2.1. MATERIALI
• SDS, Cloruro di Magnesio è stato acquistato da BioRad Laboratories;
• Ammonio persolfato, acrilammide e bis-acrilammide. TEMED, Colorante Coomassie Brillant Blue G250 sono stati acquistati da BioRad Laboratories;
• Tris (base), Glicina, Glicerolo sono stati acquistata d J.T. Baker; • Ditiotreitolo è stata acquistata da Sigma Chemical Co.;
• [8-14
C] inosina è stata acquistata da Moravek Biochemical;
• Prestained standard per SDS Page/elettroforesi è stata acquistata da Invitrogen • DE-81 carta cromatografica è stata acquistata da Whatman;
• DMEM alta concentrazione di glucosio (4.5 g/L Glucosio), FBS EU Standard South America Origin (Brazil), FBS te-free, Glutammina 200nM, Mix Penicillina-Streptomicina 5K/5K 5000 μg/ml, Mix Tripsina-Versene (EDTA) 1X sono stati acquistati da Euroclone; • Liquido di scintillazione Hi Safe II è stato acquistato da Wallac;
• L'acqua milliQ è preparata secondo il sistema Millipore;
• Anticorpi Peroxidasi-coniugati Anti Rabbit/Anti mouse sono stati acquistati da Dako; • Anticorpi primari sono stati acquistati da Novus Biological;
• ECL kit, 0.45μm e 0.22μm Syringe Driven Filter sono stati acquistati da Millipore;ù • MitoTracker Green (MT-Green), tetrametilrodamina metil estere (TMRM) e MitoTracker Red CM-H2XROS (MT-ROS) sono stati acquistati da Molecular Probes, Invitrogen (San Giuliano Milanese, Milano, Italia;
• Click-ET HPG Alexe Flour 488 Protein Synthesis Assay Kit è stato acquistato da Thermo Fisher Scientific;
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2.2. METODI
2.2.1. METODI DI COLTURA CELLULARE
La linea cellulare A549 utilizzata in questo lavoro, proviene da adenocarcinoma alveolare umano. Ho usato tre diversi tipi cellulari: le cellule wild type con fenotipo tumorale, le cellule ps-Cont e le cellule ps-cN-II. Le cellule ps-Cont e le cellule ps-cN-II sono cellule trasfettate con un plasmide: le prime posseggono un plasmide con sequenza scramble e fungono da controllo, le seconde possiedono uno short-hairpin per la cN-II che risulta quindi essere silenziata al 50%.
Le A549 sono state coltivate in Dulbecco's modified Eagle'medium high glucose (DMEM) a cui è stato aggiunto un 10% di Foetal Bovine Serum (FBS), 2mM L-glutammina, 100 U/ml di Penicillina e 100 μg/ml di Streptomicina. Le cellule sono state fatte crescere a 37°C incubate in aria umidificata al 5%. I tre tipi cellulari sono stati fatti crescere in assenza e in presenza di 2-deossiglucosio, un composto che inibisce la glicolisi, fungendo in questo modo da fattore di stress cellulare.
2.2.2. PREPARAZIONE DEGLI ESTRATTI PER L’ATTIVITA’ FOSFOTRASFERASICA
Per la determinazione dell'attività fosfotrasferasica viene preparato l'estratto cellulare nel seguente modo: il pellet ottenuto in seguito alla centrifugazione delle cellule viene risospeso in Tris-HCl pH 7,4 + PIC (cocktail inibitore delle proteasi); si procede dunque con tre cicli di congelamento/ scongelamento a -80°C x 15 minuti; nella fase successiva del protocollo si centrifuga x 40 minuti a 10000x g e si preleva il sovranatante. Infine viene effettuato il dosaggio delle proteine con il metodo Bradford.
2.2.3. SAGGIO DELL'ATTIVITA' FOSFOTRASFERASICA
L'attività fosfotrasferasica (PHT) di cN-II è misurata con un dosaggio radiochimico in cui viene valutata la quantità di [8-14C]IMP prodotto nel tempo, a partire da [8-14C]inosina. La miscela di reazione contiene [8-14C]inosina 1.4 mM, MgCl2 20mM, IMP 2mM, ATP 5mM, un adeguato volume della soluzione contenente l'enzima in modo che siano 5/10 ng di proteina, Tris-HCl pH 7.4 100 mM, in un volume totale di 40microL. La reazione parte con l'aggiunta, al tempo 0', dell'enzima alla miscela di reazione: si prelevano 8 μL e si depositano su dischetti di carta a scambio ionico DE-81 carichi positivamente, in grado
52 di legare l'IMP prodotto. Lo stesso procedimento viene ripetuto ai tempi 10', 20', 30', prelevando dalla miscela mantenuta a 37°C. I dischetti sono sottoposti a 3 lavaggi: il primo di 15 minuti in ammonio formiato 1mM, e gli altri due di 10 minuti in acqua deionizzata. Infine i dischetti sono posti in apposite fiale, riempite con 4ml di liquido di scintillazione Hi safe II e inseriti nello scintillatore per misurare la radioattività (Tozzi et al., 1991).
2.2.4. PREPARAZIONE DEGLI ESTRATTI PER L'IMMUNOBLOTTING
Le cellule sono state lavate due volte con PBS in presenza di inibitori di proteasi e fosfatasi (PIC; 20 mM β-glicerofosfato fresco; 1 mM PMSF fresco; 1 mM vanadato di sodio fresco; 5 mM sodio pirofosfato fresco). Successivamente è stato aggiunto 1ml di tampone di lisi freddo (25 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 mM NaCl; 50 mM NaF; 0,5 mM EDTA pH 8,0; 0,5 % TRITON X-100; 20 mM β-glicerofosfato fresco; 1 mM PMSF fresco; 1 mM vanadato di sodio fresco; 5 mM sodio pirofosfato fresco). Le cellule sono state quindi raccolte con lo scraper e centrifugate a 10000xg; dopodichè è stato prelevato il sovranatante e congelato a -80°C. In seguito la concentrazione proteica è stata determinata con il metodo Bradford.
2.2.5. WESTERN BLOTTING
L'elettroforesi SDS-PAGE su gel di agarosio viene eseguita con il metodo Laemmli (gel al 12% per AMPK e AKT; gel al 9% per mTOR). I campioni vengono caricati insieme al Sample Buffer (blu di bromofenolo 0.25%, SDS 15.8% in Tris-HCl 0.5M, pH 6.8) a cui è stato aggiunto il beta-mercapto-etanolo, per una concentrazione finale del 5%. Il western blotting è stato eseguito usando una membrana PVDF (90 Volts per un'ora; transfer buffer: [TRIS 0.025 M + Gly 0.129 M], Metanolo, acqua MilliQ in rapporto 1: 1: 3) e processata per immunorilevazione (Laemmli, 1970). Le membrane sono state incubate e agitate over-night a 4°C con anticorpo primario 1:1000 in 1% latte in TBS + Tween 20 allo 0,05% per quanto riguarda Akt e AMPK, e con anticorpo primario 1:500 in 5% BSA per quanto riguarda mTOR. Successivamente, dopo 3 cicli di lavaggi (5' TBS, 5' TBS+Tween, 5' TBS), le membrane sono state esposte ad anticorpi secondari IgG anti-rabbit (1:10000) per due ore a temperatura ambiente (per Akt anti mouse 1:2000 in TBS-t). La visualizzazione era ottenuta usando il kit ECL, in seguito ad un altro ciclo di lavaggi.
53 Successivamente le membrane sono state processate per la immunorilevazione della β- actina. Dopo 2 lavaggi in TBS per 5 minuti sono state incubate con anticorpo primario per la β-actina (1:10000), a temperatura ambiente per due ore, quindi sottoposte al ciclo di lavaggi (5' TBS, 5' TBST, 5' TBS) e incubate con anticorpo secondario anti-mouse (1:2000) per due ore a temperatura ambiente. Dopo due cicli di lavaggio, le bande immunoreattive sono state evidenziate con il kit ECL.
2.2.6. METODI AL CONFOCALE PER LA RILEVAZIONE DEI ROS MITOCONDRIALI, DELLA MASSA MITOCONDRIALE E DELLA SINTESI PROTEICA
Per gli esperimenti di microscopia confocale, le cellule sono coltivate su vetrini di 13 mm di diametro in piastre da 24 pozzetti. In seguito ai trattamenti, le cellule sono lavate e incubate con 2 nM MitoTracker Red CM-H2XROS (MT Red) e 2 nM MitoTracker Green (MT Green) per 30 minuti a 37°C con il 5% CO2. L'MT Red è usato per misurare la generazione di ROS nei mitocondri, mentre l'MT Green è utilizzato per visualizzare la popolazione mitocondriale.
La fluorescenza è valutata con un microscopio confocale TCS-NT Leica a scansione laser (Nussloch, Germania). La potenza del laser è mantenuta al 10% della potenza massima per evitare sia il foto-danneggiamento delle cellule sia il fotobleaching delle sonde fluorescenti. Le immagini sono acquisite con una risoluzione di 1024x1024 pixel e in media quattro volte per migliorare il rapporto segnale/rumore. Sono stati usati obiettivi ad immersione 100x, 1,4 NA; 63x, 1,4 NA; e 40x, 1,2 NA (Leica, Nussloch, Germania). Sia le immagini a fluorescenza sia le immagini a luce trasmessa, sono acquisite su fotomoltiplicatori separati. La sonda MT Red ROS è eccitata con un raggio laser a 543 nm, mentre la sonda MT Green è eccitata a 488 nm e l'emissione è registrata, rispettivamente, a 599 e 516 nm. La quantificazione è fatta successivamente con il software MetaMorph 5.0 (Universal Imaging, West Chester, PA) esprimendo la variazione degli mtROS come rapporto di emissioni F/ F0.
L'analisi delle immagini al microscopio confocale ha reso possibile la quantificazione della densità cellulare e della massa mitocondriale. I dati sono stati calcolati basandosi esclusivamente sulle regioni occupate dalle cellule. Le regioni contenenti cellule sono
54 caratterizzate da un'alta varianza della luminanza mentre nelle regioni di fondo la varianza locale è bassa. Queste differenze sono state prese in considerazione per calcolare la densità cellulare, usando un programma del software MatLab, che applica un'analisi della varianza locale al canale di luce trasmessa per definire la superficie cellulare e tracciarne i contorni.
Gli esperimenti di microscopia confocale e le successive quantificazioni sono state fatte sotto la supervisione della Dott.ssa L. Colombaioni, nel laboratorio di Neurofisiologia del CNR di Pisa.
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