Sono stati effettuati uno studi su animali per sviluppare nuove piccole molecole che riducono la SOD1. Murakami et al hanno identificato 9.600 piccole molecole e di queste ne sono state analizzate 325 ma solo 2 hanno dimostrato selettività e downregulation della proteina SOD1 [173]. Tra questi il composto 052C9, (Figura 115), è stato scelto per ulteriori saggi ed è stato osservato che esso riduce la fosforilazione del fattore di trascrizione N2f2, un attivatore noto di geni che inducono stress cellulare e una upregulation della trascrizione di SOD1. Wright et al hanno analizzato oltre 30.000 molecole per ridurre SOD1 e hanno individuato 20 composti per i quali l'attività è stata confermata e sono stati valutati anche per la loro citotossicità. Il composto 7687685 (Figura 115) ha dimostrato di ridurre sia i livelli endogeni della proteina SOD1 nelle cellule umane e di reprimere diversi altri geni implicati nella SLA. Tuttavia studi in vivo su topi G93A hanno dimostrato che questo composto riduce i livelli della proteina SOD1 nel midollo spinale solo del 5%. Questo composto si è rilevato tossico a dosi maggiori e quindi è improbabile che possa essere usato per curare i malati SLA.
Sono sorti dati dubbi sulla capacità della Primetamina (Figura 5) di ridurre i livelli di SOD1. Lange et al hanno riportato che vi era una riduzione dei livelli di SOD1 nelle cellule umane coltivate e trattate con Primetamina, per cui è stao eseguito uno studio pilota su 16 pazienti malati di SLA [174]. In questo studio sono stati
analizzati campioni di sangue e liquor di pazienti trattati con il Primetamina per 18 settimane ed è stato osservato che i livelli di SOD1 erano ridotti nel QCS e nei leucociti di questi individui. I risultati sono stati confermati sia in cellule in coltura che in topi trattati con Primetamina. Al contrario, in questi studi è stato trovato che le concentrazioni di Primetamina neccessaria per ridurre l'attività trascrizionale del promotore SOD1 del 42% ha causato una riduzione del 68% della vitalità cellulare portando cosi alla conclusione che la riduzione di SOD1 era dovuta alla citotossicità aspecifica.
In altri tipi di cellule, e in altri animali, la Primetamina era in grado di ridurre i livelli di SOD1 rispetto ai controlli. Questi risultati contrastanti erano dovuti alla differenza nel modo in cui i livelli di proteina SOD1 sono stati valutati ma anche a causa delle differenze tra i campioni di liquido umani e del topo. Saranno necessari ulteriori studi per valutare gli effetti del trattamento con primetamina sull'espressione delle proteine SOD1 e soprattutto valutare se il farmaco è in grado di attenuare la SLA.
Figura 115: struttura molecolare di composti che riducono l'espressione di SOD1
Le mutazioni SOD1 portano a tossicità cellulare non attraverso la perdita della funzione delle proteine SOD1 ma piuttosto attraverso un guadagno della funzione tossica, per cui l'aggregazione di SOD1 mutata a livello intracellulare portano a disfunzione della cellula. Per cui composti che riducono l'aggregazione proteica SOD1 possono essere in grado di proteggere la cellula da danni. Benmohamed ha sviluppato una strategia di scrrening per analizzare la capacità di piccole molecole per ridurre aggregati SOD1 in un modello di coltura cellulare e questa selezione ha portato a identificare tre serie di composti selezionati in base alla loro capacità
di ridurre aggregati proteici SOD1 [175]. Questi composti sono: ASP, CHD, e PYT.
Figura 116: formule di struttura di ASP, CHD, PYT
I derivati sono stati sottoposti a ottimizzazione strutturale e alcuni dei omposti ottenuti sono poi stati valutati in saggi farmacocinetici (PK). Due composti ASP, che hanno dimostrato di avere effetto sull'aggregazione SOD1. Su questi sono stati eseguiti studi metabolici ed effettuate ulteriori modifiche strutturali per aumentare la stabilità e la potenza dei derivati ASP. Infatti il gruppo tioetereo è stato sostituito da una funzione eterea e questo ha portato all'identificazione di un nuovo pirazolone con scaffold arilossanico (AOP) (composto13). Il composto 13 ha mostrato alta attività nei saggi cellulari ed un profilo farmacocinetico promettente compresa la buona penetrazione della barriera ematoencefalica ed è stato testato in un modello di topo transgenico G93A SOD1. In topi trattati con il composto 13 mediante iniezione intraperitoneale (ip) di 20mg/kg al giorno, a partire da 6 settimane di età, si è potuto osservare un aumento del 13,3% della durata della vita rispetto al controllo e questo ha suggerito che il derivato AOP è un composto potenzialmente adatto per il trattamento della SLA. SAR relative ai
composti CHD hanno portato allo sviluppo del composto 15 con una maggiore permeabilità neuronale e potenza rispetto ai composti 11 e 14. Il composto 15 ha portato ad un aumento del 90% in attività nei neuroni corticali primari, per questo motivo la molecola è stata testata in topi transgenici SOD1 G93A che sono stati trattati giornalmente con 30mg/kg del composto. È stato osservato un aumento del 13% della durata della vita degli animali trattati rispetto al controllo. Le SAR sui derivati PYT hanno portato all’ottenimento del composto 12 con proprietà adatte il trattamento terapeutico della SLA. Sono state effettuate delle modifiche sullo scheletro dei composti PYT ed i derivati ottenuti sono stati testati sia nel saggio di citotossicità ma anche nel saggio di aggregazione SOD1. Il composto 16 è risultato molto attivo in entrambi i saggi e inoltre ha dimostrato alta potenza e bassa tossicità, un’eccellente stabilità e solubilità plasmatici. Inoltre è in grado di attraversare la barriera ematoencefalica ed ha una buona biodisponibilità orale. Una strategia alternativa per prevenire l'aggregazione SOD1 è stata impiegata da RAY et al, che hanno progettato piccole molecole per stabilizzare il dimero nativo SOD1, teorizzando che la monomerizzazione di SOD1 possa servire alla formazione di aggregati.. Sono stati trovati quindici composti che hanno inibito l'aggregazione della proteina SOD1, purtroppo è stato visto che questi composti si legano con maggiore affinità alle proteine del sangue rispetto al SOD1, suggerendo che questi composti possono avere una attività off-target [ 176]
Sei di questi composti sono stati testati positivamente e hanno indicato che questi possono essere ottimi punti di partenza per lo sviluppo di farmaci attivi nella SLA.