per via sottocutanea nei topi maschi SOD1 G93A mutanti 75 giorni dopo la

nascita. Ai topi SOD1G93A sono state asportate le aree del gastrocnemio (GN) e tibiale anteriore (TA) dei muscoli e sono state trattate con DHT dando un aumento del 32% in peso del muscolo GN e un aumento del 43% del muscolo TA rispetto ai controlli di animali non trattati. Interessante notare che il trattamento con il composto 36 aumenta i livelli di insulina-like growth factor (IGF) che induce la crescita e la differenziazione dei mioblasti, mentre contemporaneamente diminuisce l'espressione di muscolo di barrette1 (MURF-1), una proteina che può indurre atrofia muscolare. L'up-regulation di IGF-1 e 2 e la down-regulation di MURF-1 corrispondevano con modesti incrementi delle prestazioni in test funzionali tra cui il test rotarod e l'analisi dell'andatura. I topi SOD1G93A trattati con DHT hanno mostrato una perdita assonale e la morte del motoneurone leggermente diminuite rispetto ai controlli. Nonostante ciò, in uno studio è risultato che gli androgeni hanno poco effetto sui modelli di SLA nei topi trangenici SOD1G93A che sono stati gonadectomizzati e trattati con il neurosteroide deidroepiandrosterone (DHEA) 37 somministrato prima della comparsa dei sintomi. Ma il trattamento con questo composto non ha portato effetti benefici e questo suggerisce che gli steroidi hanno uno scarso effetto sulla

SLA. Questi esperimenti hanno mostrato un dimorfismo sessuale nella SLA; maschi e femmine mostrano differenze nell’insorgenza dei sintomi e nella progressione della malattia. Tra i pazienti affetti da SLA, le donne sono state meno segnalate rispetto agli uomini.

CAPITOLO 22

LA VACCINAZIONE[183]

Figura 123: Effetti terapeutici di immunizzazione con SOD1 mutata in modelli murini di

sla.

Ci sono prove emergenti dell'esistenza di percorsi di secrezione della superossido dismutasi (SOD1) mutata legati alla SLA e della neurotossicità dovuta alla SOD1 mutante extracellulare. Questa evidenza ha portato a valutare protocolli di immunizzazione che mirano a ridurre la quantità SOD1 extracellulare mutata nel tessuto nervoso nel modello di topo con SLA, utilizzando la proteina ricombinante batterica purificata di SOD1 mutante come immunogeno. In primo luogo la vaccinazione è stata testata su un ceppo di topi SOD1 G37R con SLA a esordio tardivo e sono stati riscontrati livelli di SOD1 mutata 4 volte superiore rispetto ai

livelli normali di SOD1. Le iniezioni ripetute di SOD1mutante con una iniezione di richiamo finale prima dei sintomi a 6 mesi di età sono state efficaci nel ritardare l'insorgenza della malattia e estendere la durata della vita dei topi SOD1 G37R più a lungo di 4 settimane.. Al contrario, questo approccio di vaccinazione non è riuscito a conferire una protezione significativa nei topi G39A SOD1 sovraespressione elevata di SOD1 mutata. Ciò nonostante, una immunizzazione passiva attraverso l'infusione intraventricolare di anticorpo SOD1 purificato è riuscito ad alleviare i sintomi della malattia e prolungare la durata della vita dei topi G93A SOD1. Questi risultati indicano che l'immunizzazione potrebbe essere una strategia nel trattamento della SLA familiare causata da mutazioni di SOD1. E' stato testato un approccio di vaccinazione in un modello di topo che iperesprime mutante SOD1G37R a livelli moderati (circa 4 volte superiore al livello endogeno di SOD1). Come antigene per l'immunizzazione è stato utilizzato un ricombinante privo di metallo SOD1 mutante umano purificato da Escherichia coli. L' immunizzazione dei topi SOD1G37R sia con 50mcg di proteina SOD1 mutante ricombinante è stato avviato a 2 mesi di età seguiti con due iniezioni sottocutanee a intervalli di 3 settimane. L' ultima iniezione di antigene/adiuvante è stata effettuata a 6 mesi di età.

Figura 124: l'insorgenza ritardata e l'estensione della durata della vita nei topi vaccinati

G37R SOD1.a) Programma di immunizzazione. Ai topi sono stati iniettati 4 volte i vaccini, partendo da 2 mesi di età. Il sangue è stato prelevato per le analisi di titolazione a 4 mesi di età e nella fase finale. b) Analisi rotarod dei topi vaccinati. Il tempo sulla rotarod è stata determinata per topi G37R SOD1 iniettati con ricombinante (rec) G39A/Adjuvant (n=8) o soluzione salina/adiuvante (n=7). La vaccinazione ha migliorato notevolmente le prestazioni del motoneurone. c) L'immunizzazione ritarda l'insorgenza (come definito dalla perdita del 30% delle prestazioni del motore) nei topi G37R SOD1 immunizzati con rec G93A/ADJUVANT rispetto ai topi trattati con soluzione salina /adiuvante. d) L'immunizzazione aumenta la durata della vita dei topi SOD1G37R. e) Il numero dei motoneuroni rimanenti aumenta nei topi vaccinati nella fase finale della malattia. Dopo che le sezioni sono state colorate con blu di toluidina, i motoneuroni sono

stati contati in quattro sezioni da quattro topi vaccinati e tre topi di controllo iniettati con soluzione salina/adiuvante. f) L'immunoistochimica del midollo spinale allo stadio terminale in topi trasgenici G37R SOD1 immunizzati con proteine rec G39A SOD1 (superiore)o soluzione fisiologica (inferiore), utilizzando anticorpi contro NeuN.

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