Campioni. Previa approvazione del comitato etico dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Senese e compilazione del modulo per il consenso informato, è stato selezionato, nell’anno 2015, il gruppo campione presso il Centro per la Diagnosi e Terapia della Sterilità di Coppia, U.O.C. di Ostetricia e Ginecologia, presso la medesima Azienda. Un totale di 108 donne di età compresa tra 25 e 44 anni, che sono state sottoposte a terapia ormonale per Induzione della Crescita Follicolare Multipla, sono state coinvolte nello studio come campione. L’unico criterio di esclusione previsto è stato l’assunzione di antibiotici nel mese precedente l’inizio dello studio.
Protocollo Terapeutico di Induzione della crescita follicolare multipla. Il protocollo scelto per l’Induzione della Crescita Follicolare Multipla di tutte le donne coinvolte nello studio, include la somministrazione di gonadotropine ricombinanti (Gonal F-Merck Serono, Italia o Peregon – MSD, Italia) con un dosaggio iniziale di 150-200 UI dal primo o secondo giorno di mestruazione, spontanea o indotta. La dose di gonadotropine è poi adattata in base alla risposta ovarica, valutata ecograficamente. Dal momento in cui il follicolo dominante raggiunge i 14 mm (6° giorno di mestruazione), l’antagonista del GnRH viene somministrato quotidianamente (Orgalutran –MSD, Italia e Cetroride – Merck Serono, Italia), fino al giorno del triggering dell’ovulazione. Il triggering viene effettuato con hCG (Gonasi, 10.000 UI- IBSA, Italia e Ovitrelle –Merck Serono, Italia), quando almeno due follicoli raggiungono i 18 mm di diametro. Circa 36 ore dopo il triggering, si procede con il prelevare gli ovociti (Figura 7).
Figura 7. Schema temporale del protocollo terapeutico per la Procreazione Medicalmente Assistita. Con il tratteggio sono
indicati i periodi variabili a seconda della fisiologia delle donne. Al primo giorno di mestruazione viene somministrato gonadotropine ricombinanti (r-FSH) al fine di stimolare la produzione multipla di follicoli. Al sesto giorno della mestruazione, per abbattere i livelli di gonadotropine, viene somministrato l’antagonista dell’ormone stesso (GnRH-ant). Per monitorare le dimensione e il numero dei follicoli le donne vengono controllate ecograficamente e mediante dosaggio dei livelli plasmatici di estradiolo (E2). Quando almeno due follicoli raggiungono dimensioni superiori ai 18 mm viene somministrata la gonadotropina corionica umana (hCG) per indurre l’ovulazione. Dopo circa 36 h il prelievo degli ovociti. Al momento dello screening viene effettuato un primo tampone vaginale (TVA0) a cui segue un secondo tampone vaginale al momento del prelievo degli ovociti (TVA1).
Screening
Attesa del ciclo mestruale r-FSH GnRH-ant Almeno 2 follicoli >18 mm 36H hCG Prelievo degli ovociti TVA 0 TVA 1 1°g Ciclo mestruale 6°g Monitoraggio ecografico e prelievi giornalieri per
Tamponi Vaginali. Il gruppo campione è stato sottoposto a due tamponi: il primo durante la visita di screening il mese precedente l’inizio della terapia ormonale, il prelievo ovocitario (Figura 7).
Saggio di Quantificazione delle Diamine (VADA): Questo saggio enzimatico si basa sull’enzima diammina ossidasi (DAO) che reagendo con Cadaverina e la Putrescina, prodotti del catabolismo batterico, producono H2O2 in quantità proporzionale (34). Ogni mole di diammina rilasciata nel fluido vaginale reagisce con la DAO producendo una mole di H2O2. L’ H2O2 prodotta durante questa reazione viene misurata mediante spettrofotometro attraverso una reazione colorimetrica catalizzata dalla perossidasi di rafano (HRP). Il saggio è in grado di rilevare concentrazione di diammine che vanno da 4 a 256 µM.
La soluzione in cui è stato risospeso il tampone viene saggiata per l’eventuale presenza delle diammine secondo il protocollo messo a punto dai colleghi Mendonca K et al. (3). Cento microlitri di ogni campione viene sottoposto a saggio enzimatico in piastre di polistirene da 96 pozzetti (Nunc, 25361), aggiungendo secondo protocollo i seguenti reagenti:
• 45 µl del reagente sviluppante il colore (4 parti di 1.5 M Tris a pH 9,0 + 1 parte di 400 mM 4-aminoantipirina + 1 parte di 40 mM fenolo, Sigma-Aldrich Co) • 5 µl HRP (175 U/ ml in acqua, Sigma-Aldrich Co) e 50 µl DAO (1600mU/ml in
acqua, Sigma-Aldrich Co).
Le piastre sono state incubate a 50°C per 1 ora. La densità ottica è stata letta con spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 510 Nm.
Ogni campione è stato testato sia con l’aggiunta di DAO che serve per rilevare la possibile presenza di H2O2 prodotta da lattobacilli presenti nel microbiota vaginale o da cellule umane come i macrofagi. Per ogni campione il valore di OD ottenuto senza l’aggiunta di DAO è stato sottratto dal valore ottenuto con il DAO.
L’OD risultate è stato usato per calcolare la concentrazione delle diammine nel campione usando curve standard di Putrescina e Cadaverina in rapporto 1:1 (range 4- 256 µM). I risultati sono stati espressi come µM di diammine per campione.
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Batteriologia: La ricerca batteriologica ha avuto lo scopo di ricercare specie appartenenti agli Enterobatteri, Enterococchi, Streptococchi, Stafilococchi, Lattobacilli, anaerobi stretti e miceti (Candida spp) tramite crescita in terreni di coltura selettivi e metodi di identificazione di specie.
I tamponi vaginali sono stati risospesi in 1 ml di soluzione salina sterile contenente il 10% di glicerolo. I tamponi bagnati sono stati direttamente piastrati in terreni solidi selettivi (Oxoid, Milano, Italia) per varie specie batteriche:
• COS, terreno ricco e differenziale per evidenziare il tipo di emolisi,
• CNA, terreno COS con l’aggiunta di colistina e acido nalidixico, selettivo per gli streptococchi,
• Sale Mannite, terreno contenente NaCl 7,5% e mannitolo, selettivo e differenziale per gli stafilococchi mannitolo fermentanti e non fermentanti, • McConkey, terreno contenente sali biliari e lattosio, selettivo per batteri Gram
negativi e differenziale per enterobatteri lattosio fermentanti e non fermentanti, • Sabouraud, terreno con pH di 5,6, contenente destrosio, cloramfenicolo e
gentamicina per inibire la crescita della maggior parte dei batteri, selettivo per miceti,
• Gardnerella, terreno CNA con l’aggiunta di gentamicina e amfotericina, selettivo per G. vaginalis,
• Scheadler, selettivo per batteri anaerobi obbligati,
• Rogosa, terreno con elevata concentrazione di acetato selettivo per la crescita dei Lattobacilli.
Nel caso di positività, le specie batteriche sono state identificate usando test biochimici standard:
• Test della Catalasi per distinguere Streptococchi dagli Stafilococchi,
• Test della Coagulasi (Oxoid) al fine di evidenziare l’eventuale presenza di coagulasi, per identificare e diversificare S. aureus dagli altri Stafilococchi, • Test dell’Ossidasi (Oxoid) che evidenziando la presenza della citocromo C
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• Test di Agglutinazione (Oxoid), metodo rapido per l’identificazione degli streptococchi di gruppo A, B, C, D, F e G,
• Gallerie API diverse (Biomérieux Italia S.p.A., Firenze, Italia), specifiche per specie batteriche raggruppabili nello stesso profilo metabolico.
Analisi statistica. L’analisi dei dati è stata effettuata usando il software GraphPad Prism4 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). La significatività statistica è stata valutata mediante t-Student test. Un p-value inferiore a 0,05 (p <0,05) è stato considerato statisticamente significativo.
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RISULTATI
Per ogni paziente inclusa nello studio sono stati eseguiti due tamponi vaginali: uno prima dell’inizio della terapia ormonale per l’Induzione della Crescita Follicolare Multipla ed uno al momento del prelievo degli ovociti, quindi al termine della terapia ormonale stessa (Figura 7).
Al fine di caratterizzare eventuali alterazioni della flora vaginale è stata quantificata la presenza di Putrescina e Cadaverina nel fluido vaginale delle pazienti prima e dopo la stimolazione ormonale, mediante l’utilizzo del saggio enzimatico VADA.
L’analisi statistica, della media delle concentrazioni rilevate nei fluidi vaginali dei campioni prima del trattamento ormonale, 10,92 ± 2,34 µM e dei campioni dopo il trattamento 43,64 ± 8,34 µM, mostra una differenza statisticamente significativa (p=0,0003) (Figura 8).
Sulla base della concentrazione di diammine (DA) rilevate i campioni sono stati divisi in tre gruppi:
• concentrazione di DA < 1 µM, flora batterica vaginale fisiologica
• concentrazione di DA compresa tra 1 e 25 µM, flora batterica vaginale mista • concentrazione di DA >25 µM, flora batterica vaginale alterata
Dall’analisi dei campioni è emerso che, prima del trattamento ormonale per l’Induzione della Crescita Follicolare Multipla, la concentrazione di Putrescina e Cadaverina, nei fluidi vaginali, risultava inferiore a 1 µM nel 55,6% dei campioni, dopo il trattamento solo il 18,7% dei campioni mostrava un contenuto di diammine paragonabile ai campioni con flora vaginale normale. Condizione opposta è stata osservata dopo iperstimolazione ovarica controllata, infatti, la percentuale di campioni con concentrazione di diammine superiore a 25 µM, prima del trattamento, era pari all’11,1%, per poi aumentare fino al 51,4% dopo il trattamento con gonadotropine esogene (p = 3,55-10) (Figura 9).
La percentuale di campioni con una concentrazione intermedia di diammine non varia in modo significativo con la terapia.
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Figura 8. Concentrazione delle diammine espresse in µM sui fluidi vaginali delle donne prima e
dopo trattamento ormonale. La media delle concentrazioni di Putrescina e Cadaverina prima del trattamento ormonale corrisponde a 10,92 ± 2,34 µM, mentre a seguito del trattamento ormonale la concentrazione media sale a 43,64 ± 8,34 µM (p=0,0003).
Pr e tr a tta me nto or m on ale Po st tra tta me nto or m on ale 0 5 0 1 0 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 [ ] D i a m m i n e M ic ro m o li D ia m m in e S a m p le s
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Figura 9. Rappresentazione mediante istogramma delle concentrazioni di diammine (µM) nei
fluidi vaginali delle donne prima e dopo trattamento ormonale per la stimolazione ovarica controllata. Come mostrano gli istogrammi in bianco, prima del trattamento ormonale, il 55,6% dei campioni avevano concentrazioni di diammine sotto l’1µM, mentre dopo il trattamento la percentuale dei campioni scende al 18,7%. Gli istogrammi in grigio scuro rappresentano i campioni con alte concentrazioni di diammine (>25µM), e mentre prima del trattamento ormonale erano solo l’11,1%, dopo il trattamento la percentuale sale al 51,4%
(p = 3,55-10). La percentuale di donne che producono livelli intermedi di diammine rimane costante. 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0
Pre Trattamento Ormonale Post Trattamento Ormonale
% d i c am p io n i Negative 0-25 µM >25 µM
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Parallelamente al dosaggio delle diammine, i tamponi vaginali sono stati analizzati anche mediante batteriologia classica.
Dall’analisi delle crescite batteriche ottenute dai due tamponi prelevati è stato osservato un significativo incremento della positività per potenziali patogeni dopo stimolazione ovarica controllata.
Come si può osservare in Figura 10, prima del trattamento ormonale il 35,3% dei tamponi vaginali sono risultati positivi per almeno un microrganismo potenzialmente patogeno per il tratto genitale, mentre, dopo il trattamento ormonale sono risultati positivi il 43,1% dei campioni. L’incremento della percentuale di positività è risultato statisticamente significativo (OR=2,61; p=0,0007).
Andando ad analizzare i microrganismi identificati nei tamponi vaginali rileviamo a seguito del trattamento ormonale, un incremento del 13,8% di campioni positivi per Enterobacteriacae e un incremento del 30,8% per Streptococcus spp
(Figura 11). La percentuale di campioni positivi per lattobacilli, invece, non subisce particolari variazioni a seguito del trattamento ormonale con gonadotropine esogene e si mantiene intorno al 60% (Figura 12).
L’incremento consistente dei campioni positivi per Streptococcus spp. e per Enterobacteriacae è interessante perché è già descritto in letteratura una associazione fra E. coli, streptococchi e anaerobi e l’abbassamento del Life Birth Rate (LBR), cioè la percentuale delle donne che si sottopongono a trasferimento dell’embrione e che riescono a portare a termine la gravidanza con successo (35).
39 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Pre Trattamento Ormonale Post Trattamento Ormonale
% ta m p o n ip o sitiv i
Figura 10. Analisi batteriologica su 108 tamponi vaginali di donne prima e dopo trattamento
ormonale per stimolazione ovarica controllata. Gli istogrammi mostrano i campioni positivi per batteri potenzialmente patogeni. A sinistra è rappresentata la percentuale di campioni positivi prima del trattamento ormonale (35,3 %), sulla destra la percentuale di campioni positivi dopo il trattamento ormonale (43,1 %) (p=0,0007).
40 En tero ba c teri a ce a e Str e pto c oc c us s pp Ca n did a s p p Sta ph ylo c oc c us s pp En tero c oc c us s sp 0 2 0 4 0 6 0 % t a m p o n i p o s it iv i P r im a d e l T r a tta m e n to O r m o n a le D o p o il T r a tta m e n to O r m o n a le
Figura 11. Istogramma delle frequenze dei microrganismi maggiormente rappresentati nei
tamponi vaginali delle 108 donne sottoposte a protocolli di Procreazione Medicalmente Assistita, prima e dopo il trattamento ormonale per la stimolazione ovarica controllata. Nelle colonne in chiaro sono riportate le frequenze dei microorganismi prima del trattamento e in scuro la percentuale degli stessi batteri dopo il trattamento. Per le Enterobacteriaceae dopo trattamento ormonale registriamo un incremento del 13,8%, ancora più consistente è l’incremento per Streptococcus spp che aumenta del 30,8%.
41 Pre tra tta me nto orm on ale Po st tra tta me nto orm on ale 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 % c a m p io n i L a tto b a c illi
Figura 12. Gli Istogrammi indicano la percentuale di campioni positivi per Lattobacilli. Prima del trattamento ormonale circa il 67% dei campioni sono risultati positivi per lattobacilli e la percentuale rimane praticamente invariata (60%) dopo il trattamento ormonale con gonadotropine esogene.
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Tale andamento tende a confermare l’ipotesi che la terapia ormonale va ad alterare l’equilibrio del microbiota vaginale predisponendo ad una condizione di Vaginosi Batterica.
Al fine di capire quale fosse l’impatto delle alterazioni del microbiota vaginale sull’outcome delle pazienti sottoposte a Fecondazione in vitro, sono stati interpolati, mediante Diagramma di Venn, i dati ottenuti dalla batteriologia dei tamponi vaginali, la concentrazione delle diammine nei fluidi vaginali, prima e dopo stimolazione e il fallimento dell’impianto.
Il numero totale di donne analizzate scende ad 82 poiché alcune non sono state seguite dopo l’impianto e quindi non sono pervenute notizie circa il successo o meno. Sul campione preso in esame 55 donne con flora vaginale alterata falliscono nell’impianto, il 67% del campione totale. Di queste 9 falliscono l’impianto indipendentemente dai fattori analizzati e 11 donne sembrano avere alterazioni del microbiota che non incidono sull’impianto stesso. Sette campioni non rispondono ai requisiti richiesti per questo sono esclusi dall’analisi. Questi campioni sono ragionevolmente donne che hanno avuto un esito positivo di impianto. (Figura 13).
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Figura 13. Il Diagramma di Venn mostra le intersezioni tra le infezioni microbiche, la
concentrazione delle diammine e il tasso di impianto per le donne che si sottopongono alla Fecondazione In Vitro, dopo somministrazione di dosi elevate di gonadotropine esogene. Un totale di 82 donne è stato incluso nell'analisi e 64 hanno fallito l'impianto, di queste donne, 55 erano positive per uno o più agenti patogeni e/o positivi per la produzione di alte concentrazioni di diammine. Solo 9 donne hanno fallito l'impianto senza associazione con l'infezione microbica e 11 donne, anche se presumibilmente affette da dismicrobismi sono risultate positive per l’impianto. Sette donne non soddisfano i parametri richiesti e quindi non vengono incluse nell’analisi.
Tampone Positivo
DA >25 µM
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