3.1 HMF
Campionamento e allevamento api:
Presso l’apiario sperimentale del Dipartimento di Scienze Veterinarie locato in San Piero a Grado, le api bottinatrici sono state campionate in un numero di 400. Sono state prelevate esternamente dall’alveare tramite chiusura temporanea dell’entrata nelle ore centrali di una giornata calda e soleggiata. La temperatura di allevamento era 30±2°C. Le prove sperimentali dell’alimentazione zuccherina con aggiunta di HMF in Apis mellifera L. sono state effettuate all’interno di gabbie sferiche. Le sfere in questione sono state costruite e sviluppate nel Dipartimento di Veterinaria dell’Università di Pisa. Sono state preferite le sfere invece delle gabbie, generalmente utilizzate per lo studio del comportamento, della mortalità e dell’alimentazione in Apis mellifera. Le gabbie, oltre ad essere di dimensioni ridotte, 11X13X6,5 cm, permettono l’osservazione limitata del movimento sia quando le api camminano, sia quando stanno ferme, sia quando e quanto si alimentano, ma non permettono di osservarne il volo, che è invece possibile nelle sfere. Le sfere sono costruite tramite due componenti principali: una palla in un polimero di termoplastico e una mangiatoia per polli appositamente tagliata per adattarla alla chiusura della parte basale e superiore della palla. La sfera ha un diametro di 38 cm e un’altezza di 36 cm perché la sfera è tagliata alla base dei due poli e l’altezza non corrisponde al diametro.
Figura 2: Le due differenti gabbie. Le palle sulla destra sono state utilizzate per questa prova sperimentale
Sciroppo:
La soluzione zuccherina è stata preparata all’inizio e durante l’esperimento, nel caso in cui essa terminasse. Le soluzioni sono state mantenute nel frigorifero a 4°C. Le diete sperimentali sono quindi:
1. Controllo - soluzione zuccherina 50% w/v - costituita interamente da saccarosio; 2. Exp 1- soluzione zuccherina 50% w/v + 30 mg/kg HMF;
3. Exp2- soluzione zuccherina 50% w/v + 60 mg/kg HMF; 4. Exp3- soluzione zuccherina 50% w/v + 120 mg/kg HMF.
Per ciascuna dieta sono state fatte 3 repliche.
Per tutte le repliche sono state valutate la sopravvivenza, il comportamento e il consumo giornaliero.
Sopravvivenza
Per calcolare l’indice di sopravvivenza e la curva di mortalità si sono contate e asportate dalla palla le api ritrovate decedute la mattina alle 8:30.
Consumo dieta
Ogni giorno alle 8:00 sono state pesate le siringhe, contenenti l’alimentazione.
Le siringhe venivano giornalmente riempite con i rispettivi sciroppi oggetto della prova (0 ppm, 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm).
Per il calcolo del consumo giornaliero, la differenza di peso delle siringhe tra due giorni consecutivi è stata divisa per il numero di api vive presenti nell’orario di misurazione. La misurazione è stata effettuata ogni giorno alle 8:30.
Comportamento
Per la misura del comportamento sono state contate per ogni prova, il numero di api che eseguivano i seguenti comportamenti per un minuto: camminano, volano, si alimentano, stanno ferme su foglio cereo e/o su altre superfici.
Sono state valutate per sei volte durante l’arco della giornata. Due volte alle 8:30, due volte alle 13:00 e due volte alle 18:30 (Martin e Bateson, 2003).
Per misurare il variare della concentrazione di HMF, all’interno delle soluzioni a 0, 30, 60, 120 ppm, a due temperare diverse, 4°C e 28+/- 2 °C, è stato utilizzato il metodo di indagine proposto da White (1979).
Per fare l’analisi sono stati prelevati 5 grammi di soluzione (0, 30, 60, 120 ppm) che sono stati disciolti in 25 ml di acqua. Successivamente sono state aggiunte 0,5 ml della soluzione Carrez I e 0,5 ml della soluzione Carrez II e portato la soluzione finale a 50 ml con l’aggiunta di acqua. La soluzione finale è stata filtrata con un filtro di carte e i primi 10 ml di soluzione è stata scartata.
Successivamente 5 ml di soluzione filtrata è stata suddivisa in due provette, in una è stata aggiunta 5 ml di acqua distillata, nella seconda è stata aggiunta 5 ml di soluzione allo 0,2% di bisolfito di sodio. Successivamente è stata fatta la un’analisi di assorbanza allo spettrofotometro a due lunghezze d’onda 284 e 336 nm. Per calcolare la concentrazione è stata usata la formula: HMF (mg/kg) = (A284 - A336) x 149,7 x 5 x D/W Dove: -A284 = assorbanza a 284 nm -A336 = assorbanza a 336 nm -149,7= costante
-5 = peso nominale teorico del campione
-D = fattore di diluizione (nel caso la diluizione è stata fatta) -W = peso in grammi di soluzione presa
Nell’esperimento è stata fatta una soluzione per ogni prova a una determinata temperatura. Alla temperatura di 4°C sono state fatte analisi dei campioni al tempo 0, 3, 10, 20. Per le soluzioni mantenute alla temperatura di 28+/- 2 °C sono state fatte analisi al tempo 7, 15. Lo spettrofotometro utilizzato è Labda 25 (Perkin Elmer) (UV/VIS Spectrometer). Analisi statistica
I dati relativi alla sopravvivenza sono stati analizzati con il Kaplan-Meier test. I dati relativi al consumo e al comportamento sono stati testati per verificare la presenza di una distribuzione normale (Shapiro-Wilk test). Essendo distribuiti non normalmente sono stati analizzati tramite il test non parametrico Kruskal-Wallis. I dati sono stati analizzati tramite i software JMP (SAS institute) e Graphpad (PRISM 8). Valori con p<0,05 sono stati considerati significativamente diversi.
3.2 Proteine
Campionamento e allevamento api
Presso l’apiario sperimentale del Dipartimento di Scienze Veterinarie locato in San Piero a Grado, sono state campionate circa 200 api neo-sfarfallate e circa 200 api bottinatrici e distribuite per ciascuna età in 9 gabbiette di allevamento in plexiglass con un foglio cereo all’interno. La temperatura di allevamento era 30±2°C. Le gabbiette sono state raggruppate in tre diete sperimentali (3 gabbiette per dieta): la Dieta 1, candito prodotto con saccarosio di barbabietola; la Dieta 2, candito contenente estratto di lievito e proteine; e la Dieta 3, candito contenente proteine da lievito di birra. Da una analisi effettuata nel laboratorio risulta che la Dieta 1 conteneva 0,3% di proteine, la Dieta 2 conteneva 1,7% di proteine e la Dieta 3 ne conteneva 7,7%. La dieta è stata somministrata ad libitum tramite una siringa da 5ml. Una siringa di ugual volume in ciascuna gabbietta conteneva acqua.
Figura 2. Apiario sperimentale del Dipartimento di Scienze Veterinarie in San Piero a Grado a sinistra; gabbiette di allevamento utilizzate nel progetto a destra.
Sopravvivenza
Ogni giorno gli individui morti sono stati registrati ed eliminati dalle gabbiette in modo da poter misurare la sopravvivenza in ciascuna gabbietta. Al decimo e al ventesimo giorno di allevamento campioni di api appartenenti a 3 gabbiette per dieta sono state conservate a -20°C
per la successiva indagine enzimatica. Per l’eccessiva mortalità la sperimentazione sulle api bottinatrici è stata interrotta al decimo giorno.
Consumo dieta
Ogni giorno le siringhe contenenti la dieta somministrata sono state pesate in modo da quantificare il consumo nell’intera gabbietta. Tale valore è stato poi diviso per il numero di api presenti per ottenere il consumo medio per ape.
Attività glucosio ossidasica
La testa di una ape rappresentava il singolo campione. Ciascun campione è stato pesato prima della estrazione proteica. Al campione sono stati aggiunti 200 µl di tampone fosfato 50mM pH 7,2. I campioni sono stati posti a -20°C per 20 minuti e omogeneizzati per mezzo di un pestello di teflon. È stata effettuata successivamente una centrifuga a 4000rpm, a 4°C per 15 minuti e ne è stato collezionato il surnatante. La quantificazione proteica è stata effettuata tramite il metodo di Bradford a 595nm con lo spettrofotometro lambda 25 UV/VIS (Perkin Elmer).
Il protocollo utilizzato è in accordo con Cohen (1973). Per ciascun estratto proteico è stata preparata 1,5ml di soluzione contenente 100mM tampone Hepes pH 7, 0,1mM EDTA, 5mM D-glucosio. Diaminobenzidine (DAB) (0,18mg/ml), e HRP (perossidasi di rafano) (0,02mg/ml) sono stati aggiunti alla soluzione prima della lettura allo spettrofotometro. L’assorbanza è stata ottenuta alla lunghezza d’onda di λ=352nm a tempi 0 e 120 minuti. La
retta di taratura è stata costruita usando differenti concentrazioni di H2O2. I risultati sono stati
espressi in UE/mg di tessuto e UE/mg di proteina. Analisi statistica
I dati relativi alla sopravvivenza sono stati analizzati con il Kaplan-Meier test. I dati relativi al consumo e l’attività glucosio ossidasica sono stati testati per verificare la presenza di una distribuzione normale (Shapiro-Wilk test). Essendo distribuiti non normalmente sono stati analizzati tramite il test non parametrico Kruskal-Wallis. I dati sono stati analizzati tramite i software JMP (SAS institute) e Graphpad (PRISM 8). Valori con p<0,05 sono stati considerati significativamente diversi.
3.3 Grassi
Campionamento e allevamento api
Presso l’apiario sperimentale del Dipartimento di Scienze Veterinarie locato in San Piero a Grado, sono state campionate circa 200 api neo-sfarfallate e circa 200 api bottinatrici e distribuite per ciascuna età in 9 gabbiette di allevamento in plexiglass con un foglio cereo all’interno. La temperatura di allevamento era 30±2°C. Le gabbiette sono state raggruppate in tre diete sperimentali (tre gabbiette per dieta): la Dieta 1, candito prodotto con saccarosio di barbabietola (95% w/w di zucchero a velo e 5% w/w di acqua); la Dieta 2, candito della dieta 1, arricchito con il 5% w/w di olio di cocco vergine; e la Dieta 3, candito arricchito con il 10% w/w di olio di cocco vergine. La dieta è stata somministrata ad libitum tramite una siringa da 5ml. Una siringa di ugual volume in ciascuna gabbietta conteneva acqua.
Sopravvivenza
Ogni giorno gli individui morti sono stati registrati e eliminati dalle gabbiette in modo da poter misurare la sopravvivenza in ciascuna gabbietta. Al quinto e al ventesimo giorno di allevamento campioni di api appartenenti alle gabbiette per dieta sono state conservate a - 20°C per la successiva indagine. Per l’eccessiva mortalità la sperimentazione sulle api bottinatrici è stata interrotta al quinto giorno. Al ventesimo giorno la sperimentazione di api neo-sfarfallate è stata interrotta.
Consumo dieta
Ogni giorno le siringhe contenenti la dieta somministrata sono state pesate in modo da quantificare il consumo nell’intera gabbietta. Tale valore è stato poi diviso per il numero di api presenti per ottenere il consumo medio per ape.
Consumo energetico
Il consumo energetico medio per ape neo-sfarfallata è stato calcolando utilizzando i dati di consumo medio per ape, delle diverse diete, moltiplicano questi valori con per il contenuto energetico della dieta su 100 grammi.
Il contenuto energetico delle diete su 100 grammi è stato calcolato utilizzando i dati trovati
nel portale FoodData Central degli Stati Uniti dell’Agricoltura e moltiplicate per le varie
percentuali dei composti.
Il valore preso per il saccarosio è 375 kcal su 100 grammi e per l’olio di cocco vergine 929 kcal su 100 grammi.
I dati trovati in kcal sono stati trasformati in kJ, unità di misura dell’energia nel sistema internazionale, con il fattore di conversione 1 caloria = 4,184 joule.
Analisi statistica
I dati relativi alla sopravvivenza sono stati analizzati con il Kaplan-Meier test. I dati relativi al consumo sono stati testati per verificare la loro distribuzione normale (Shapiro-Wilk test). Essendo stati distribuiti non normalmente l’analisi è avvenuta tramite il test non parametrico Kruskal-Wallis. I dati sono stati analizzati tramite i software JMP (SAS institute) e Graphpad (PRISM 8). Valori con p<0,05 sono stati considerati significativamente diversi.
4.1 HMF
Consumo
Le api bottinatrici allevate all’interno delle sfere sono state alimentate con sciroppo zuccherino (gruppo di controllo), sciroppo zuccherino arricchito con 30 mg/kg di HMF, sciroppo zuccherino arricchito con 60 mg/kg di HMF e sciroppo zuccherino arricchito con 120 mg/kg di HMF.
In figura 3 viene mostrato il grafico del consumo medio per ape nelle quattro differenti prove. Il consumo medio per ape bottinatrice, nelle prove di controllo con solo soluzione zuccherina, era mediamente di 0,06202 g/ape con una deviazione standard di 0,01833 g/ape.
Il consumo medio per ape bottinatrice, nelle prove in cui era stato somministrata una soluzione zuccherina arricchita con 30 mg/kg di HMF, era mediamente di 0,06995 g/ape con una deviazione standard di 0,02202 g/ape.
Il consumo medio per ape bottinatrice, nelle prove in cui era stata somministrata una soluzione zuccherina arricchita con 60 mg/kg di HMF, era mediamente di 0,06995 g/ape con una deviazione standard di 0,031495 g/ape.
Il consumo medio per ape bottinatrice, nelle prove in cui era stata somministrata una soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF, era mediamente di 0,075854 g/ape con una deviazione standard di 0,023547 g/ape.
Figura 3: Grafico del consumo per ape nella prova con arricchimento di HMF. Non esiste nessuna differenza statistica sul consumo
Utilizzando lo Shapiro-Wilk test è stato visto che i dati relativi al consumo erano distribuiti in maniera non normale. Perciò i dati, del consumo medio per ape bottinatrice, sono stati analizzati tramite il test non parametrico Kruskal-Wallis. Con l’utilizzo di questa analisi non sono state trovate differenze a livello statistico fra le quattro diverse prove.
Sopravvivenza
Nel grafico in figura 4, sono riportate le curve sul tasso di sopravvivenza delle api bottinatrici, espressa in percentuale, nelle quattro differenti prove di alimentazione: sciroppo zuccherino (gruppo di controllo), sciroppo zuccherino arricchito con 30 mg/kg di HMF, sciroppo zuccherino arricchito con 60 mg/kg di HMF, sciroppo zuccherino arricchito con 120 mg/kg di HMF. Le api bottinatrici che sono state alimentate con una soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF, sono risultate avere un tasso di mortalità leggermente più alto rispetto alle altre prove, come si vede nel grafico nella figura 4. Analizzando i dati relativi alla sopravvivenza con il Kaplan-Meier test, è risultato che questa minori aspettative di vita delle api bottinatrici, alimentate con una soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF, non sia statisticamente diversa rispetto alle altre prove. Il p è maggiore di 0,05 (p= 0,055).
Figura 4: Grafico di sopravvivenza fra le differenti prove Comportamento
In figura 5 vengono riportati i risultati dell’analisi comportamentale effettuate su api bottinatrici allevate nelle sfere, nelle quattro differenti prove di alimentazione: sciroppo zuccherino (gruppo di controllo), sciroppo zuccherino arricchito con 30 mg/kg di HMF, sciroppo zuccherino arricchito con 60 mg/kg di HMF, sciroppo zuccherino arricchito con 120 mg/kg di HMF.
I comportamenti osservati sulle api bottinatrici, all’interno delle sfere, sono stati: n° di api nell’atto di volare, n° di api nell’atto di camminare (sia su telaino di cera sia sulle altre superfici solide della sfera), n° di api presenti sul telaino di cera (sia ferme che in movimento), n° di api nell’atto di alimentarsi nella siringa contenente la soluzione zuccherina, n° di api ferme (sia sul telaino di cera che sulle superfici solide della sfera).
Nell’analisi statistica sui comportamenti di api bottinatrici all’interno delle sfere, riportati nei grafici in figura 5, sono state trovate diverse significatività fra le prove.
- il numero di api bottinatrici che camminava, nella prova in cui le api bottinatrici erano alimentate con 30 mg/kg di HMF, è stato maggiore rispetto al numero di api bottinatrici alimentate con: la prova di controllo, con la soluzione zuccherina arricchita con 60 mg/kg di HMF, con la soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF;
- il numero di api bottinatrici che volava, nella prova in cui le api bottinatrici erano alimentate con la soluzione zuccherina di controllo, è stato maggiore rispetto alle prove in cui alle api bottinatrici era stata fornita una soluzione zuccherina arricchita con diverse concentrazioni di HMF (30 mg/kg, 60 mg/kg, 120 mg/kg);
- Il numero di api bottinatrici che rimaneva sul telaino di cera, sia camminando che rimanendo ferme, nella prova in cui le api bottinatrici erano alimentate con la soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF, è stato maggiore rispetto alle prove in cui alle api bottinatrici alimentate con: la prova di controllo, con la soluzione zuccherina arricchita con 30 mg/kg di HMF, con la soluzione zuccherina arricchita con 60 mg/kg di HMF;
- Il numero di api bottinatrici che rimaneva ferme, sia sul telaino che sulle parti solide della sfera, nella prova in cui le api bottinatrici erano alimentate con la soluzione zuccherina arricchita con 120 mg/kg di HMF, era minore rispetto alle prove in cui le api bottinatrici alimentate con: la prova di controllo, con la soluzione zuccherina arricchita con 30 mg/kg di HMF, con la soluzione zuccherina arricchita con 60 mg/kg di HMF.
Figura 5: Box Plot sul comportamento. I dati (n=3 per barra) sono espressi come media ± errore standard. Lettere diverse sopra ciascuna barra indicano differenza statistica.
Analisi chimiche sulla variazione di concentrazione dell’HMF
Nella sperimentazione sull’effetto dell’HMF in api bottinatrici, allevate in condizioni di laboratorio, le soluzioni utilizzate per la loro alimentazione sono state sottoposte ad analisi chimiche per l’indagine del contenuto in HMF.
Sono state usate le seguenti soluzioni: lo sciroppo zuccherino (gruppo di controllo), lo sciroppo zuccherino arricchito con 30 mg/kg di HMF, lo sciroppo zuccherino arricchito con 60 mg/kg di HMF, lo sciroppo zuccherino arricchito con 120 mg/kg di HMF.
Le soluzioni sopracitate sono state analizzate, con il metodo di indagine proposto da White (1979), sottoponendole a due condizioni di temperatura, per conoscerne la variazione, in funzione del tempo, dell’HMF.
Ogni soluzione è stata messa a 4°C e a 28 +/- 2 °C. Le due temperature, in cui sono state messe le quattro soluzioni, rispecchiano le condizioni di temperatura in cui le soluzioni si trovavano durante la sperimentazione.
Nella figura 6 vi è la rappresentazione grafica della concentrazione di HMF delle diverse soluzioni zuccherine nelle analisi a 28 +/- 2 °C, grafico in alto, a 4 °C, grafico in basso. Come si vede nel grafico in alto della figura 6, a 28 +/- 2 °C la concentrazione di HMF diminuisce nelle tre differenti soluzioni arricchite, con HMF, all’aumentare del tempo. Invece le concentrazioni di HMF, nelle quattro diverse soluzioni arricchite con HMF, mantenute alla temperatura di 4°C, rimangono più o meno constanti all’aumentare del tempo. Per la mancanza di dati, necessari per effettuare un’analisi statistica, non possiamo dire se i valori trovati sono significativamente diversi fra loro.
Figura 6: In alto il grafico dell’evoluzione dell’HMF a temperature di 28+/-2°C. In basso il grafico di evoluzione dell’HMF a temperatura di 4°C. La statistica non è stata fatta e qui riporto solo i grafici derivati dalle due repliche di ogni campione. Per l’evoluzione dell’HMF a 28+/-2°C al tempo 0 non sono state fatte analisi.
4.2 Proteine
Consumo dieta
Per la sperimentazione sull’effetto di una dieta proteica sulle api, sono state usate api di differente età. Api neo-sfarfallate e api bottinatrici.
Il consumo per ape, delle api neo-sfarfallate, è stato valutato per 20 giorni. Invece per api bottinatrici il consumo per ape è stato valutato per 10 giorni. Le differenti diete contenevano differenti concentrazioni di proteine.
La Dieta 1 era composta da solo candito zuccherino, contenuto proteico 0% in peso, ed è stata utilizzata come controllo.
La Dieta 2 era composta da un candito zuccherino arricchito con proteine derivanti da lievito di birra, avente, la dieta, una concentrazione in proteine pari a 1,7% in peso.
La Dieta 3 era composta da un candito zuccherino arricchito con proteine derivanti da lievito di birra, avente, la dieta, una concentrazione in proteine pari a 7,7% in peso
Nella figura 3 sono stati riportati i grafici del consumo per ape di entrambe le età (neo- sfarfallate e bottinatrici) alimentate con le tre diete sperimentali (Dieta 1, Dieta 2 e Dieta 3). Le api che hanno consumato statisticamente di più risultano essere le bottinatrici nutrite con la Dieta 3 mentre quelle che hanno consumato meno alimento risultano le api neo-sfarfallate nutrite con la Dieta 1 sebbene tra le api neo-sfarfallate non ci sia differenza statistica tra le api allevate con le tre diete sperimentali.
Figura 6. Box-plot del consumo medio per ape di api neo-sfarfallate e bottinatrici allevate con tre diete sperimentali, Dieta 1, Dieta 2 e Dieta 3 contenenti 0,3%, 1,7% e 7,7% di proteine rispettivamente. Lettere diverse sopra ciascuna barra indicano differenza statistica (p<0,01) al Kruskal-Wallis test.
Sopravvivenza
I risultati evidenziano che le api neo-sfarfallate nutrite con le Diete 1 e 2 hanno avuto una sopravvivenza statisticamente maggiore rispetto alle api allevate con la Dieta 3 (p<0,0001). Anche per quanto riguarda le api bottinatrici le api allevate con la Dieta 3 hanno mostrato la sopravvivenza minore delle altre api allevate con le altre due diete sperimentali, mentre le api bottinatrici allevate con la Dieta 1 hanno mostrato la sopravvivenza maggiore (p<0,0001) (figura 7).
Figura 7. Percentuale di sopravvivenza di api neo-sfarfallate e bottinatrici allevate con tre diete sperimentali, Dieta 1, Dieta 2 e Dieta 3 contenenti 0,3%, 1,7% e 7,7% di proteine rispettivamente. Lettere diverse alla destra delle curve indicano differenza statistica (p<0,0001) al Kaplan-Meier test.
Attività glucosio ossidasica
In figura 8 e tabella 1 sono riportati i dati risultanti dall’analisi dell’attività glucosio ossidasica (espresse in UE per mg di tessuto e UE per mg di proteina, rispettivamente) di api neo- sfarfallate e bottinatrici allevate con tre diete sperimentali, Dieta 1, Dieta 2 e Dieta 3. Le api neo-sfarfallate allevate in gabbietta per 10 giorni hanno avuto un incremento di attività glucoso ossidasica rispetto a quelle al momento del campionamento in apiario (T0) indipendentemente dalla dieta sperimentale (p<0,0001). Nelle api neo-sfarfallate la nutrizione per 10 giorni con Dieta 3 induceva maggiore attività glucosio ossidasica rispetto a quelle nutrite con la Dieta 2. Al 20° giorno di allevamento in tutti e tre i gruppi di api neo-sfarfallate