1. INTRODUZIONE
1.2 ANALOGHI DEI NUCLEOTIDI E DEI NUCLEOSIDI
1.4.2. RUOLO DI cN-II NEL METABOLISMO DEGLI ANALOGHI DEI NUCLEOSIDI
Gli analoghi dei (deossi)nucleosidi vengono usati da decenni nella terapia anti-virale ed anti-neoplastica. Essi sono definiti antimetaboliti, in quanto esercitano una funzione citotossica mimando i nucleosidi/nucleotidi fisiologici. La citotossicità di questi analoghi contro i target cellulari dipende dalla concentrazione intracellulare del farmaco attivo. L'attivazione e l'inattivazione degli analoghi dei nucleosidi dipende dal pattern enzimatico, in particolare dalle deaminazione intracellulare e dalle chinasi e dalle fosfatasi intracellulari, così come dall'efficienza dei sistemi di trasporto. (Galmarini et al.,
2001). Conseguentemente, la resistenza cellulare a questa classe di farmaci è
comunemente attribuita all'inabilità di trasportare o fosforilare gli analoghi o ad un incremento delle attività di defosforilazione degli stessi (Galmarini et al., 2001). Le 5'- nucleotidasi citosoliche sono una famiglia di enzimi che catalizzano la defosforilazione dei nucleosidi monofosfati, regolando in questo modo, insieme alle chinasi dei nucleosidi o alle fosforibosil trasferasi, il catabolismo e il salvataggio dei composti purinici e pirimidinici (Bianchi et al., 2003). Tra le 5'-nucleotidasi cN-II ha attirato l’attenzione di numerosi gruppi di ricerca a causa della sua potenziale attività di idrolisi dei nucleosidi monofosfati e dei loro analoghi citotossici (Fig. 1.4.2.1) (Banditelli et al., 1994; Galmarini at al 2003). Studi di cinetica, effettuati usando l'enzima umano cN-II purificato o il ricombinante, hanno rivelato la funzione defosforilante di cN-II nei confronti di diversi composti quali: 5-fluoro-UMP (11% di IMP), AZTMP (6% di IMP), cladribine-
35 monofosfato (4.5 % di IMP), araGMP (3.5 % di IMP),
fudarabina-MP ( valore di Km approsimativamente di 1mM), metiltio-IMP (valore di Km 109 μM), tio-IMP (valore di Km 52 μM) e tio-GMP (valore di km 33 μM) (Mazzon et al.
2003; Jordheim et al., 2006; Brouwer et al., 2005). cN-II è stato anche proposto come
enzima responsabile della fosforilazione diretta degli analoghi dei nucleosidi antivirali, come acyclovir, 2',3'-dideossiinosina e carbovir (Turriani et al., 1994; Jhonson et al.,
1989; Keller et al., 1985; Tozzi et al., 1991). La fosforilazione catalizzata da cN-II è stata
descritta anche per svariati inibitori dell'IMP (Wu et al., 2005). L’implicazione di cN-II nei fenomeni di resistenza è stata studiata in numerosi modelli tumorali. (Tab 1.4.1.). Per questa ricerca sono stati utilizzati diversi approcci, incluso lo sviluppo di linee cellulari resistenti all'incremento delle concentrazioni dei farmaci oltre un certo tempo di esposizione. Cellule umane linfoblastoidi CCRF-CEM rese resistenti alla deossi- adenosina con questo approccio, hanno mostrato un incremento di 4 volte nell'attività della cN-II (Carson et al., 1991). In un altro studio è stata indotta resistenza alla cladribina nella linea cellulare leucemica promileocitica HL-60 (Schirmer et al 1998). Queste cellule ematiche maligne erano significativamente resistenti alla cladribina ma non cross-resistenti alla gemmcitabina o alla citarabina, e mostravano un incremento nell'attività di cN-II. Poichè cN-II è specifica per le purine mentre non lo è affatto (o comunque con una bassa attività) per pirimidine, ciò potrebbe spiegare l'assenza di cross- resistenza. Inoltre, anche in cellule umane leuchemiche K562 l'incremento dell'attività di
Fig. 1.4.2.1. Il ruolo di cN-II nel metabolismo dei nucleotidi e dei nucleosidi endogeni e degli analoghi dei nucleosidi e dei loro metaboliti fosforilati. Le frecce indicano le interazioni tra i nucleotidi e i nucleosidi endogeni e i metaboliti degli analoghi dei nucleosidi. NA: nucleoside analog; Nu: nucleoside; dCK: deoxycytine kinase; P: phosphate; cN-II: cytosolic nucleotidase II. da Jordheim et al., Current Medicinal Chemestry 2013.
36 cN-II è stato associato all'induzione di resistenza ai vari analoghi dei nucleosidi (araC, cladribina, fludarabina e gemcitabina) (Dumontet et al 1999). Le cellule CCRF-CEM, un altro modello, con resistenza indotta all'etoposide inibitore della topoisoerasi II, hanno mostrato un'inaspettata cross-resistenza alla cladribina, alla citarabina e alla gemtabicina (Lofti et al., 2001). Ciò era associato con il decremento intracellulare dell'accumlazione di cladribina trifosforilata e con l'incremento dell'attività di cN-II, mentre l'attività di dCK era incrementata solo modestamente. Un altro metodo di studio riguardo il ruolo di cN-II nella citotossicità degli analoghi dei nucleosidi, è l'inibizione attraverso RNAi; la trasfezione dello siRNA per cN-II in cellule T leucemiche umane (MOLT4) è stata associata ad un incremento della citotossicità degli analoghi dei nucleosidi (Wrabel et al.,
2006). In un altro studio il silenziamento di cN-II mediato dallo siRNA non è stato
associato ad un incremento della sensibilità alla citarabina e alla gemtabicina nel tumore al seno (cellule MDA-MB-231) o nel tumore al pancreas (cellule SU86) (Li et al., 2008). Gli stessi autori hanno in seguito proposto una debole sensibilizzazione delle cellule umane di adenocarcinoma (A549) alla gemtabicina in seguito all'inibizione della cN-II da parte dello siRNA, suggerendo, per questa attività, una specificità tissutale (Li et al.,
2012). Sono stati studiati diversi enzimi mutati, con un incremento di attività rispetto agli
enzimi wild type, in pazienti ALL trattati con 6-mercaptopurina e 6-tioguanina (Meyer et al., 2013; Tzoneva et al., 2013). Sono stati esegiti diversi studi su campioni provenienti da pazienti con tumori solidi o ematologici che confermano la rilevanza clinica dell'azione di cN-II sul metabolismo e sull'attività degli analoghi dei nucleosidi (Tab 1.4.1.). La defosforilazione della fludarabina monofosfato in cellule di pazienti-CLL è correlata con l'attività di cN-II. (Albertioni et al., 2005). Inoltre, le condizioni cliniche dei pazienti-CLL trattati con fludarabina o cladribina sono migliori nei pazienti con un alto tasso di attività chinasica (dCK) rispetto a quelli con un tasso di attività di defosforilazione della fludarabina monofosfato (cN-II), indicando che sia l'attività di dCK che l'attività di cN-II determinano accumulazione intracellulare di metaboliti fosforilati degli analoghi purinici dei nucleosidi (Albertioni et al., 2007). Ciò è stato mostrato essere valido anche per la citarabina in cellule blastiche di pazienti-AMP (Yamauchi et al.,
2009). Prendendo in considerazione sia i livelli di espressione di dCK che l'attività di cN-
II, Kawasaki e colleghi sono riusciti a separare, in una serie di 23 pazienti con CLL o con leucemia, coloro che rispondevano (alto tasso) da coloro che non rispondevano (basso tasso) ai trattamenti con cladribina. (Kawasaki et al., 1993). Frequentemente, l'alta espressione di cN-II o il basso rapporto dCK/cN-II è associato con un peggioramento
37 delle condizioni cliniche (Galmarini et al., 2001; Galmarini et al., 2002; Galmarini et al.,
2003; Galmarini et al., 2005; Seve et al., 2005; Mitra et al., 2012). I dati disponibili
riguardo l'implicazione di cN-II nel cancro sono eterogenei (Jordheim et al., 2013). Nello specifico, differenti tipi di trattamenti, patologie, materiali biologici e parametri rendono difficile trarre delle conclusioni consistenti sugli effettivi ruoli di cN-II. Serviranno comunque altri studi per considerare definitivamente cN-II un target farmacologico nel cancro.
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