonale (DSC). Questo confronto è importante perché ci permette di dimostrare se le tre popolazioni oggetto di
49 studio sono in equilibrio genetico. L'analisi dei dati ha dimostrato che la frequenza dei genotipi Ins/Del 14bp per le popolazioni PP+PI+PG e la DSC rispettano la legge di Hardy-Weinberg (HW) mentre la PGT appare non essere in equilibrio di HW (p=0.00037). In maniera
interessante i nostri dati mettono in evidenza che è la popolazione di controllo ad avere una frequenza di distribuzione dei genotipi diversa rispetto alla popolazione delle pazienti e di quella generale: 14bp-/14bp+ 0,70 vs 0,55 e 0,54; 14bp+/14bp+ 0,11 vs 0,29 e 0,21.
III° Scenario: Confronto tra PP, PI, PG e DSC
In quest’ultima parte dello studio abbiamo stratificato le popolazioni prese in esame ( PP, PI, PG) e le abbiamo messe ciascuna a confronto con i DSC e non con la PTG. Questo perché abbiamo osservato precedentemente che la PTG non rispetta la legge di HW e quindi rappresenterebbe di per se una popolazione “selezionata” e quindi non idonea per un’analisi statistica di tipo Casi/Controlli. Inoltre la popolazione generale arruolata è una popolazione di donatori di sangue cordonale mista, maschi e femmine, che riflettono in maniera assolutamente casuale la frequenza allelica e genotipica del polimorfismo Ins/Del 14bp. In altre parole l’utilizzo di una popolazione generale, che rispetti l’equilibrio di HW, rappresenterebbe la popolazione di riferimento ideale per l’analisi delle frequenze alleliche e genotipiche.
Tabella 5-Stratificazione delle popolazioni PP, PI, PG a confronto con la DSC.
PP PI PG DSC Allele n (%) n (%) n (%) N (%) 14bp+ 30 (0,43) 21 (0,27) 25 (0,73) 138 (0,48) 14bp- 40 (0,57) 57 (0,73) 9 (0,26) 152 (0,52) Tot (n) 70 (1) 78 (1) 34 (1) 290 (1) p 0.506609 0.001211 0.00589 Genotipi 14bp+/14bp+ 5 (0,14) 1 (0,026) 12 (0,71) 30 (0,21) 14bp-/14bp- 10 (0,29) 16 (0,41) 4 (0,24) 37 (0,25) 14bp-/14bp+ 20 (0,57) 22 (0,57) 1 (0,06) 78 (0,54) Tot (n) 35 (1) 39 (1) 17 (1) 145 (1) p 14bp+/14bp+ 0,48 0,0066 0,00005 14bp-/14bp- 0,8 0,073 1 14bp-/14bp+ 0,85 0,86 0,00014
50 Per quanto riguarda il confronto tra la distribuzione allelica e genotipica nelle PI vs DSC non abbiamo osservato nessuna differenza statisticamente significatività della distribuzione né degli alleli né dei genotipi. Il nostro risultato, in accordo con diversi studi della letteratura, parrebbe confermare che non esiste una correlazione tra i polimorfismi dell’HLA-G esaminati e la presenza di aborti spontanei ricorrenti. La questione rimane ancora aperta in quanto alcuni studi invece riportano che esiste una forte associazione tra 14bp Ins e gli aborti ricorrenti53,54.
Diversi e più interessanti sono i risultati ottenuti dal confronto tra PI vs DSC. I nostri dati mettono in evidenza che esiste una differenza statisticamente significativa nella distribuzione delle frequenze alleliche tra le due popolazioni (p=0,001211). A questo punto è stata effettuata un’accurata analisi della distribuzione dei genotipi allo scopo di individurare quello\i alterato\i. In letteratura non esiste ancora un risultato unanime in merito, ma dal nostro studio sembrerebbe che la frequenza del genotipo 14bp+/14bp+ sia più elevata nelle PI rispetto ai DSC (0,026 vs 0,21 - p=0,0066) . La presenza maggiore del suddetto genotipo è associato ad una riduzione dei livelli di produzione dell’HLA-G26
e quindi ad una maggiore probabilità di mancato sviluppo dell’embrione28
.
Tanto straordinario quanto affascinante è, invece, il confronto tra PG e DSC. Quello che osserviamo è una distribuzione della frequenza allelica altamente significativa (p=0,00589). Anche in questo caso è obbligatorio effettuare un’accurata analisi della distribuzione delle frequenza genotipiche. I nostri dati mettono in evidenza un aumento statisticamente significativo del genotipo 14bp+/14bp+ (p=0,00005) e del genotipo 14bp+/14bp- (p=0,00014). In letteratura non esiste nessuno studio che dimostri una correlazione tra questo polimorfismo e la gestosi precoce. Esistono diversi studi invece che dimostrano l’inesistenza tra il polimorfismo 14bp nell’esone 8 dell’HLA-G e la preeclampsia.
51
Conclusioni
Il nostro studio si proponeva di verificare se esiste un’associazione tra il polimorfismo INS/DEL di 14bp dell’esone 8 dell’HLA-G e un’anomalia della placentazione, quale possibile causa della Poliabortività, dell’Infertilità e della Gestosi precoce.
In conclusione possiamo dire che per quanto riguarda la Poliabortività i nostri risultati, al pari degli altri studi in letteratura, non hanno riscontrato nessuna differenza statisticamente significativa della distribuzione né degli alleli né dei genotipi.
Invece, per ciò che concerne l’Infertilità, i nostri risultati confermano un’associazione negativa con la presenza del genotipo 14bp+/14bp+, aprendo degli scenari molto interessanti in campo clinico-diagnostico. Infatti, l’analisi del polimorfismo INS/DEL di 14bp nell’esone 8 dell’HLA-G potrebbe essere utilizzata per aumentare le probabilità di successo in caso di Procreazione Medicalmente Assistita Eterologa e/o predire le probabilità di successo in caso di Procreazione Medicalmente Assistita Omologa. Conoscendo infatti il genotipo del donatore di seme, si potrebbe scegliere quello compatibile con il genotipo della futura madre. Questo perché, anche se è vero che il genotipo del partner non sembra influenzare l’esito della gravidanza, tuttavia esso contribuisce al genotipo dell’embrione quanto la madre. Essendo l’embrione un attivo orchestratore del proprio impianto e del proprio destino come dimostrato da numerosi studi in letteratura, la presenza in esso di un genotipo o dell’altro potrebbe essere condizionante ai fini dell’outcome gestazionale.
Il risultato ottenuto nella Gestosi precoce è ancora più interessante in quanto in letteratura i pochi studi presenti non dimostrerebbero alcuna associazione con il polimorfismo INS/DEL di 14bp in 3’ UTR. Dal nostro studio emerge, invece, un’associazione negativa, statisticamente significativa, tra il genotipo INS/INS e l’insorgenza della Gestosi Precoce. Questo risultato potrebbe trovare subito delle utili implicazioni nella pratica clinica e nella prevenzione Si potrebbe pensare di introdurre l’analisi del polimorfismo INS/DEL dell’HLA-G come test di screening della gravidanza per cercare di prevenire il suo insuccesso. Nello specifico il genotipo INS/INS potrebbe essere identificato tra i fattori di rischio della gestosi/preeclampsia. Se questi nostri dati fossero confermati da altri autori o su una popolazione più numerosa, potremmo aggiungere un ulteriore tassello a questo enigmatico paradosso immunologo quale è la gravidanza, nella speranza di poter contribuire così ad aumentare il numero di bimbi che, dopo un “viaggio” di 9 mesi, possono finalmente abbracciare la loro mamma.
52
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Ringraziamenti
Con questo elaborato si conclude il mio “percorso-avventura” universitario iniziato ormai qualche anno fa. Se mi guardo indietro rivedo quella ragazzina diciannovenne sicura e determinata che varca la soglia del cancello San Jacopo dell’Accademia Navale, salutando con gli occhi luccicanti e il sorriso smagliante sul volto, mamma e papà. Ad ogni passo sentivo crescere dentro di me la voglia di iniziare a scrivere la mia storia, di mettermi in gioco e di dimostrarmi che non esisteva nulla che non potessi fare se solo c’avessi provato e mi fossi impegnata. Oggi mi guardo e vedo quella ragazzina diventata una donna con ancora più grinta ed entusiasmo che ha raggiunto il suo traguardo e ha tanta voglia di volare ancora più in alto. Tutto questo non sarebbe stato lo stesso senza la più grande risorsa che esista al mondo: le persone, quelle che conoscevo già, quelle che ho conosciuto e quelle che ora non fanno più parte della mia vita ma che hanno lasciato comunque un segno.
Allora inizio con ringraziare i miei genitori per il sostegno e l’incoraggiamento che mi hanno sempre dimostrato infondendomi tanta forza. Sempre presenti anche a 900 km di distanza con mille attenzioni e preoccupazioni nei miei riguardi. Siete riusciti a rendere ogni evento, momento per me speciale, straordinario. Siete i genitori che ogni figlio vorrebbe e io mi sento tanto fortunata.
Grazie mamma, tu mi hai insegnato a combattere e conquistare, mi hai insegnato cosa vuol dire essere altruista, mi hai insegnato ad osare e a non arrendermi mai e senza tutto questo non sarei dove sono e non sarei quella che sono.