Soggetti reclutati e disegno dello studio
Per questo studio diagnostico cross-sectional sono stati reclutati 26 pazienti affetti da MA, afferenti al Centro per i Disturbi Cognitivi della Clinica Neurologica dell’Università di Pisa. In parallelo sono stati studiati 20 controlli sani (CS). La storia clinica, l’esame obiettivo e le indagini strumentali hanno permesso di dimostrare, in ciascun soggetto, l’assenza di malattie cardiovascolari o di altre patologie mediche maggiori concomitanti. In tutti i pazienti è stata formulata una diagnosi di “MA probabile” in base ai criteri del NINCDS-ADRDA Work Group (G. McKhann et al., 1984), con una severità di grado “lieve” definita in base alla valutazione clinica cognitiva, in particolare secondo un punteggio ottenuto al MMSE ≥ 20/30, punteggio grezzo.
Lo studio è stato valutato e ha ricevuto l’approvazione del Comitato Etico di competenza. Prima dell’inizio degli esperimenti i partecipanti (o i loro tutori legali) hanno fornito il loro consenso informato scritto per prendere parte allo studio.
In particolare, tali pazienti sono stati sottoposti a:
- Accurata valutazione clinica mediante anamnesi dettagliata ed esame obiettivo generale e neurologico;
- Valutazione neuro-psicologica approfondita eseguita attraverso la somministrazione di una serie di test, tra cui Mini-Mental State Examination (MMSE, (Folstein, Folstein, & McHugh, 1975)) e test neuropsicologici specifici per esaminare ciascuna delle funzioni cognitive: span di cifre (Orsini, 1987), test delle 15 parole di Rey (Carlesimo et al., 1996) e apprendimento di un racconto (Carlesimo et al., 2002) per la memoria verbale; test dei cubi (Orsini et al., 1987) e figura complessa di Rey (Carlesimo et al., 2002) per la memoria visuo-spaziale; test di Weigl (Spinnler & Tognoni, 1987) per le capacità astrattive; test delle matrici (Spinnler & Tognoni, 1987), digit symbol substitution test (subtest n.7 Wais) e test di Stroop (Caffarra et al., 2000) per l’attenzione; test
dell’orologio (Royall et al., 1998) e fluenza verbale fonemica (Carlesimo et al., 1996) per le funzioni frontali e capacità di pianificazione. Sono stati inoltre impiegati strumenti standardizzati per valutare i disturbi comportamentali come la scala Neuro Psychiatric Inventory (NPI, (J. L. Cummings, 1997)) e l’autonomia nelle attività di base della vita quotidiana (Activity of Daily Living, ADL, (Katz, Ford, Moskowitz, Jackson, & Jaffe, 1963)) e le più complesse attività strumentali della vita quotidiana (Instrumental Activity of Daily Living, IADL, (Lawton & Brody, 1969));
- Esami di neuro-imaging strutturale (TC, RM) e funzionale (18
FDG-PET, PET con Florbetapir) e rachicentesi con dosaggio di Ab1-42, t-Tau, p-Tau e proteine totali.
Per determinare le concentrazioni di Ab1-42, t-Tau e t-a-syn nei globuli rossi è stato eseguito un
prelievo ematico venoso a digiuno e i campioni di sangue sono stati processati in maniera analoga nei pazienti e nei controlli. Dai campioni di sangue sono stati isolati i globuli rossi su cui è stato eseguito un dosaggio immunoenzimatico.
Prelievo di globuli rossi
Il sangue intero è stato prelevato dai pazienti e conservato in una provetta contenente EDTA come anticoagulante. I GR sono stati separati dal plasma mediante centrifugazione a 200 x g a 4 °C per 10 minuti (Daniele et al., 2017). Il pellet di GR è stato lavato con 3 ml di PBS (Phosphate Buffered Saline) e centrifugato a 1000 x g per 10 minuti, procedimento svolto per tre volte. È stata eseguita una diluizione esterna 1:400 in PBS per poter effettuare un dosaggio proteico (dosaggio di Bradford). È stata successivamente eseguita un’ultima centrifugazione a 1500 x g per 10 minuti. Il pellet di GR è stato quindi congelato a -20 °C fino all’utilizzo. Per i dosaggi immunoenzimatici, i GR sono stati sospesi in un volume di SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 2 mM tale da ottenere una concentrazione finale di 40 mg di proteine totali in 100 µl.
Identificazione di Aβ1–42
I livelli di Aβ1–42 nei campioni di sangue sono stati misurati usando il saggio ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), metodo immunoenzimatico utilizzato per rilevare la presenza di una determinata proteina in un fluido biologico. Per effettuare il saggio è necessaria una piastra in poliestere con 96 pozzetti. È stato eseguito un coating dei pozzetti con uno specifico anticorpo diretto verso Aβ1–42 (Ab full lenght SC-9129 H-43, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:100 in Poliornitina (diluita in NaHCO3, 50 mM, pH 9.6) e la piastra è stata incubata tutta la
notte a 4 °C. Dopo due lavaggi veloci con PBS-T (Phosphate Buffered Saline, contenente 0.01% Tween 20), i siti aspecifici sono stati bloccati con 200 µl di BSA (Bovine Serum Albumin) 1%, mantenendo la piastra nell’agitatore per due ore a 37 °C. In seguito a due lavaggi veloci con 200 µl di PBS–T, i pozzetti sono stati incubati con i GR (0,1 mg/100 µl) a 25 °C per 1 ora e con diluizioni di proteina Aβ1–42 standard. Dopo tre lavaggi con 200 µl di PBS-T, sono stati aggiunti 60 µl per pozzetto di uno specifico anticorpo primario diretto verso Aβ1–42 (Ab per C-terminale goat SC-5399 D-17, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:250 in PBS/Triton/BSA. Dopo 1,5 ore di incubazione a 25 °C i pozzetti sono stati lavati tre volte con 200 µl di PBS-T e successivamente sono stati incubati per 1 ora con 100 µl per pozzetto di anticorpo secondario (anti goat 1:2500), diluito in PBS/Triton/BSA. L’anticorpo secondario è un anticorpo marcato, ovvero legato ad un enzima, la perossidasi di rafano (HRP). In seguito a ulteriori tre lavaggi con 200 µl di PBS-T, sono stati aggiunti 80 µl di substrato TMB (3,3’,5,5’tetrametilbenzidina, Thermo Scientific) per ogni pozzetto. La reazione fra enzima (HRP) e substrato (TMB) produce sviluppo di colorazione, che è indicativo della presenza della proteina. È stata quindi monitorata la colorazione e la reazione è stata bloccata usando 80 µl di Stop Solution (H2SO4, diluito 1:9,21
in acqua). L’assorbanza è stata misurata a 450 nm (0,1 sec). La curva standard è stata creata usando soluzioni standard di Aβ1–42ricombinante umana a otto differenti concentrazioni ed è stata necessaria per ottenere le concentrazioni di proteina Aβ1–42 presente nei campioni (Daniele et al., 2017).
Identificazione di t-Tau
I livelli di t-Tau nei campioni di sangue sono stati misurati usando il saggio ELISA. È stato eseguito un coating dei pozzetti con uno specifico anticorpo diretto verso Tau (Ab full lenght SC-32274, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:100 in Poliornitina, e la piastra è stata incubata tutta la notte a 4 °C. Dopo aver effettuato due lavaggi veloci con 200 µl di PBS–T, sono stati aggiunti 200 µl di BSA 1%. La piastra è stata mantenuta nell’agitatore per 1 ora a 37 °C e successivamente lavata tre volte con 200 µl di PBS–T. I GR (0,5 mg/100 µl) e le diluizioni di proteina t-Tau standard sono stati caricati in ogni pozzetto e mantenuti per 2 ore nell’agitatore a 25°C; successivamente sono stati fatti ulteriori tre lavaggi con 200 µl di PBS-T. Sono stati aggiunti 60 µl per pozzetto di anticorpo primario specificatamente diretto verso t-Tau (Ab anti tau rabbit SC-5587, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:250 in PBS/Triton/BSA, e la piastra è stata incubata per 2 ore a 37 °C. Effettuati tre lavaggi veloci con 200 µl di PBS-T, è stata eseguita l’incubazione con 80 µl per pozzetto di anticorpo secondario (anti rabbit 1:2000), diluito in PBS/Triton/BSA. In seguito ad ulteriori tre lavaggi veloci con 200 µl di PBS-T, sono stati aggiunti 80 µl di substrato TMB per ogni pozzetto, monitorando la colorazione. La reazione è stata bloccata usando 100 µl di Stop Solution (H2SO4 diluito 1:9,21 in acqua). L’assorbanza è
stata misurata a 450 nm (0,1 sec). La curva standard è stata creata usando soluzioni di t-Tau ricombinante umana a otto differenti concentrazioni ed è stata necessaria per ottenere le concentrazioni di proteina t-Tau presente nei campioni (Daniele et al., 2017).
Identificazione di t-α-syn
I livelli di t-α-syn nei campioni di sangue sono stati misurati usando il saggio ELISA. È stato eseguito un coating dei pozzetti con uno specifico anticorpo diretto verso t-α-syn (Ab full lenght SC-10717, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:100 in Poliornitina, e la piastra è stata incubata tutta la notte a 4 °C. Dopo aver effettuato due lavaggi veloci con 200 µl di PBS–T, sono stati aggiunti 200 µl di BSA 1%. La piastra è stata mantenuta nell’agitatore per 1 ora a 37 °C e successivamente lavata tre volte con 200 µl di PBS–T. I GR (0,2 mg/100 µl) e le diluizioni di
proteina t-α-synstandard sono stati caricati in ogni pozzetto e mantenuti per 2 ore nell’agitatore a 25°C; successivamente sono stati fatti ulteriori tre lavaggi con 200 µl di PBS-T. Sono stati aggiunti 60 µl per pozzetto di anticorpo primario specificatamente diretto verso t-α-syn (Ab anti t-α-syn mouse SC-12767, Santa Cruz Biotechnology), diluito 1:200 in PBS/Triton/BSA, e la piastra è stata incubata per 2 ore a 37 °C. Effettuati tre lavaggi veloci con 200 µl di PBS-T, è stata eseguita l’incubazione con 80 µl per pozzetto di anticorpo secondario (anti mouse 1:2000), diluito in PBS/Triton/BSA. In seguito ad ulteriori tre lavaggi veloci con 200 µl di PBS-T, sono stati aggiunti 80 µl di substrato TMB per ogni pozzetto, monitorando la colorazione. La reazione è stata bloccata usando 100 µl di Stop Solution (H2SO4 diluito 1:9,21 in acqua). L’assorbanza è
stata misurata a 450 nm (0,1 sec). La curva standard è stata creata usando soluzioni di t-a-syn ricombinante umana a otto differenti concentrazioni ed è stata necessaria per ottenere le concentrazioni di proteina t-a-syn presente nei campioni (Daniele et al., 2017).
Analisi statistica
Per studiare le differenze tra i valori dei biomarcatori eritrocitari nei due gruppi (CS vs. pazienti affetti da MA) è stato usato un metodo non-parametrico (il test U di Mann-Whitney), in quanto le variabili quantitative dei campioni non seguivano una distribuzione normale, come dimostrato mediante test di Shapiro-Wilk (p < 0,05).
Le differenze di sesso sono state studiate mediante il test del χ2 con correzione per la continuità o il test esatto di Fisher quando appropriato.
Abbiamo anche calcolato le curve ROC (receiver operating characteristic) relative alle concentrazioni dei singoli biomarcatori per valutarne la capacità di discriminare i soggetti del gruppo con MA da quelli del gruppo dei CS, misurandone sensibilità e specificità. Inoltre, abbiamo identificato il cut-off ottimale di concentrazione dei singoli marcatori in termini di sensibilità e specificità con il metodo dello Youden-Index.
5. RISULTATI
Analisi descrittiva
Le caratteristiche demografiche e i dati clinici dei pazienti affetti da MA e dei CS sono descritte nella Tabella 1.
I dati riguardanti l’età e il punteggio del MMSE sono riportati come media ± deviazione standard, mentre la misura della concentrazione delle proteine dosate è riportata come mediana e relativo range interquartile (IQ).
Le concentrazioni di tali proteine sono espresse come ng della proteina misurata/mg del totale delle proteine contenute nella sospensione dei GR.
Le differenze sono state considerate significative per valori di probabilità p < 0,05 (Tabella 1, Figure 1-3)
Sono stati reclutati nello studio 26 pazienti, di cui 11 femmine (42,3%) e 15 maschi (57,7%); per quanto riguarda i controlli invece, su un totale di 20, quattro erano femmine (20%) e 16 maschi (80%); la differenza di sesso tra i due gruppi non è risultata statisticamente significativa (test esatto di Fisher, p = 0,128).
L’età media al momento del prelievo nei pazienti affetti da MA è risultata di 70 anni
±
8,71, mentre nei controlli è risultata di 68,05 anni±
5,93; tuttavia tale differenza non è risultata statisticamente significativa (p=0,198).Il punteggio medio ottenuto al MMSE nei pazienti è stato di 21,35
±
0,98 su un totale di 30.Risultati dell’immunodosaggio
I livelli di Ab1-42, t-Tau e t-a-syn all’interno dei GR sono stati quantificati mediante un dosaggio
Il valore mediano della concentrazione di Ab1-42 nei GR dei pazienti affetti da MA è risultato
pari a 8,11 ng/ml, con range IQ di 4,4 - 31,2; nei CS è risultato pari a 10,40 ng/ml, con range IQ di 7,2 - 16,71 (p = 0,478) (Figura 1).
Il valore mediano della concentrazione di t-Tau nei GR dei pazienti affetti da MA è risultato pari a 6,37 ng/ml, con range IQ di 2,28 - 10,32; nei CS è risultato pari a 6,35 ng/ml, con range IQ di 3,98 - 11,26 (p = 0,387) (Figura 2).
Il valore mediano della concentrazione di t-a-syn nei GR dei pazienti affetti da MA è risultato pari a 8,39 ng/ml, con range IQ di 3,72 - 14,48; nei CS è risultato pari a 20,33 ng/ml, con range IQ di 15,61 - 47,99 (p = 0,001) (Figura 3).
Analisi della curva ROC
L’analisi della curva ROC ha permesso di valutare la capacità delle concentrazioni di Ab, t-a- syn e t-Tau nei GR di distinguere i pazienti affetti da MA e i controlli cognitivamente sani (vedi Figura 4). L’area sotto la curva ROC (AUROC) fornisce un’indicazione riguardo al valore diagnostico, dove AUROC = 0,5 indica un’associazione casuale e AUROC = 1 indica una discriminazione perfetta (Alemayehu & Zou, 2012). Maggiori sono i valori di AUROC, maggiore è la capacità discriminatoria, in base a quanto segue: “eccellente” (AUROC 0,90– 1,00), “buona” (AUROC 0,80–0,89), “moderata” (AUROC 0,70–0,79), “limitata” (AUROC 0,60–0,69), oppure “nulla”/nessuna capacità discriminatoria (AUROC 0,50–0,59) (Xia, Broadhurst, Wilson, & Wishart, 2013).
L’AUROC relativa alla concentrazione eritrocitaria di Ab1-42 è risultata pari a 0,56 con intervallo
di confidenza (IC) compreso tra 0,39 e 0,74 e p = 0,478;
L’AUROC relativa alla concentrazione eritrocitaria di t-Tau è risultata pari a 0,58 con IC tra 0,41 e 0,74 e p = 0,387;
L’AUROC relativa alla concentrazione eritrocitaria di t-a-syn è risultata pari a 0,78 con IC compreso tra 0,63 e 0,92 e p = 0,001.
Inoltre, relativamente alla t-a-syn, il calcolo dello Youden-Index ha permesso di identificare un valore soglia ottimale di concentrazione pari a 15,24 ng/mg, con una relativa sensibilità e specificità rispettivamente di 0,81 e 0,80.