5'-nucleotidasi citosolica II (cN-II) nella proliferazione cellulare

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UNIVERSITÀ DI PISA

FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea in Biologia Applicata alla Biomedicina

Curriculum Neurobiologico

Tesi di laurea magistrale

Ruolo della 5'-Nucleotidasi citosolica II (cN-II):

implicazioni nella proliferazione cellulare

Relatore: Candidato:

Prof.ssa Maria Grazia Tozzi Simone Mercorillo

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1. INTRODUZIONE ... 6

1.1 METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI E DEI NUCLEOSIDI ... 6

1.1.1. SINTESI DE NOVO DEI COMPOSTI PURINICI ... 6

1.1.2. REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI DEI NUCLEOTIDI PURINICI ... 8

1.1.4. REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI DEI NUCLEOTIDI PIRIMIDINICI ... 10

1.1.5. DEGRADAZIONE DELLE PURINE E DELLE PIRIMIDINE E PATHWAY DI RECUPERO ... 10

1.2 ANALOGHI DEI NUCLEOTIDI E DEI NUCLEOSIDI ... 12

1.3 5' NUCLEOTIDASI NEI MAMMIFERI ... 13

1.3.1. ECTO 5'-NUCLEOTIDASI (eN)... 15

1.3.1.1. Struttura proteica, regolazione ed espressione ... 15

1.3.1.2. Cinetica enzimatica della ecto-nucleotidasi ... 16

1.3.1.3. Ruoli fisiologici ... 16

1.3.2. 5'-NUCLEOTIDASI INTRACELLULARI ... 18

1.3.3. 5' NUCLEOTIDASI CITOSOLICA IA... 20

1.3.3.1. Struttura proteica ed espressione tissutale ... 20

1.3.3.2. Cinetica enzimatica e regolazione ... 20

1.3.4. 5' NUCLEOTIDASI CITOSILICA IB ... 21

1.3.5. 5'-NUCLEOTIDASI CITOSOLICA IIIA ... 21

1.3.5.1. Struttura genica, struttura proteica ed espressione tissutale ... 21

1.3.5.2. Cinetica enzimatica ... 22

1.3.6. 5'(3')-DEOSSIRIBONUCLEOTIDASI CITOSOLICA ... 23

1.3.6.1. Struttura proteica ed espressione tissutale ... 23

1.3.7. 5' (3')-DEOSSIRIBONUCLEOTIDASI MITOCONDRIALE ... 24

1.3.8. 5'-NUCLEOSIDASI CITOSOLICA II... 25

1.3.8.1. Informazioni generali, espressione tissutale e struttura proteica ... 25

1.3.8.2. Attivita' enzimatica di cN-II in vitro ... 27

1.3.8.3. Attivita' fosfotrasferasica ... 28 1.3.8.4. Meccanismo d'azione ... 28 1.3.8.5. Regolazione ... 29 1.3.8.6. Ruoli fisiologici ... 31 1.4 ASPETTI CLINICI ... 33 1.4.1. SINDROMI NEUROLOGICHE... 33

1.4.2. RUOLO DI cN-II NEL METABOLISMO DEGLI ANALOGHI DEI NUCLEOSIDI ... 34

1.5 cN-II INTERAGISCE CON IL DOMINIO RICCO DI LEUCINE DI Ipaf ... 39

1.6 cN-II E LA PROLIFERAZIONE CELLULARE ... 40

1.7 AMPK, AKT e mTOR NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE ... 41

1.7.1. AMPK ... 41

1.7.1.1. Ampk può esercitare effetti pro-tumorali o anti-tumorali in base al contesto metabolico .. 42

1.7.2. AKT ... 43

1.7.3. Il TARGET DELLA RAPAMICINA NEI MAMMIFERI (mTOR) ... 46

1.7.3.1. Il pathway segnale di mTOR ... 46

1.7.3.2. mTOR regola la massa e e le funzioni mitocondriali ... 47

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2

1.8. SCOPO DELLA TESI ... 49

2. MATERIALI E METODI ... 50

2.1. MATERIALI ... 50

2.2. METODI ... 51

2.2.1. METODI DI COLTURA CELLULARE ... 51

2.2.2. PREPARAZIONE DEGLI ESTRATTI PER L’ATTIVITA’ FOSFOTRASFERASICA ... 51

2.2.3. SAGGIO DELL'ATTIVITA' FOSFOTRASFERASICA ... 51

2.2.4. PREPARAZIONE DEGLI ESTRATTI PER L'IMMUNOBLOTTING ... 52

2.2.5. WESTERN BLOTTING ... 52

2.2.6. METODI AL CONFOCALE PER LA RILEVAZIONE DEI ROS MITOCONDRIALI, DELLA MASSA MITOCONDRIALE E DELLA SINTESI PROTEICA ... 53

3. RISULTATI ... 55

3.1. ATTIVITA' FOSFOTRASFERASICA IN wt, ps-CONT, ps-cN-II ... 55

3.2. CURVA DI CRESCITA DELLE CELLULE A549 wt, ps-CONT, ps-cN-II ... 56

3.3. FUNZIONALITÀ MITOCONDRIALE NELLE CELLULE A549 wt, ps-CONT, ps-cN-II ... 58

3.3.1. DETEMINAZIONE DEI mtROS NEI TRE TIPI CELLULARI ... 58

3.3.2. DETERMINAZIONE DELLA MASSA MITOCONDRIALE NEI TRE TIPI CELLULARI ... 60

3.3.3. POTENZIALE DELLA MEMBRANA MITOCONDRIALE NEI TRE TIPI CELLULARI ... 62

3.4. ANALISI DEL CELL-SIZE IN CELLULE A549 WT, PS-CONT E PS CN-II ... 63

3.5. WESTERN BLOTTING DI AMPK ... 67

3.6. WESTERN BLOTTING DI AKT ... 67

3.7. WESTERN BLOTTING DI mTOR ... 68

4. DISCUSSIONE ... 69

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RIASSUNTO

La 5’-nucleotidasi citosolica II (cN-II) è un enzima bifunzionale la cui attività ed espressione gioca un ruolo chiave nell'equilibrio del pool dei nucleotidi, nei pathways nucleotidi-dipendenti e nella morte cellulare programmata.

cN-II è molto conservata a livello tassonomico e ciò suggerisce un ruolo fondamentale nelle cellule eucariotiche.

Le nucleotidasi sono enzimi in grado di catalizzare l'idrolisi di un nucleotide in nucleoside e fosfato; cN-II è una 5'-nucleotidasi che ha come substrato preferibilmente IMP/GMP e i suoi deossi-derivati.

L'attività di cN-II, la sua struttura ed espressione ha attirato l'attenzione di svariati gruppi di ricerca implicati in campi quali: la biochimica, la cristallografia, la biologia molecolare, la farmacologia, l'oncologia e la genetica.

CN-II è un enzima bi-funzionale in quanto è capace di agire sia come una fosfatasi sia come una fosfotransferasi e queste attività possono contribuire al mantenimento del bilanciamento della concentrazione intracellulare delle purine.

cN-II è in grado di interagire con proteine quali Ipaf, coinvolta nei meccanismi di difesa dell'immunità innata e quindi nella sopravvivenza cellulare.

E' dimostrato inoltre, che i livelli di espressione di cN-II sono correlati con il grado di proliferazione cellulare in modelli tumorali in vitro.

Sulla base di ciò il mio studio intende evidenziare il meccanismo che lega la cN-II alla proliferazione cellulare e quindi allo sviluppo dei tumori.

Per il mio studio ho utilizzato cellule di adenocarcimoma dell'epitelio alveolare umano, una linea cellulare denominata A-549. Ho utilizzato tre tipi cellulari: wilde-type, cellule ingegnerizzate con un plasmide in cui è inserito una sequenza codificante per RNA silenziante specifico per cN-II, e cellule controllo ingegnerizzate con un plasmide esprimente contenente una sequenza codificante per RNA senza uno specifico target. I tre tipi cellulari sono stati esposti, a tempi diversi, a differenti concentrazioni di 2-deossiglucosio, una molecola che abbassa la carica energetica delle cellule e ne modifica anche il potere riducente, permettendo in questo modo di valutare la proteina di interesse in condizioni metaboliche differenti.

Un'altra parte dell'esperimento ha mirato ad evidenziare parametri quali la massa mitocondriale, la concentrazione dei ROS mitocondriali, il potenziale di membrana mitocondriale, la correlazione tra diametro cellulare e sintesi proteica, l'attività

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4 fosfotrasferasica dell'enzima e la curva di crescita dei tre tipi cellulari.

Al fine di individuare i meccansimi molecolari convolti nelle funzioni di cN-II, ho inoltre effettuato esperimenti di immunoblotting con proteine quali akt, m-tor, ampk.

I risultati ottenuti indicano che cN-II è implicata nei processi di proliferazione cellulare. Un'evidente alterazione riguarda la sintesi proteica la quale è drasticamente diminuita nelle cellule in cui cN-II è parzialmente silente. A livello della funzionalità mitocondriale è stata evidenziata una produzione di ROS lievemente maggiore nelle cellule con il gene per cN-II silenziato, mentre non vi sono alterazioni per quanto riguarda gli altri parametri analizzati. Le cellule silenziate presentano un basso livello di fosforilazione di AKT, che è in linea con la diminuita proliferazione

.

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ABBREVIAZIONI UTILIZZATE

2-DG: 2-deossiglucosio;

AIR: Amminoimidazolo ribonucleotide; AKT/PKB: Protein chinasi B;

AMPK: Protein chinasi attivata dall’AMP; APRT: Adeninafosforibosiltrasferasi;

BAD: Promotore di morte associato alle Bcl-2 Bcl-2: Linfoma 2 di cellule B

BPG: Bifosfoglicerato;

CAMKK2: Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinase 2;

FBS: Siero di bovino fetale;

GSK3: Glicogeno sintetasi chinasi3; HAD: Aloacido dealogenasi;

HDM2: Human Double minute2;

HGPRT: Ipoxantina-guanina fosforibosiltrasferasi;

HIF1α e HIF2α: Fattore

LKB1:Liver Kinase B1;

mTOR: Target della rapamicina nei mammiferi;

NBS-LRR: Nucleotide binding site and leucine-rich repeat;

PGC-1 α: Coattivatore1 del proliferatore gamma del perossisoma; PI3K: Fosfoinositolo3 chinasi;

PIC: Cocktail inibitore delle proteasi; PNP: Purinanucleoside fosforilasi; PRPP: Fosforibosilpirofosfato; SAH: S-adenosilomocisteina:

TNF-α: Fattore di necrosi tumorale α;

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1. INTRODUZIONE

1.1 METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI E DEI NUCLEOSIDI

I nucleotidi svolgono diversi ruoli nelle cellule. Essi sono i precursori del DNA e dell'RNA. Essi sono anche trasportatori essenziali di energia chimica, (ATP e GTP). I nucleotidi sono, inoltre, componenti dei cofattori NAD, FAD, S-Adenosil-Met, Coenzima A, così come di alcuni intermedi biosintetici attivati come l'UDP-Glucosio e il CDP-diacilglicerolo. Altri nucleotidi, infine, sono secondi messaggeri cellulari come il cAMP e il cGMP (Nelson et al., 2004).

Nella cellula esistono due tipi di vie che portano alla formazione dei nucleotidi: a via che prevede la sintesi de novo e la via di salvataggio (o di recupero). La sintesi de novo dei nucleotidi inizia dai loro precursori metabolici più semplici: aminoacidi, ribosio 5-P, CO2. Il pathway di recupero ricicla i prodotti del catabolismo (basi e nucleosidi) dei nucleotidi liberi o rilasciati dalla demolizione degli acidi nucleici.

Le vie di sintesi de novo dei composti purinici e pirimidinici hanno caratteristiche generali quali: le basi libere (guanina, adenina, citidina, timina e uracile) non sono intermedi di questi processi biosintetici; è probabile, specialmente nella via di sintesi de

novo delle purine, che gli enzimi coinvolti facciano parte di complessi multienzimatici; la

produzione di nucleotidi deve operare continuamente durante la sintesi degli acidi nucleici, a causa del fatto che le riserve di nucleotidi nella cellula sono estremamente ridotte (a parte l'ATP),e questo in alcuni casi può rappresentare un limite alla velocità di replicazione e trascrizione del DNA.

Le basi puriniche libere basi e nucleosidi pirimidinici, formati dalla degradazione dei nucleotidi, sono in gran parte salvate e riutilizzate per formare nuovi nucleotidi attraverso vie molto più semplici delle vie della sintesi de novo.

1.1.1. SINTESI DE NOVO DEI COMPOSTI PURINICI

Nella prima tappa dellla via (Fig. 1.1.1.1.), un gruppo amminico donato dalla Glutammina è attaccato al C-1 di PRPP. Il prodotto 5-P-ribosilammina è altamente instabile.

Nella seconda tappa vengono addizionati tre atomi dalla glicina (tappa 2). Per questa reazione di condensazione viene consumato un ATP per attivare il gruppo carbossilico

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7 della glicina (nella forma di un acil-fosfato). Il gruppo glicilamminico formatosi nella seconda tappa, viene quindi formilato dal N10-formiltetraidrofolato (tappa 3). Nella tappa

4 ancora la

glutammina fornisce un gruppo amminico in una reazione in cui viene consumato un ATP.

Il composto formatosi subisce la perdita di una molecola di H20 a cui segue la chiusura del primo anello del nucleo purinico: in questo modo si ha la formazione del 5-Amminoimidazolo Ribonucleotide (AIR) (tappa 5). Negli eucarioti superiori l'AIR viene carbossilato con un'unica reazione a carbossiamminoimida zolo ribonucleotide (tappa 6a). In seguito l'aspartato dona il proprio gruppo amminico all'anello imidazolico in due tappe (tappa 8 e 9): l'eliminazione del fumarato consente la formazione del legame ammidico nell'anello.

Nella tappa 10 l'N-formiltetraidrofolato cede l'ultimo atomo di carbonio necessario al completamento della struttura atomica dell'anello purinico, che infine subisce una seconda reazione di ciclizzazione che porta alla chiusura del secondo anello e al completamento del nucleo purinico con formazione di Inositato (tappa 11).La conversione dell'inositato in adenilato richiede l'inserimento di un gruppo amminico

Fig. 1.1.1.1 Schema della sintesi delle purine. Adattata da Nelson et al. Leningher Principi di Biochimica, W.H. Freeman and Company 2004.

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8 fornito dall'aspartato in una reazione a due tappe in cui viene utilizzato GTP come fonte del gruppo fosforico ad alta energia nella sintesi dell'adenilosu ccinato; il guanilato si forma invece per ossidazione, da parte del NAD+, dell'inositato a livello dell'atomo C-2 e dalla successiva aggiunta di un gruppo amminico donato dalla glutammina in una reazione in cui in viene utilizzato ATP come fonte di energia.

1.1.2. REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI DEI NUCLEOTIDI PURINICI

Per la regolazione della velocità complessiva della sintesi de novo dei nucleotidi purinici e della velocità di formazione dei due prodotti finali, adenilato e guanilato, esistono nelle cellule tre meccanismi di controllo retroattivi.

Il primo di questi è esercitato a livello della prima reazione della sintesi de novo purinica, il trasferimento di un gruppo amminico al PPRP per formare 5-fosforibosilammina. Questa reazione è catalizzata dall'enzima allosterico glutammina-PPRP ammidotransferasi, il quale viene inibito dai prodotti finali IMP, AMP e GMP. Il secondo meccanismo di regolazione viene esercitato dalle eccessive concentrazioni di GMP che nella cellula inibiscono la formazione di xantilato da inosinato, senza alterare la velocità di formazione dell'AMP. Viceversa, l'accumulo di adenilato porta all'inibizione della formazione di adenilosuccinato, senza modificare la biosintesi dell'GMP. L'ultimo meccanismo di controllo riguarda l'inibizione della sintesi di PPRP per regolazione allosterica della ribosio fosfato pirofosfochinasi, la quale è inibita, oltre che dai metaboliti delle altre vie in cui PRPP è il punto d'inizio, anche da ADP e GDP.

IFig 1.1.1.2. Biosintesi di GMP e AMP da IMP da Nelson et al., Principi di Biochimica di Leningher , W.H. Freeman and Company 2004.

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9 1.1.3. SINTESI DE NOVO DELLE PIRIMIDINE

A differenza della sintesi de novo delle purine, in cui l'assemblamento dell'anello purinico avviene sul PRPP, nella sintesi de novo delle pirimidine viene innanzitutto costruito l'anello pirimidinico a sei membri e solo

successivamente questo viene legato al ribosio 5-fosfato (Fig. 1.1.1.3.)

Nella prima tappa della biosintesi delle pirimidine, il carbamil fosfato prodotto negli animali dalla carbamil-fosfato sintetasiII reagisce con l'aspartato formando N-carbamilaspartato. La seconda tappa del pathway prevede la rimozione di una molecola di H2O dall'N-carbamilaspartato al fine di consentire la chiusura dell'anello pirimidinico sotto forma di L-diidroorotato. Questo composto viene ossidato nella terza tappa della biosintesi pirimidinica, producendo il derivato pirimidinico orotato in una reazione in cui l'accettore finale di elettroni è il NAD+. Negli eucarioti, i primi tre enzimi della via, la cabamil fosfato sintetasi II, l'aspartato transcarbamilasi e la diidroorotasi, fanno parte di una proteina trifunzionale nota con la sigla CAD (Grande et al., 2014).

La quarta tappa porta alla formazione dell'orotidilato a causa del legame tra l'orotato e il ribosio 5-fosfato donato dal PRPP; l'orotidilato viene quindi decarbossilato a

uridilato, il quale a sua volta viene fosforilato a UTP (tappe 5 e 6). Il CTP si forma dall'UTP ad opera della citidilato sintetasi, in una reazione che consuma un ATP e in cui il donatore dell'atomo di azoto è di solito la glutammina, anche se in molte specie la citidilato sintetasi può usare direttamente l'NH4+ (Nelson et al., 2004).

Fig. 1.1.1.3 Sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici. Da Nelson et al.,Principi di biochimica di Leningher, W.H. Freeman & Company 2004

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1.1.4. REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI DEI NUCLEOTIDI PIRIMIDINICI

La regolazione della velocità di sintesi dei nucleotidi pirimidinici avviene per inibizione retroattiva, così come accade per la biosintesi dei nucleotidi purinici. Nei batteri è dovuta alla modulazione dell'aspartato transcarbamilasi (ATCasi), che catalizza la prima reazione della via. Questo enzima è inibito dal CTP, il prodotto finale di questa sequenza di reazioni. (Gerhart et al., Biochemistry 1965).

1.1.5. DEGRADAZIONE DELLE PURINE E DELLE PIRIMIDINE E PATHWAY DI RECUPERO

I nucleotidi purinici (Fig. 1.1.1.4) vengono degradati un una sequenza di reazioni in cui essi perdono il loro fosfato attraverso l'azione di una 5'-nucleotidasi. L'adenilato viene trasformato in adenosina, la quale viene deaminata a inosina dall'adenosina deaminasi. L'inosina formatasi viene quindi scissa a ipoxantina (la sua base purinica) e in ribosio 1-fosfato da

una purina nucleoside fosforilasi.

L'ipoxantina libera viene successivamente ossidata a xantina e poi ad acido urico dalla xantina ossidasi. L'ossigeno molecolare è l'accettore di elettroni in questa reazione molto

Fig.1.1.1.4 Degradazione, interconversione e salvagataggio delle nucleo basi dei mononucleotidi purinici 1: Adenina fosforibosil trasferasi; 2: AMP deaminasi; 3: adenil-succinatoliasi; 4: adenil-succinato sintetasi; 5: IMP deidrogenasi; 6: XMP-glutaminaamidotrasferasi; 7: 5-nucleotidasi cN-I; 8: 5-nucleotidasi cN-II; 9: adenosin chinasi; 10: ipoxantina-guanina fosforibosil trasferasi; 11: purina nucleoside fosforilasi; 12: uridina chinase; 13: uridina fosforilasi; 14: foss-foribomutae; 15: PRPP sintetaso; 16: PPATT (fosforibosil pirofosfatoamidotrasferasi); 17: IMP ciclohidrolasi. Gli enzim 8, 10 e 11 sono implicati nel ciclo delle purine.

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11 complessa.

Il catabolismo del GMP produce anch'esso acido urico come prodotto finale. Il GMP è dapprima idrolizzato a guanosina, la quale viene successivamente scissa fosforoliticamente dalla purina nucleoside fosforilasi, liberando in questo modo la guanina. La guanina subisce una rimozione idrolitica del suo gruppo amminico in una reazione che produce xantina, la quale infine è convertita in acido urico dalla xantina ossidasi.

L'acido urico è il prodotto finale del catabolismo delle purine nei primati, negli uccelli e in vari altri animali. In molti mammiferi e in molti altri vertebrati, l'acido urico viene ulteriormente degradato in allantoina attraverso una reazione catalizzata dall'urato ossidasi.

La via di degradazione delle pirimidine generalmente porta alla produzione di NH4+ e quindi alla sintesi dell'urea (Fig. 1.1.1.4.). La timina, per esempio, è degradata in metilmalonilsemialdeide, un intermediatore del catabolismo della valina. Essa viene modificata in propionil-CoA e in metilmalonil-CoA e successivamente in succinil-CoA. Nelle cellule, le basi puriniche e pirimidiniche libere vengono costantemente rilasciate durante il catabolismo dei nucleotidi. Le purine libere sono in larga parte salvate e riusate per produrre nucleotidi attraverso un pathway molto più semplice rispetto a quello de

novo descritto sopra. Una delle più importanti vie di salvataggio consiste in una singola

reazione catalizzata dall'adeninafosforibosiltrasferasi (APRT), nella quale l'adenina libera reagisce con PRPP per produrre AMP. La guanina e l'ipoxantina libere vengono salvate nello stesso modo, ma da un enzima diverso, l'ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi (HGPRT).

Un simile pathway di salvataggio esiste, nei microrganismi, anche per le basi pirimidiniche, mentre le pirimidine dei mammiferi vengono salvate principalmente come nucleoside o deossi-nucleoside attraverso l'azione delle nucleoside chinasi, per esempio la deossicitina chinasi e la timidina chinasi. Anche l'uracile può essere fosforilato dall'urato fosforibosiltransferasi o salvato dall'uridina fosforilasi in presenza di alte concentrazioni di ribosio-1-fosfato.

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1.2 ANALOGHI DEI NUCLEOTIDI E DEI NUCLEOSIDI

La determinazione dei livelli di ribonucleotidi e deossibibonucleotidi è di notevole interesse in numerose

applicazioni come il metabolismo energetico, i processi biochimici o per la comprensione dei meccanismi dei composti analoghi dei nucleosidi. Gli analoghi dei nucleosidi sono composti sintetici sviluppati per mimare le

loro controparti

fisiologiche in modo da sfruttarne il metabolismo, per essere così incorporati nel DNA e nell'RNA al fine di inibire la replicazione cellulare o la replicazione virale

(Jordheim et al., 2013);

inoltre, gli analoghi dei nucleotidi e dei nucleosidi possono provocare inibizione di enzimi essenziali delle cellule, quali: DNA o RNA polimerasi, chinasi DNA/RNA dipendente, purine e pirimidine fosforilasi e timidilato chinasi (Jordheim et al., 2013). Gli analoghi dei nucleosidi sono molto usati dai biologi molecolari e cellulari, ma essi sono soprattutto utilizzati per i trattamenti di varie malattie e come prodotti antivirali o farmaci antitumorali. Il metabolismo dei nucleotidi è uno dei bersagli cellulari dei trattamenti antitumorali. Gli analoghi dei nucleosidi (cytarabina, gemcitabina,flidarabina, cladribina e clofarabina) sono strutturalmente correlati ai composti endogeni implicati nel pathway metabolico dei nucleotidi. Il loro metabolismo e il loro meccanismo di azione si basano sull'interazione con trasportatori di membrana, chinasi e altri enzimi intracellulari che solitamente trasportano, fosforilano e trasformano i nucleosidi e i nucleotidi

Fig. 1.2.1 Struttura generale e modificazioni chimiche degli analoghi dei nuclesidi e dei nucleotidi. Questi composti consistono di una nucleo-base (un derivato purinico o pirimidinico) legato ad uno zucchero, e gli analoghi dei nucleotidi hanno un gruppo fosfato (P) legato allo zucchero. La diversità chimica di questi composti è basata su modificazioni come l'alogenazione, l'azotazione, la protezione da gruppi polari e altre modificazioni mostrate in questa figura. N, azoto; O, ossigeno. Da Jordheim et al., Nature Rewiews Drug Discovery 2013

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13 endogeni/fisiologici (Fig. 1.2.1.) (S. Cohen et al., 2010). Gli analoghi dei nucleosidi entrano nelle cellule per mezzo di specifici trasportatori e sono attivati dalla fosforilazione effettuata dalle chinasi intracellulari (S. Cohen et al., 2010). Il principale effetto citotossico è ottenuto in seguito alla formazione di trifosfati derivati (Fig. 1.2.2.) e alla loro incorporazione nel DNA, causando in questo modo la produzione di acidi nucleici non naturali, l'accumulo di mutazioni nella progenie virale (nel caso dei trattamenti antivirali), ma anche terminazione dell'allungamento delle catene, arresto del ciclo cellulare e quindi morte cellulare (Jordheim et al., 2013). Per quanto riguarda la 5' nucleotidasi oggetto di studio di questa tesi (cN-II), sono stati eseguiti vari studi su campioni di pazienti con neoplasie ematologiche o con tumori solidi, i quali confermano la rilevanza clinica di cN-II sul metabolismo e l'attività degli analoghi dei nucleosidi. Anche non tutto è noto riguardo al metabolismo dei nucleotidi e l'attività degli analoghi dei nucleosidi , è ben dimostrato che cN-II può essere implicata nella fosforilazione di alcuni di essi, ed è stata indicata anche bersaglio farmacologico in oncologia (Jordeim and Chaloin, 2013).

1.3 5' NUCLEOTIDASI NEI MAMMIFERI

Le nucleoside monofosfato fosfo-idrolasi, o 5'-nucleotidasi, catalizzano la reazione di idrolisi del fosfato in posizione 5' del carbonio del ribosio o del deossiribosio dei nucleotidi non ciclici (Zimmermann, 1992; Bianchi et al., 2003).

Fig. 1.2.2 Meccanismo di azione di un analogo dei nucleosidi. Da Jordheim et al., Nature Reviews Discovery 2013

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14 Ad oggi sono conosciute otto 5'nucleotidasi nell'essere umano di cui: una extracellulare (eN/CD73), una mitocondriale (mdN) e sei citoplasmatiche (IA, IB, II, cN-IIIA, cN-IIIB e cdN) (Bianchi et al 2003). cN-IIIB è stata solo recentemente descritta e dimostra di possedere un'attività enzimatica rivolta sia verso CMP che verso 7-metil-GMP, (Bushmann et al., 2013).

Mentre le nucleotidasi intracellulari catalizzano lo step finale nella defosforilazione dei nucleotidi, inducendo l'esportazione dei nucleosidi dalla cellula, la 5'-nucleotidasi extracellulare, partecipa alla regolazione dei nucleotidi extracellulari (Hunsucker et al.,

2005) . Alcuni di questi enzimi limitano la loro presenza solo ad alcuni tessuti, mentre

altri sono ubiquitari; Le 5' nucleotidasi sono caratterizzate da differente localizzazione subcellulare e specifica espressione tissutale (Hunsucker et al., 2005). Si pensa che il

Tab. 1.3.1. Classificazione delle 5'-nucleotidasi. Adattata da Bianchi et al., Journal of Biological Chemestry 2003

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15 meccanismo catalitico di molte nucleotidasi coinvolga la formazione di un fosfoenzima intermedio. Mentre le 5'-nucleotidasi intracellulari possono condividere tra di loro un simile meccanismo catalititco, la ecto-5'-nucleotidasi batterica possiede una struttura piuttosto diversa del sito catalitico; si pensa che l'ecto-enzima umano possa essere simile a quello batterico (Hunsucker et al., 2005).

1.3.1. ECTO 5'-NUCLEOTIDASI (eN)

1.3.1.1. Struttura proteica, regolazione ed espressione

Il gene della ecto-5'-nucleotidasi è localizzato sul cromosoma 6q14-q21 (Boyle et al., 1989). Il gene codifica per una proteina con 574 aminoacidi (Misumi et al., 1990a). I residui del core catalitico di ecto-5'-nucleotidasi identificati attraverso cristallizzazione in E. coli, sono largamente conservati in tutte le specie (Knofel & Strater, 1999). La proteina attiva è un dimero composto da subunità di 71 kDa legate alla membrana extracellulare tramite un'ancora di glicosil fosfatidilinositolo (GPI) (Misumi et al., 1990).

La ecto-5'-nucleotidasi è un enzima ubiquitario, ma in molti casi all'interno dei tessuti esso è specificatamente localizzato esclusivamente in alcuni tipi cellulari (Resta et al., 1993). Per esempio, ecto-5'-nucleotidasi nel timo è principalmente localizzata sulle cellule epiteliali e i fibroblasti reticolari (Resta et al., 1998), mentre l'espressione di ecto-5'-nucleotidasi nei linfociti B e T è correlata con la maturazione cellulare (Thompson & Ruedi, 1988; Thomson et al., 1990). La specificità cellulare dell'ecto-nucleotidasi dipende da una complessa serie di segnali regolatori positivi e negativi che agiscono a livello dei siti di legame dei fattori di trascrizione per la regione promotore.

L'ischemia e l'ipossia sono i maggiori induttori dell'espressione dell'ecto-nucleotidasi (Kitakaze et al., 1996a; Braun et al., 1997; Ledoux et al., 2003). L'incremento dell'espressione della ecto-nucleotidasi durante un'ischemia cardiaca è mediata dall'adenosina, dai recettori A1 adrenergici e dalla cascata del segnale a valle della proteina chinasi C (Kitakaze et al., 1996c). Inoltre, sono state identificate alcune citochine che regolano l'espressione del'ecto-nucleotidasi in modo simile tra i vari tipi cellulari (entrambe le IL-1 β, IL-4, TNF α). In alcuni casi, l'espressione dell'ecto-nucleotidasi è regolata da meccanismi non trascrizionali. Nei linfociti umani, il cross-linking di CD38 induce up-regolazione dell'ecto-nucleotidasi sulla superficie cellulare senza che sia aumentata la trascrizione (Peola et al., 1996). In cellule endoteliali umane, l'ecto-nucleotidasi può essere down-regolata in risposta al signaling di TNF α a causa

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16 della separazione dall'ancora di GPI per azione della fosfolipasi C (Kalsi et al., 2002).

1.3.1.2. Cinetica enzimatica della ecto-nucleotidasi

L' ecto-nucleotidasi ha un'ampia specificità di substrato sia per i ribonucleosidi che per i deossi-ribonucleosidi monofosfati. Essa è chiamata anche nucleotidasi a bassa Km, a causa della sua alta affinità per l'AMP , con una Km da 3 a 19 μM, dipendente dal tessuto in cui si trova l'enzima (Burger & Lowenstein, 1975; Naito & Lowenstein, 1981; Camici et al., 1985; Spychala et al., 1989). Dal rapporto Vmax/Km si deduce che l'AMP è il substrato più efficiente e che i ribonucleotidi sono substrati migliori rispetto ai deossi-ribonucleotidi (Naito & Lowenstein, 1981). Anche GMP (Km 6.4 a 59 μM), IMP (Km 8.0 a 100 μM) UMP (Km 14 a 110 μM) sono buoni substrati per l'ecto-nucleotidasi purificata da cuore, rene e nel muscolo scheletrico, mentre l'enzima ha minor affinità per CMP (Km 35 a 360 μM) e dTMP (Km 14 a 36.2 μM), e una bassissima affinità per dAMP (Km 50 a 77 μM), dGMP (Km 48 μM) e dCMP (Km 290 μM; Naito & Lowenstein, 1981; Camici et al., 1985; Le Hir et al., 1989).

Sebbene i cationi non siano necessari per l'attività enzimatica, sia Mg2+ che Mn2+ incrementano l'attività enzimatica (Meflah et al., 1984). L'ecto-nucleotidasi è inibita da h-methylene adenosine-5V-diphosphate (AMPCP; Ki 5 a 19 nM), ADP (Ki 32 nM 17 μM), ATP (Ki 0.28 a 15 microM) and concanavalin A (Ki 76 nM; Naito & Lowenstein, 1981; Naito & Lowenstein, 1985; Meflah et al., 1984; Camici et al., 1985; Dieckhoff et al., 1985; Le Hir et al., 1989).

1.3.1.3. Ruoli fisiologici

Sono stati proposti molti ruoli per l'ecto-nucleotidasi (Fig. 1.3.1.1), tra cui: generazione locale di adenosina e attivazione dei recettori per l'adenosina, recupero dei nucleotidi extracellulari, adesione mediata cellula-cellula e possibile azione come co-recettore per l'attivazione dei linfociti T.

Ci sono prove convincenti che l'espressione dell'enzima e la sua attività sia funzionalmente associata con l'attivazione del recettore dell'adenosina (Lennon et al., 1998; Eltzschig et al., 2003; Nemoto et al., 2004). I nucleotidi adeninici sono attivamente e passivamente rilasciati dalle cellule e sottoposti al metabolismo extracellulare che include una cascata di ecto-nucleotidasi, così come le vie biosentetiche extracellulari mediate dall'adenilato chinasi e dalla nucleoside difosfato chinasi (Yegutkin et al., 2001). Il bilancio netto di queste vie potrebbe influire sulla concentrazione dell'ATP e sul

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17 segnale dell'adenosina attraverso i loro rispettivi recettori. In assenza dell'espressione dell'ecto-nucleotidasi, l'AMP generato localmente a livello extracellulare può essere riconvertito in ADP e ATP, attivando in questo modo i recettori purinergici P2. Al contrario la sovra-espressione dell'enzima porterebbe ad esaurimento dei nucleotidi extracellulari, generazione locale di adenosina e l'attivazione dei recettori purinergici P1. In questo modo, l'espressione e l'attività dell'ecto-nucleotidasi potrebbe provvedere alla regolazione dello switch tra il segnale di P1 e il segnale di P2 (Yegutkin et al., 2002). L'adenosina prodotta dall'ecto-nucletotidasi agisce localmente su proteine G accoppiate con recettori A1, A2A, A2B e A3 dell'adenosina i quali mediano risposte come per esempio il condizionamento pre-ischemico nel cuore o vasodilatazione, angiogenesi, neurotrasmissione e inibizione delle risposte immunitarie (MacKenzie et al., 1994; Resta et al., 1998; Kitakaze et al., 1999; Headrick et al., 2003). L'attivazione di proteine G accoppiate ai recettori dell'adenosina può avere funzione cardio-protettiva nei confronti di condizione di stress metabolico nel cuore. Durante l'ischemia, l'ipossia e altri incrementi del carico di lavoro, l'ATP viene catabolizzato più rapidamente di quanto non venga prodotto, provocando un aumento di ADP, AMP e adenosina (Jennings & Steenbergen, 1985).

L'adenosina è considerata un metabolita cardio-protettivo perchè essa agisce portando i livelli di ATP ad una concentrazione normale, ripristinando il bilanciamento energetico e, favorendo attraverso processi di vasodilatazione, l’aumento di ossigeno e nutrienti nel cuore (Newby, 1984). L'adenosina può essere formata a livello extracellulare dall'ecto-nucleotidasi oppure a livello intra-cellulare da cN-IA o dall'S-adenosilomocisteina idrolasi (SAH). L'attività di eN svolge un ruolo importante anche nel recupero dei

Fig. 1.3.1.1 L'ecto-5'-nucleotidasi (eN) defosforila un vasto range di ribo- e deossiribonucleotidi extracellulari che possono in seguito essere recuperate e riutilizzate nella cellula. L'adenosina extracellulare prodotta dall'eN può anche attivare i recettori dell'adenosina che segnalano attraverso il cAMP e la fosfolipasi C.

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18 nucleotidi in quanto rilascia nucleosidi e deossinucleosidi, che possono rientrare nella cellula ed essere rifosforilati (Fleit et al., 1975; Resta et al., 1998). eN svolge anche un ruolo nell'adesione cellulare e può agire come co-recettore per l'attivazione delle cellule T sotto certe condizioni. Queste funzioni non coinvolgono l'attività enzimatica e il loro meccanismo è poco chiaro; eN ha proprietà adesive ed è coinvolta nell'adesione dei linfociti alle cellule vascolari endoteliali, un' importante tappa della migrazione dei linfociti attraverso le pareti dei vasi sanguigni verso i siti dell'infiammazione (Airas et al., 1995, 2000).

1.3.2. 5'-NUCLEOTIDASI INTRACELLULARI

Le sette 5'-nucleotidasi intracellulari appartengono alla superfamiglia delle aloacido dealogenasi (HAD), le quali furono per la prima volta descritte nel 1994 da Koonin and Tatusov e chiamate così in seguito ala caratterizzazione strutturale del primo membro, la 2-aloacido dealogenasi (koonin et al. Journal of Biology 1994; Koonin et al., Protein

Science 1994). La superfamiglia HAD è composta da più di 3000 membri ed è

rappresentata nei proteomi degli organismi di tutti i tre regni della vita. I membri di cui sono conosciute le funzioni vengono suddivisi in queste cinque subfamiglie:

1. Aloalcanoato deaologenasi (idrolisi del legame C-Cl); 2. Fosfoacetaldeide idrolasi ( idrolisi del legame P-C); 3. Fosfato monoesterasi ( idrolisi del legame P-OC); 4. ATPasi ( idrolisi del legame POP);

5. Fosfomutasi ( scissione legame P-OC tramite trasferimento intramolecolare di gruppo fosforico).

Il core del meccanismo catalitico di questa superfamiglia è il “gruppo trasfer”, mediato da un Asp nucleofilo: usando questa strategia catalitica, viene formato un legame covalente attraverso il nucleofilo con formazione di un intermedio fosfoenzimatico. (Liu et al., 1995; Liu et al., 1998; Lahiri et al., 2004; Allen et al., 2004; Burroughs et al., 2006). Sebbene l'omologia di sequenza di questi enzimi sia minore del 10%, essi contengono un domino α/β nel core catalitico altamente conservato (α/β Rossman-like core domain), in cui il sito attivo è formato da quattro loops conservati che caratterizzano il core chimico dell'enzima. Questa comune caratteristica strutturale è il dominio HAD. (Fig 1.3.3.1.)

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19 protezione dell'attacco nucleofilo (Ridder et al., 1998; Morais et al., 2000; Burrougs et al., 2006). La presenza dello ione bivalente Mg2+ è un requisito catalitico essenziale per la superfamiglia HAD (Alle et al., 2004; Burrougs et al., 2006). La sostituzione di entrambi i residui di Aspartato di questo motivo con altri residui non conservati causa, in ultima analisi, l'inattivazione dell'enzima (Collet et al., 1998). Il Motivo II è caratterizzato da una Serina o da una Treonina terminali altamente conservate, mentre il Motivo III esprime una Lisina altamente conservata: questi due Motivi contribuiscono alla stabilità degli intermedi della reazione di idrolisi. Il Motivo IV stabilizza il Mg2+ nel sito attivo dell'enzima, insieme al Motivo I (Burrougs et al., 2006).

Fig 1.3.2.1. Allineamento multiplo delle 5'-nucleotidasi dei mammiferi e dei membri delle ATPasi appartanenti alla superfamiglia delle HAD.

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1.3.3. 5' NUCLEOTIDASI CITOSOLICA IA

1.3.3.1. Struttura proteica ed espressione tissutale

cN-IA fu in primo luogo descritta come un enzima specifico per l'AMP. Il gene di cN-IA è localizzato sul cromosaoma 1p34.3-p33 (Hunsucker et al., 2001). Nei tessuti umani l'mRNA di cN-IA è altamente espresso nel muscolo scheletrico ed è presente anche nel cuore, nel cervello, nel pancreas, nei testicoli e nell'utero (Hunsucker et al., 2001). Svariati studi supportano l'associazione di cN-IA con gli elementi contrattili del muscolo cardiaco. La dimensione della subunità catalitica purificata di cN-IA nel cuore umano è di 41 kDa.

1.3.3.2. Cinetica enzimatica e regolazione

Sebbene cN-IA possa usare un ampio range di nucleotidi e deossinucleotidi come substrati. L'enzima mostra preferenza per l'AMP e per i deossi-ribonucleotidi pirimidinici (Garvey et al., 1998; Hunsucker et al., 2001). La Km per AMP è di 1.46 mM stabilita tramite purificazione parziale dell'enzima dal cuore umano (Skladanowski et al., 1996) e 1.96 mM per il ricombinante dell'enzima cardiaco umano (Hunsucker et al., 2001). Anche se il valore di Km per l'IMP (da 0.8 a 8.3 mM) si trova nello stesso range, la Vmax con questo substrato è bassa e ciò rende la reazione molto meno efficiente (Truong et al., 1988; Skladanowski & Newby, 1990; Skladanowski et al., 1995; Garvey et al., 1998; Hunsucker et al., 2001). Risultati simili sono stati ottenuti con l'enzima ricombinante umano, il quale è attivo su CMP (Km 61 μM) e dTMP (km 20 μM) ma con bassa Vmax (Hunsucker et al., 2001). Diversamente dalle altre nucleotidasi, cN-Ia non catalizza una reazione fosfotrasferasica (Garvey et al., 1998; Skladanowski et al., 1998). cN-IA è attivata dall'ADP è in minor misura, dal GTP (Skladanowski & Newby, 1990; Hunsucker et al., 2001). cN-IA è anche attivata dai dNDPs. CN-IA è Mg2+ dipendente, con un massimo di attivazione da 3.5 a 10 mM, variabile tra le specie (Skladanowski & Newby, 1990; Darvish & Metting, 1993; Skladanowski et al., 1996). Anche Mn2+ e Co2+ attivano l'enzima, ma in minnor misura rispetto al Mg2+ (Yamazaki et al., 1991; Darvish & Metting, 1993). Il pH ottimale di cN-IA nel cuore umano è di 7.0.

cN-IA è responsabile della formazione intracellulare di adenosina in condizioni di ischemia ed ipossia. Uno studio effettuato sul ventricolo sinistro umano suggerisce che

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21 l'attività dell'enzima sia sufficientemente alta da produrre il livello di adenosina prodotta durante l'ischemia (Skladanowski et al., 1996). In condizioni normossiche, l'adenosina prodotta dalla cN-II viene rifosforilata dall'adenosina chinasi(Decking et al., 1997; Peart et al., 2001). L'incremento della produzione di adenosina è il risultato dell'inibizione dell'attività dell'adenosina chinasi (Decking et al., 1997) e ad un incremento del'attività di cN-IA dovuto all'aumento della concentrazione di substrati (AMP) e di attivatori (ADP) (Yamazaki et al., 1991). Sebbene cN-IA sia stata molto studiata per il suo ruolo nella formazione intracellulare di adenosina nel cuore, il basso valore di Km per i deossi-ribonucleotidi monofosfato suggerisce che l'enzima può anche essere importante nella regolazione dei pools dei deossinucleotidi pirimidinici nei tessuti nei quali è espressa.

1.3.4. 5' NUCLEOTIDASI CITOSILICA IB

cN-IB è stata identificata a causa della stretta relazione della sua sequenza genica con quella di cN-IA. Il gene si trova sul cromosoma 2p24.3. La sovra-espressione dell'enzima nel tipo celllulare COS-7 mostra che l'enzima idrolizza l'AMP ed è attivato dall'ADP (Sala-Newby & Newby, 2001). Sebbene la completa specificità di substrato dell'enzima sia sconosciuta, a causa dei limitati dati a disposizione, cN-IB appare molto simile a cN-IA. CN-IB è ubiquitinariamente espressa nell'essere umano, come determinato attraverso l'analisi RT-PCR, con un'elevata espressione dell'mRNA della proteina nei testicoli e nell'utero e una bassa espressione nel cervello e nel muscolo scheletrico (Sala-Newby & Newby, 2001). Ad oggi non è ancora chiaro se cN-IB funzioni come un tetramero, come cn-IA e cN-II, o esistono come monomero o dimero, come le altre nucleotidasi intracellulari.

1.3.5. 5'-NUCLEOTIDASI CITOSOLICA IIIA

1.3.5.1. Struttura genica, struttura proteica ed espressione tissutale

Il gene di cN-IIIA è localizzato sul cromosoma 7p14.3 e contiene 11 esoni (Marinaki et al., 2001; Kanno et al., 2004). Sono stati identificati 2 pseudogeni, uno codificante la sequenza intera del gene senza introni sul cromosoma 4 e l'altro rappresentato da una corta sequenza corrispondente all'esone 1 del gene di cN-III sul cromosoma 7 (Marinaki

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22 et al., 2001). Il gene di cN-III produce tre trascritti mRNA alternativi. Il trascritto più lungo contiene tutti gli 11 esoni, incluso l'esone R recentemente identificato, tra l'esone 2 e il 3 ed è formato da 285 a.a.. Il trascritto più corto è privo degli esoni 2 e R e produce 286 a.a. Un terzo trascritto è privo dell'esone R ed è formato da 297 a.a. (Marinaki et al., 2001). Sebbene cN-III sia stata ben studiata negli eritrociti ed sia spesso presentata come un enzima specifico per queste cellule, esso è presente anche in altri tessuti.

1.3.5.2. Cinetica enzimatica

cN-IIIA idrolizza unicamente le pirimidine monofosfato e non ha attività per i substrati purinici (Amici & Magni 2002). Il range di Km va dal micromolare al millimolare: CMP (10–150 μM), UMP (330 μM), dUMP (400 μM), dCMP (580 microM) e dTMP (1.0 mM; Paglia & Valentine, 1975; Amici & Magni, 2002). Il rapporto Vmax/Km ratio mostra che CMP è il substrato più efficiente per cN-IIIA, seguito dall'UMP (Amici & Magni, 2002). cN-III possiede anche un'attività fosfotrasferasica. Tutte le pirimidine possono servire come donatrici di fosfato, mentre l'uridina e la citidina sembrano essere i migliori accettori del fosfato (Amici et al., 1997). Il ruolo dell'attività fosfotrasferasica in vivo non è conosciuto. Come le altre nucleotidasi citosoliche, cN-IIIA è dipendente dal Mg2+. Mentre i nucleosidi e il fosfato inibiscono l'attività di cN-IIIA, ADP, ATP o 2,3 BPG non hanno effetto sull'enzima (Amici & Magni, 2002). cN-IIIA ha un pH ottimale di 7.5 (Amici & Magni, 2002).

cN-IIIA è un regolatore positivo del catabolismo dell'uridina e della citidina prodotte dalla degradazione dell'RNA (Valentine et al., 1974; Dragon et al., 1998; Rees et al., 2003). Poiché gli eritrociti maturi hanno perso la capacità di sintetizzare nucleosidi, è importante che i pools dei nucleotidi adeninici non venga esaurito durante la degradazione dell'RNA. La restrizione dell'attività di cN-IIIA alle pirimidine garantisce che le purine non vengano perse (Paglia & Valentine, 1975). Inoltre, pazienti con una mutazione omozigote per cN-IIIA sviluppano una anemia emolitica, una condizione caratterizzata da emolisi, punteggiature basofile negli eritrociti e una massiccia accumulazione di citidina e uridina fosfato che interferisce con la glicolisi negli eritrociti, principale fonte di sostentamento energetico di queste cellule nello stadio maturo (Valentine et al., 1974; Paglia & Valentine, 1975); ciò dimostra il ruolo critico svolto da questo proteina negli eritrociti.

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1.3.6. 5'(3')-DEOSSIRIBONUCLEOTIDASI CITOSOLICA

Il gene di cdN è localizzato sul cromosoma 1q25.321-23 (Rampazzo et al., 2002a) ed è composto da 5 esoni e 4 introni (Rampazzo et al., 2000a). L'enzima attivo è un dimero di 23.4 kDa per subunità ed è espresso in modo ubiquitario nei tessuti umani, con un elevato livello di mRNA nel pancreas, nel muscolo scheletrico e nel cuore (Hoglund & Reichard, 1990; Rampazzo et al., 2000a).

cdN ha una preferenza per i nucleosidi monofosfato contenenti le basi pirimidiniche uracile o timina. Quando si compara il rapporto Vmax/Km, i substrati preferiti di cdN purificata dalla placenta umana e dagli eritrociti umani sono 3'-dUMP, 3'-dTMP, 3'-UMP e 2'-UMP (Hoglund & Reichard, 1990; Amici & Magni, 2002). L'attività di cdN è regolata dai nucleosidi e dai nuceotidi, da dINO, dUrd e dal Pi i quali inibiscono l'attività dell'enzima con dUMP come substrato, mentre i dNTP a bassa concentrazione e l'ATP non hanno effetto sull'attività della proteina (Hoglund & Reichard, 1990).

cdN sembra che formi cicli del substrato con le nucleoside chinasi per la regolazione dei livelli dei deossinucleotidi nelle cellule (Fig 1.3.3.1.).

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1.3.7. 5' (3')-DEOSSIRIBONUCLEOTIDASI MITOCONDRIALE

Il gene di mdN, localizzato sul cromosoma 17p11.2, ha 5 esoni e 4 introni, con la stessa struttura stessi limiti esoni/introni di cdN (Rampazzo et al., 2000). Escludendo la sequenza leader mitocondriale di mdN, che viene perso dall'enzima durante il trasferimento nella matrice mitocondriale, le sequenze delle due proteine hanno un'omologia del 52%. mdN umana èha un peso di 26kDa prima che sia processata per l'importazione nella matrice mitocondriale, dopo ciò ha un peso molecolare di 23 kDa. L'enzima funziona come un dimero (Rampazzo et al., 2000; Rinaldo-Matthis et al., 2002). Nei tessuti umani mdN è altamente espressa nel cuore, nel cervello e nel muscolo scheletrico, e in maniera minore nel pancreas (Rampazzo et al., 2000a).

I ricombinanti umani di mdN preferiscono come substrati 5'-dUMP, 5'(5')- e 3'dTMP e 5'-, 3'- e 2'-UMP. L'enzima mostra un'attività estremamente bassa per le purine monofosfato e nessuna attività per la citidina monofosfato (Rampazzo et al., 2000). Usando i ricombinanti umani di mdN, i valori della Km sono di 100 μM per il dUMP e 200 μM per dTMP (Mazzon et al., 2003). mdN richiede Mg2+ per la catalisi, ha un pH ottimale che varia da 5.0 a 5.5 e non subisce effetti dall'ATP (Rampazzo et al., 2000). Sono stati sviluppati due inibitori di mdN: PmcP-U, un inibitore competitivo con una Ki di 40 μM, e (S)-1-[2'deossi-3',5'-o-(1-osfono)benziliden-h-d-treo-pentofuranosil]- timina (DPB-T), un inibitore misto son una Ki di 70 μM (Mazzon et al., 2003). PmcP-U inibisce anche cdN, mentre DPB-T non ha lo stesso effetto. La risoluzione della struttura cristallina di mdN complessata con uno tra PMcP-U o DPB-T dimostra che i due inibitori sono coordinati nel sito attivo da due diversi a.a. (Rinaldo-Matthis et al., 2004).

La specificità di substrato di mdN suggerisce che essa protegge i mitocondri dagli eccessivi livelli di dTTP, i quali possono manifestare azione mutagena durante la replicazione del mtDNA (Rampazzo et al., 2000). Gli squilibri nel pool del dTTP possono avere conseguenze devastanti: un incremento dei livelli di dTTP causato da deficienze di timidina fosforilasi e un decremento dei dTTP causato da mutazioni nel gene della timidina chinasi possono entrambi provocare delezioni nel mtDNA e gravi sintomi

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25 muscolari e neurologici (Nishino et al., 1999; Saada et al., 2001).

1.3.8. 5'-NUCLEOSIDASI CITOSOLICA II

1.3.8.1. Informazioni generali, espressione tissutale e struttura proteica cN-II ( 5'-nucleotidasi II o 5'-nucleotidasi ad alta Km) è la nucleotidasi citosolica maggiormente conservata durante l'evoluzione e quella con i più alti livelli di regolazione (Tozzi et al., 2013). cN-II è una proteina con subunità di circa 65 kDa attiva sotto forma di tetramero. Dopo una prima identificazione in altri vertebrati, cN-II è stata purificata anche da tessuti umani come la placenta e da cellule tumorali come i linfociti. L'mRNA di cN-II è espresso in modo ubiquitario nei tessuti umani (Allegrini et al., 1997; Rampazzo et al., 1999). Il gene di cN-II è localizzato sul cromosoma 10q24.32 (Galmarini et al., 2003a). cN-II umana è stata clonata (Oka et al., 1994) e il suo cDNA codifica per una proteina di 561 a.a.. L'enzima ha mostrato un'enorme conservazione della struttura primaria, con almeno il 98% di omologia con la cN-II degli altri mammiferi , il 66% di omologia con la cN-II di Drosophila e il 51% con l'enzima di Caenorhabditis elegans (Fig 1.3.1.2.).

Fig. 1.3.1.2. Percentuale di omologia della proteina ottenuta da UniProt Web Site (http://www.uniprot.org). Da Civilini et al., Plos One 2015

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26 La struttura tetremerica consiste di due dimeri identici: l'interfaccia A contiene 53 aminoacidi, ed è quella che mantiene le due subunità del dimero; 19 aminoacidi formano legami a idrogeno e 4 (Asp 363-Asp 145 e Arg 442-Glu 487) formano ponti ionici con i corrispettivi aminoacidi della subunità adiacente. L'interfaccia B tiene insieme i due dimeri: contiene 28 aminoacidi, di cui 8 formano legami a idrogeno; non sono presenti poniti salini. La cN-II ha un dominio alfa/beta simile al “core domain” α/β-Rossmann-like identificato anche in mdN, cN-III e in altre proteine della Superfamiglia HAD, contenente una porzione β-sheet centrale di 8 elementi antiparalleli, circondata da 8 α-eliche: qui si trova il sito di legame del fosfato del substrato. Il “core domain” della cN-II contiene 5 α-eliche addizionali, rispetto a mdN e cN-III, e alcune strutture a loop coinvolte nelle interazioni tra le subunità o in legami con gli effettori. E' presente anche un dominio più piccolo al di sopra del “core domain” che contiene 4 α-eliche, corrispondente al “cap domain” che ha la funzione di legare la base del nucleotide che funge da substrato. Il sito attivo è collocato tra il “core domain” e il “cap domain”: il “core domain” contiene i motivi I, II, III, strettamente conservati, che formano la macchina catalitica delle 5'-nucleotidasi citosoliche e nella maggior parte degli enzimi appartenenti alla Superfamiglia HAD. In particolare, nella cN-II i motivi sono così costituiti:

Motivo I: DMDYTL 57 Motivo II: 249 TNS 251

Motivo III: 292 K(X) 58DHIFGD 356

L'enzima agisce tramite la formazione di un intermedio fosforilato: il residuo che fa l'attacco nucleofilo sul fosfato del substrato è l'Asp52 (Allegrini et al., 2001), mentre l'Asp54 svolge il ruolo sia di acido generale, promuovendo la protonazione del nucleoside uscente, sia di base generale, come attivatore di una molecola d'acqua nucleofila (Rinaldo-Matthis et al., 2002). Mutazioni di questi due residui, sia conservative che non, eliminano completamente l'attività dell'enzima. Sempre nel Motivo I, le mutazioni della Met53 in Asp o in Ile causano un forte decremento dell'efficienza enzimatica nel primo caso, e un effetto sia sull'attività che sull'affinità per l'IMP nel secondo (Allegrini et al., 2001). La Thr56 sembra determinante per l'attività fosfotrasferasica, in quanto anche la cN-III, che è l'unica altra nucleotidasi che possiede questa attività, ha una treonina in posizione 56, mentre quelle che possiedono una Val, non hanno questa attività (Walden et al., 2007); la sua mutazione in Arg (non conservativa) annulla completamente l'attività dell'enzima (Allegrini et al., 2004). Nel

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27 Motivo II, la Thr249 sembra favorire il giusto posizionamento del substrato e la stabilizzazione dell'intermedio fosforilato: infatti una sua mutazione a Val causa una forte riduzione dell'attività e un'alterazione della Km sia per l'IMP che per il GMP (Ipata & Tozzi; 2006). Nel Motvo III, la Lys292 sembra che svolga la funzione di posizionare l'Asp52 e di coordinare il giusto posizionamento dei gruppi anionici del substrato, mentre gli Asp351 e 356 hanno il compito di coordinare lo ione Mg2+, necessario per l'attività dell'enzima (Rinaldo-Matthis et al., 2002). Le mutazioni in questo motivo di Lys292 o Met riducono fortemente l'attività, mentre la mutazione Asp356Asn (non conservativa) fa aumentare di 10 volte la Km per l'IMP. (Allegrini et al., 2004). Un altro motivo conservato tra le nucleotidasi citosoliche è il motivo S, che è coinvolto nel riconoscimento del substrato:

Motivo S: (P(X)7-8[R/K]XGF[W/L]); Wallen et al. hanno identificato i residui coinvolti in questo processo sovrapponendo la struttura della cN-II con quella della mdN complessata con il dGMP. E' stato visto che nel “cap domain”, le α-eliche α6 e α-7 che partecipano al legame con il substrato, si sovrappongono in cN-II e in mdN, anche se i residui aminoacidici che interagiscono non sono conservati. La specificità per i nucleotidi 6-idrossipurinici potrebbe dipendere dai residui Arg202 e Asn158, che sono quelli che interagiscono con il gruppo 6-carbossilico, e che impediscono il legame, ad esempio, con l'AMP/dAMP.

Per quanto riguardi i siti regolatori, sono stati caratterizzati 2 probabili siti effettori, entrambi nel “core domain”: i siti effettori 1 e 2. Il primo si colloca nell'interfaccia A, di fronte al sito corrispondente della subunità con cui si forma il dimero. I residui Arg456 e Arg144 interagiscono con uno ione solfato nella struttura cristallizzata e si trovano vicino al 5'-OH del ribosio, a suggerire che possano contribuire al sito di legame del fosfato dell'effettore. Questi residui, insieme ai residui Lys362 e Tyr457 di entrambe le subunità, formano una larga tasca in cui i fosfati dell'effettore si potrebbero posizionare a formare un ponte che mantiene l'associazione delle subunità del dimero.

1.3.8.2. Attivita' enzimatica di cN-II in vitro

cN-II è un enzima bi-funzionale in quanto mostra sia un'attività fosfotrasferasica che idrolitica (Fig. 1.3.1.3.). L'enzima è specifico per i nucleosidi monofosfato purinici ed ha preferenza per IMP/dIMP e GMP/dGMP piuttosto che per AMP/dAMP e le pirimidine monofosfato (Itoh et al., 1967; Itoh et al., 1993. Gli studi riguardo la cinetica , eseguiti con il ricombinante o la proteina umana purificata, indicano un valore di Km

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28 approssimativamente di 0,5 mM per l'IMP,

seguito da GMP, dIMP, dGMP, AMP e XMP (Spychala et al., 1987; Allegrini et al., 1997). Per quel che riguarda i substrati non-fisiologici, cN-II defosforila il 5-fluoro-UMP (11% di IMP), AZRMP(6% di IMP), cladribina-monofosfato (4,5% di IMP), araGMP (3,5% di IMP), fludarabina-MP, metiltio-IMP, tioIMP, e tioGMP, con una Km che varia da 33 microM a 1mM (Mazzon et al., 2003; Jordheim et al., 2006).

1.3.8.3. Attivita' fosfotrasferasica

Per dimostrare l'attività fosfotrasferasica di cN-II sono stati utilizzati sia l'enzima umano purificato che il ricombinante, che sono in grado di trasferire il fosfato dal nucleoside monofosfato ad un nucleoside accettore (Worku et al., 1982;Turriani et al., 1994; Baiocchi et al., 1996; Allegrini et al., 2004; Pesi et al., 2010). L'attività di cN-II umana è stata studiata anche sull'enzima purificato da linfoblasti (Jhonson et al., 1982). I donatori di fosfato più efficienti per la fosforilazione dell'inosina sono IMP, GMP, dIMP, dGMP seguite da XMP e UMP, mentre CMP, TMP e AMP sono donatori di fosfato molto poveri (Banditelli et al., 1996; Allegrini et al., 1993). Gli studi sulla specificità di substrato mostrano che l'inosina (seguita dalla 2'-deossiinosina) è il nucleoside accettore maggiormente specifico di cN-II, mentre la guanosina viene fosforilata dalle 3 alle 5 volte più lentamente.

1.3.8.4. Meccanismo d'azione

La cN-II mostra, come già detto, una preferenza di substrato, nella reazione nucleotidasica, per i nucleosidi monofosfao 6-idrossipurinici IMP, dIMP, GMP, dGMP, XMP. La velocità della reazione nucleotidasica (reazione complessiva) si ottiene

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29 quantificando il nucleoside che si forma dal nucleoside monofosfato iniziale, anche in presenza di un eventuale nucleoside accettore. Se il gruppo fosfato liberatosi viene ceduto ad una molecola d'H2O a formare fosfato inorganico, è avvenuta la reazione idrolitica/fosfatasica: la velocità di questa reazione può essere misurata in modo diretto, misurando il fosfato formatosi (Chifflet et al., 1988) o in modo indiretto, attraverso la differenza tra la reazione complessiva e la PHT (Banditelli et al., 1996). Se il gruppo fosfato liberatosi viene ceduto ad un adatto nucleoside accettore, è avvenuta la reazione fosfotrasferasica di interconversione (PHT); la velocità di questa reazione può essere misurata valutando la quantità di nucleotide monofosfato ottenuto in funzione del tempo. Nella reazione fosfotrasferasica i migliori nucleosidi donatori di fosfato sono sempre i nucleosidi monofosfato 6-idrossipurinici; i migliori nucleosidi accettori di fosfato sono invece l'inosina e la deossi-inosina, mentre la reazione procede più lentamente con la guanosina ed è nulla con la deossiguanosina (Pesi et al., 1994).

Entrambe le reazioni sono totalmente dipendenti dalla presenza dello ione Mg2+. La A 0,5

dell'MgCl2 per l'enzima purificato dal timo di mammifero, è approssimativamente intorno a 2mM, in presenza di IMP 2mM e di ATP 4.5 mM nel saggio di reazione (Pesi et al.,1994). La reazione nucleotidasica e quella fosfotrasferasica presentano un pH optitum diverso: per la prima è 6.5, mentre per la seconda è 7.2, leggermente più basico (Banditelli et al.,1996). In un range di pH tra 6.2 e 7.8, la presenza dell'inosina nel saggio di reazione, che possa fungere da nucleoside accettore di fosfato, produce una moderata attivazione sulla reazione complessiva; ciò può essere spiegato assumendo che la tappa limitante del processo enzimatico sia l'idrolisi dell'intermedio fosfoenzimatico, che è più lenta rispetto al trasferimento del fosfato a un nucleoside accettore. Questo è dovuto, probabilmente, alla natura parzialmente idrofobica del sito attivo, che porta ad una preferenza per accettori di fosfato organico rispetto all'acqua (Banditelli et al., 1996).

1.3.8.5. Regolazione

La cN-II è un enzima allosterico, in cui il modulatore allosterico esplica la sua azione attraverso un legame reversibile. L'attività di cN-II è regolata in maniera molto complessa da diversi effettori, che non prendono parte alla reazione ma agiscono stabilizzando una delle conformazioni dell'enzima, con diverse caratteristiche cinetiche (Bretonnet et al.,

2005). I principali modulatori sono elencati e descritti di seguito:

• Nucleotidi/dinucleosidi purinici polifosfato dATP/ ATP/ GTP/ ADP/ BPG/ Ap4A (Hunsucker et al., 2005).

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30 L'ATP è uno dei maggiori attivatori, con una A0,5 intorno a 1 mM (Pesi et al., 1994);

svolge la sua azione aumentando molto la Vmax e abbassando, di poco, la Km per il substrato IMP. L'ATP protegge l'enzima anche dall'inattivazione da calore e dalla digestione da tripsina (Bretonnet et al., 2005). Inoltre, l'ATP sembra favorire l'auto-associazione tra le subunità, finanche a formare un ottamero (Spychala et al., 1999). Il grado di associazione dell'enzima dipende anche dalla sua concentrazione in soluzione. Anche l'ADP è un attivatore di cN-II, con una A0,5 intorno a 2 mM (Pesi et al., 1994).

Il 2,3.BPG è anch'esso un attivatore, con una A0,5 un po' più bassa, 0.45 mM (Pesi et al.,

1994); in queste condizioni, il BPG può svolgere un'azione attivante solo negli eritrociti,

le uniche cellule in cui la concentrazione di questo composto raggiunge livelli millimolari. E' stato dimostrato un sinergismo d'azione tra l'ADP e il BPG: infatti, in presenza di ADP la concentrazione minima necessaria di BPG si abbassa di almeno un ordine di grandezza, facendo ipotizzare che questo composto possa svolgere la sua azione attivante anche in cellule diverse dagli eritrociti. Probabilmente i due attivatori occupano due siti effettori diversi (Pesi et al., 1996).

Tra i dinucleosidi purinici polifosfato, solo Ap4A è un potente attivatore, in misura maggiore dell'ATP, e risulta essere rilevante a livello fisiologico in quanto questo composto è presente nella maggior parte dei tessuti alle concentrazioni necessarie a svolgere le sue funzioni.

• Sali

Alcuni sali di metalli alcalini (NaCl, KCl, LiCl) hanno un'azione attivante sulla cN-II, a concentrazioni millimolari: NaCl e KCl a concentrazioni ≥ 300mM promuovono la stabilizzazione dell'enzima, favorendo l'aggregazione di più subunità (Bretonnet et al.,

2005).Anche alcuni sali di acidi carbossilici (malato, fumarato e succinato) hanno

un'azione simile sull'attivazione di cN-II. • Condizioni redox

L'enzima esplica pienamente la sua attività in condizioni riducenti. In condizioni ossidanti, l’enzima perde parte della sua attività, la Cys547 e la Cys175 formano un ponte disolfuro, il quale si pensa possa costituire un meccanismo regolatorio in quanto renderebbe la proteina suscettibile a subire un taglio proteolitico a livello dell'Arg526. In seguito alla proteolisi limitata si otterrebbe una subunità di 54kDa attiva ed insensibile alle condizioni ossidanti (Allegrini et al., 2004); questo è un esempio di “regolazione redox intrasterica”: è una sottoclasse del modello allosterico, in cui un dominio della proteina stessa, dotato di “sensori redox” come i ponti disolfuro, funge da

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pseudo-31 substrato capace di inibire il proprio sito attivo (Bretonnet et al., 2005).

• Fosfato inorganico (Pi)

E' il principale inibitore di cN-II, anche a concentrazione fisiologica, con una A0,5 pari a

2mM; il fosfato inorganico aumenta la Km sia per l'IMP che per l'inosina. Le azioni dell'ATP e del fosfato inorganico si controbilanciano vicendevolmente: infatti, una concentrazione di Pi pari a 5mM, in presenza di ADP 4.5 mM causa un'inibizione del

60%, mentre con ATP 4.5mM solo del 15% (Pesi et al., 1994).

cN-II è un enzima implicato insieme a HGPRT e PNP, nel ciclo del substrato che regola le concentrazioni intracellulari dei nucleotidi e dei deossinucleotidi purinici (Rampazzo et al. 1999). In condizioni fisiologiche([ATP] 4.5mM, [Pi] 5mM) e di disponibilità di un nucleoside accettore, la cN-II agisce prevalentemente come fosfotraferasi. Questo enzima, quindi, potrebbe svolgere non solo un'azione catabolica, ma anche anabolica, dove questa è richiesta, come, ad esempio, nelle cellule con un'alta sintesi di DNA, che, infatti, mostrano un'elevata attività specifica per la cN-II: per questa doppia funzione, è detto enzima bifunzionale. In assenza di effettori, agisce preferenzialmente come idrolasi, anche in presenza di accettori di fosfato (Pesi et al. 1994). Una sovra-espressione della cN-II in cellule HEK ha portato ad una riduzione dal 20 al 25% del pool dei NTP e dei dNT (Rampazzo et al., 1999).

Di seguito sono riportate le principali azioni fisiologiche svolte dalla cN-II:

1. In caso di anossia e/o ischemia, in presenza quindi di una deplezione di ATP e di un accumulo di Pi, si previene, tramite l'inibizione della cN-II, la degradazione di IMP, limitando la perdita dei nucleotidi (Bretonnet et al., 2005);

2. L'attività della cN-II è alta in organi importanti per il rifornimento di purine per l'intero organismo e per la sintesi di acido urico (come nel fegato). La cN-II è legata all'enzima AMP-deaminasi, che trasforma l'AMP in IMP nel cosiddetto “IMP pathway”, attivo in condizioni fisiologiche; di conseguenza, la cN-II converte l'IMP in inosina: questi due enzimi, quindi, sono regolatori importanti del pool dei nucleotidi purinici (Hunsucker et al., 2007). Inoltre l'AMP nelle cellule cardiache è defosforilato ad adenosina dalla cN-IA; la cN-II potrebbe sostituire la cN-IA in cellule dove questa non è presente, come i linfociti polimorfonucleati.

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32 3. L'azione fosfotrasferasica della cN-II è anche implicata nel recupero dei nucleosidi purinici: ad esempio, la XMP può anche essere formata per trasferimento del fosfato da IMP alla xantosina, bypassando l'enzima IMPDH (IMP-deadrogenasi), che produce XMP da IMP untilizzando il NAD+, e che è bersaglio di molti farmaci antivirali, immunosoppressori e antitumorali (Barsotti et al., 2005); l'enzima può inoltre produrre dIMP da IMP usando dIno come accettore di fosfato, e quindi, a seguire, dAMP e dGMP, bypassando l'enzima ribonucleotide reduttasi, che produce dADP e dGDP a partire dai rispettivi nucleosidi difosfato, grazie al NADPH (Tozzi et al., 1991); Un ciclo più complesso che regola il pool intracellulare dei nucleotidi purinici è il “ciclo delle ossipurine” (fig. 1.3.1.3.). Questo ciclo vede come substrati il PRPP, che è un precursore fondamentale del recupero delle purine, e il Rib-1-P precursore del recupero delle pirimidine. La cN-II, partecipando a questo ciclo metabolico, regola i livelli intracellulari di questi due substrati, e quindi controlla anche la via di recupero delle purine. Quando il rapporto [Pi]/[ATP] è basso, cioè nelle normali cellule ossigenate, la cN-II è attiva e la velocità del ciclo è massima; il PRPP, quindi, è a bassi livelli. In condizioni ischemiche, il rapporto [Pi]/[ATP] aumenta, la cN-II è inibita e il PRPP è disponibile per la sintesi dei nucleotidi purinici, necessari durante la riperfusione. Questo ciclo rappresenta la vera via di recupero delle purine, ed è favorito dall'aumento dei livelli basali di purine che si verifica durante l'ischemia e dall'aumento del livello di PRPP, come accade in condizione di anossia. (Ipata & Tozzi,

2006).

4. La cN-II grazie alla sua attività fosfotransferasica, può avere un ruolo chiave nell'attivazione degli analoghi dei nucleodi usati in terapia antineoplastica e antivirale; come nucleotidasi, invece, potrebbe essere coinvolta nella resistenza a questa classe di

Fig. 1.3.1.3. Ciclo delle ossipurine modificato da Tozzi & Ipata 2006