MECCANISMO DI AZIONE DEGLI OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO E UTILITA' TERAPEUTICA

Sono state evidenziate due possibilità per l'uso clinico degli oligo antisenso. Una consiste nella formazione di un breve tratto di triplica elica con la formazione di legami detti di Hogsten, con le regioni di controllo della trascrizione in RNA presenti nel DNA. Un' altra possibilità potrebbe essere quella di veicolare un oligo

antisenso all'interno della cellula per formare una doppia elica ibrida DNA/RNA con l’RNA trascritto. La formazione della molecola ibrida può abolire la capacità di un segmento di DNA ad essere riconosciuto e dunque tradotto dall'apparato cellulare deputato alla biosintesi delle proteine.

STRATEGIA ANTISENSO

La figura 90 mostra la strategia antisenso, il legame di un oligonucleotide antisenso (rosso) all'RNA messaggero può:

1) impedire ai ribosomi di iniziare o di terminare la traduzione

2) indurre l'enzima ribonucleasi H a tagliare l'RNA. L'RNA tagliato non può essere tradotto e viene degradato.

Figura 90: legame tra un oligonucleotide antisenso e mRNA

STRATEGIA A TRIPLICE ELICA

La figura 91 mostra la strategia a triplica elica, l'oligonucleotide antisenso (rosso) si lega alle regioni di controllo del DNA, formando un complesso a triplica elica e questo complesso impedisce all'RNA polimerasi di legarsi al DNA per dare inizio alla trascrizione.

Figura 91: legame tra oligonucleotide a regioni di controllo di DNA.

L'uso clinico di queste molecole presenta dei problemi tra i quali quello di trasportare il farmaco nella cellula da curare, ISIS 333611 viene formulato in maniera da essere somministrato direttamente nel sistema nervoso centrale trammite una piccola pompa che infonde il farmaco direttamente nel fluido cerebro spinale, questo tipo di somministrazione viene chiamata infusione intratecale (figura 92).

Figura 92: infusione intratecale

antisenso; è infatti importante che la stabilità chimica sia abbastanza prolungata per garantire un'alta concentrazione di farmaco intracellulare impedendo che questo sia degradato dopo il suo ingresso nella cellula. L'oligo antisenso entra con difficoltà nella cellula perchè nella membrana cellulare vi sono cariche negative che si respingono con quelle sul fosfato presente nel DNA. Per risolvere questo problema cioè facilitare l'ingresso intracellulare del farmaco e dare stabilità all'oligonucleotide antisenso sono stati sostituiti alcuni atomi di ossigeno presenti nel DNA con gruppi metilici. Inoltre sono stati prodotti anche oligo antisenso dove l'atomo di fosforo normalmente presente nel DNA viene sostituito con uno di zolfo per aumentare la solubilità nel mezzo acquoso. Un altro modo potrebbe essere quello di includere il farmaco in liposomi e poi veicolarlo all'interno della cellula. Il farmaco deve garantire sicurezza a lungo termine; non vi sono però dati di farmacotossicità derivanti dall'uso di oligoantisenso e non si conoscono le conseguenze dell'ingresso e della permanenza in un organismo di dosi massicce di polimeri lunghi 15-17 nucleotidi. Questa dimensione minima di oligonucleotidi antisenso è necessaria per evitare interazioni aspecifiche tra l'oligonucleotide antisenso e un gene non-target. L'attività della ribonucleasi H, è stimolata dalla formazione dell'ibrido DNA/RNA, un enzima che deputato alla demolizione di tali ibridi. Quindi da una parte si ha l'inibizione della sintesi proteica e questo è un fattore importante da un punto di vista trapeutico ma dall'altro lato è difficile prevedere le possibili conseguenze di un aumento dell'attività della ribonucleasi H a livello intracellulare. I risultati ottenuti sia in colture cellulari che in trials clinici confermano che la produzione di proteina codificata dal gene target viene ad essere drasticamente ridotta dopo l'introduzione dell'oligonucleotide sequenza- specifico. Per l'uso clinico degli oligo antisenso dovranno essere fatti dei controlli di qualità accurati per escludere contaminanti tossici derivati da processi di sintesi ma anche intrinseci [155].

La SLA è caratterizzata da un accumulo di proteine insolubili e degenerazione dei motoneuroni. Studi recenti hanno identificato due proteine che contribuiscono alla malattia: FUS/TLS e TDP-43 che si legano all'RNA e sono molecole intermedie che traducono le informazioni genetiche dal DNA alle proteine. Nelle cellule normali queste proteine sono localizzate nel nucleo la cui azione è quella di mantenere una concentrazione adeguata di RNA.

Nei malati di SLA si ha un accumulo di FUS/TLS e TDP-43 nel citoplasma della cellula; pertanto non essendo più localizzate nel nucleo non possono svolgere la propria funzione. L'accumolo di quste proteine in questa area cellulare può portare a perdita della funzione cellulare e compromettere la vita della cellula nervosa interessata. La TDP-43 è una proteina importante in un'altra malattia neurodegenerativa chiamata FDT (demenza fronto temporale). La FTD è chiamata anche FTD-U (demenza fronto temporale con ubiquitina). Ulteriori ricerche hanno dimostrato una forte evidenza che una proteina anomala TDP-43 è coinvolta sia nello sviluppo della SLA che nella FTD-U. Prima della scoperta della TDP-43 era noto che circa il 15% delle persone affette da SLA hanno anche diagnosi clinica di FTD. Esistono variazioni notevoli di SLA familiare e sporadica. Studi sulla genetica della SLA hanno dimostrato che circa il 20% dei casi con SLA familiare sono dovuti a mutazioni del SOD1, ma il restante 80% dei casi familiari di un gene o di geni non riconosciuti. Una anormale TDP-43 non è presente nei casi di SLA con mutazioni SOD1 e questo vuol dire che alcuni casi familiari e sporadici sono causati da meccanismi simili. La TDP-43 è codificata dal gene TARDBP, questo gene mutato è stato trovato nei malati di SLA. La scoperta di questo gene mutato implica che l'accumulo di una anormale proteina TDP-43 potrebbe servire come biomarker per la SLA sporadica. I casi di SLA familiare associata a mutazioni del gene TARDBP ha dimostrato di essere ereditata come carattere autosomico dominante. Nella autosomica dominante un cambiamento di un solo gene da una coppia di geni è necessario perchè la persona sia colpito da SLA . Ogni volta che un individuo ha un bambino vi è una probabilità del 50% di trasmettere la copia del gene con il cambiamento ma anche la probabilità del 50% di trasmettere la copia senza la modifica. Studi condotti in Germania e in Giappone ha rilevato TDP-43 nel liquido cerebro spinale e ha trovato livelli di TDP-43 in alcuni pazienti con SLA sporadica. Un' altro studio ha rilevato che la proteina TDP-43 è presente in campioni di sangue e che i livelli sono elevati in alcuni malati di FTD. Questo dimostra che come test diagnostico per SLA e FTD la proteina TDP-43 può essere rilevato nei fluidi corporei come sangue e csf. La TDP-43 può essere utilizzata come obbbiettivo terapeutico per sviluppare nuove strategie per SLA e FTD [156].

Figura 93: Granuli di RNA