Microbiota intestinale nella malattia di Alzheimer

Ultimamente è sempre più apprezzato il fatto che il microbiota intestinale, la barriera mucosa e il sistema neuro-immune enterico debbano essere considerati come una rete integrata di interazione reciproca.

Nei seguenti paragrafi verranno illustrati i dati più importanti provenienti da studi clinici e preclinici sulle alterazioni dell'interazione tra microbiota intestinale, barriera mucosa intestinale e sistema neuro immune enterico nella MA.

4.2.5. Evidenze cliniche

L'aumento delle prove conferma la tesi secondo cui le alterazioni della rete enterica batterica-neuro-immune possono contribuire alla patogenesi della malattia di Alzheimer [153], [154], [155]. In particolare, è stato ipotizzato che i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale possano promuovere l'accumulo di proteina β amiloide (Aβ) (un segno distintivo di MA), che a sua volta potrebbe modellare le risposte neurogeniche / infiammatorie enteriche, periferiche e contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel SNC [156]. Questo studio si è concentrato su alcuni batteri che costituiscono la flora microbica intestinale che può produrre la proteina amiloide che, una volta generata, attiva ipoteticamente una risposta infiammatoria sistemica che compromette complesse funzioni cerebrali, come l'apprendimento e la memoria. Studi clinici hanno dimostrato che, nei pazienti anziani con deficit cognitivo con amiloidosi cerebrale , vi è una minore abbondanza nell'intestino di E. rectale e B. fragilis, due specie batteriche che hanno un'attività antinfiammatoria, rispetto a una maggiore quantità di generi pro-infiammatori come Escherichia / Shigella. Secondo questi risultati, alcuni studi clinici hanno dimostrato che l'integrazione con probiotici formati da Lactobacillus e Bifidobacterium ha migliorato le funzioni cognitive, sensoriali ed emotive nei soggetti con MA. Inoltre, alcuni prodotti vegetali, in particolare i polifenoli dietetici , si sono dimostrati in grado di ripristinare la disbiosi e pertanto il loro ruolo prebiotico potrebbe essere

72

efficace nel contrastare l'insorgenza della MA, indipendentemente dalla loro attività di eliminazione dei radicali liberi o dal miglioramento della risposta allo stress cellulare. Una delle più grandi novità recenti nel campo delle malattie neurodegenerative è la possibilità di prevenire o rallentare la progressione della MA con agenti, come probiotici e prebiotici, che agiscono al di fuori del sistema nervoso centrale [157].

Inoltre, in riferimento alle ipotesi precedenti, la proteina Aβ, considerata anche come particella nucleata proteica prionica, può muoversi attraverso i neuroni mienterici e diffondersi al SNC, attraverso l'asse neuronale dell'intestino-cervello, contribuendo direttamente alla patogenesi di MA [158], [159].

A sostegno di questa ipotesi, uno studio all’avanguardia ha mostrato che, nei pazienti con malattia di Alzheimer, i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale, caratterizzati principalmente da un’espansione di Bacteroides e Blautia, una ridotta abbondanza relativa dei generi SMB53 e Dialister, correlati ad un aumento del liquido cerebrospinale di proteina 1 Chitinase-3-like e livelli fosforilati di Tau (p-Tau), un ridotto rapporto Aβ42 / Aβ40, indicavano una maggiore gravità della malattia e carico di amiloide nel cervello [160]. Leblhuber et al [161] hanno osservato segni di infiammazione enterica, caratterizzata da un aumento dei livelli di calprotectina fecale nei pazienti con MA. Per quanto riguarda la deposizione di proteina Aβ, precursore della proteina Aβ (AβPP) e p-Tau nell'intestino, l'evidenza clinica è scarsa e conflittuale, dal momento che solo due studi hanno documentato la loro presenza nei tessuti intestinali in pazienti con MA. Joachim et al [162] hanno mostrato la presenza di deposizione di proteina Aβ nei tessuti rettali in due pazienti con MA. Tuttavia, questa proteina è stata rilevata anche in uno di due soggetti anziani normali. Più recentemente, Puig et al. hanno osservato un'aumentata reattività immunitaria delle proteine Aβ, AβPP e p-Tau in undici pazienti con MA. In particolare, tutti questi pazienti hanno mostrato la presenza di proteina Aβ, mentre l'immunoreattività per AβPP e p-Tau è stata rilevata solo in cinque soggetti [163]. Tuttavia, la mancanza di dati riguardanti gli schemi dell'espressione della proteina Aβ nell'intestino dei soggetti controllati non consente di concludere che gli incrementi della proteina Aβ, della AβPP e della p-Tau si verificano nei tessuti enterici dei pazienti con MA. A

73

tale riguardo, dovrebbero essere implementate indagini specifiche per chiarire meglio la presenza di Aβ, AβPP e proteina p-Tau in entrambi i pazienti con MA e controlli su pazienti sani abbinati. Inoltre, i risultati sotto riportati, ottenuti in diversi studi clinici, non consentono di stabilire una relazione diretta tra disbiosi intestinale, Aβ intestinale, accumulo di p-Tau e infiammazione enterica. Cosa più importante, è difficile fornire prove dirette che tali alterazioni rappresentano uno dei primi segni di MA che potrebbero contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale(Fig.14).

Figura 14 Sintesi delle alterazioni intestinali nei pazienti con malattia di Alzheimer

4.2.6. Evidenze precliniche

Numerosi tentativi di ricerca, finalizzati a chiarire il ruolo della rete enterica batterica-neuro-immune, nonché della proteina intestinale Aβ o dell'accumulo di p- Tau nell'insorgenza della neuroinfiammazione centrale, sono stati effettuati in modelli pre-clinici di MA. In uno studio recente, Brandscheid et al. [164] hanno osservato che i topi 5xFAD (un modello transgenetico di MA) mostravano cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale, principalmente caratterizzati da un aumento del rapporto Firmicutes / Bacteroidetes e dall'accumulo di AβPP intestinale sin dalle prime fasi della malattia. In uno studio successivo, Shen et al. [165] hanno dimostrato che la disbiosi intestinale nei topi APP / PS1 (un modello genetico di MA) era correlata ad un aumento dei livelli di proteina Aβ nel SNC e alterazioni comportamentali rilevanti. Inoltre, Harach et al. [166] hanno riportato che l'impoverimento dei batteri enterici nei topi AβAPP (un modello

74

genetico di MA) era associato a una diminuzione dei livelli centrali della proteina Aβ e il successivo trapianto con microbiota da topi MA ha aumentato il carico di amiloide nel cervello, suggerendo così che le alterazioni dei batteri enterici nella MA contribuiscono all'accumulo di proteina Aβ nel SNC. Tuttavia, questi autori non hanno valutato se, oltre alle alterazioni dei batteri enterici e l'aumentata espressione di AβPP, gli animali con MA erano caratterizzati dall'accumulo intestinale di Aβ e p-Tau e / o da risposte neurogeniche / infiammatorie enteriche che potevano contribuire alla patologia del SNC. A questo proposito, è stato riportato che topi TgCRND8 (un modello genetico di MA) mostravano una maggiore espressione di proteina Aβ intestinale, attivazione di vie infiammatorie intestinali, perdita neuronale e attivazione gliale intestinale nelle prime fasi della malattia prima dell'inizio della neuroinfiammazione nel SNC, sostenendo in tal modo l'opinione che l'accumulo di proteine Aβ intestinali e le risposte neurogeniche / infiammatorie enteriche rappresentano uno dei primi eventi nella MA [167]. Inoltre, due studi recenti hanno riportato che i topi APP / PS1 mostravano un'aumentata espressione di proteina Aβ e p-Tau, attivazione delle cellule immuno- infiammatorie intestinali e riarrangiamenti della codifica neuronale enterica, caratterizzata da una diminuzione della sintesi dell'ossido nitrico neuronale (nNOS) e colina acetiltransferasi (ChAT), supportando così l'ipotesi che, nella MA, l'accumulo intestinale di proteina Aβ e p-Tau possa modellare risposte periferiche neurogeniche / infiammatorie e contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel SNC [168], [169].

In un recente studio, una nuova formulazione di batteri lattici e bifidobatteri (SLAB51) è stata somministrata a un modello murino a tripla transgenicità della malattia di Alzheimer, (3xTg-MA), al fine di studiare i potenziali effetti benefici sulla modulazione della composizione del microbiota intestinale, su deficit di memoria, deposizione della placca amiloide e compromissione della proteolisi neuronale. Per ottenere informazioni sugli effetti del microbiota sulla progressione della MA è stata anche studiata la modulazione dell'asse intestino-cervello al momento della somministrazione del mix probiotico. Alla fine dello studio sono state fornite prove del fatto che modulando il microbiota intestinale sono influenzati diversi percorsi, ritardando di conseguenza la progressione della MA. Nei topi

75

3xTg-MA, SLAB51 ha cambiato la composizione del microbiota intestinale e dei suoi metaboliti, interferendo positivamente con citochine infiammatorie, concentrazione di ormoni intestinali e proteolisi, riducendo il carico di beta amiloide e migliorando la funzione cognitiva, dimostrando un ruolo nella prevenzione e nel trattamento della MA e supportando l’ idea della modulazione del microbiota intestinale per contrastare i processi patogeni di tipo MA mediati dalla Aβ [170].

Nel complesso, i dati attuali provenienti da studi umani e pre-clinici permettono di ipotizzare che i cambiamenti nel microbiota intestinale e l'accumulo di proteine Aβ e p-Tau nei tessuti intestinali promuovono le risposte enteriche neurogeniche / infiammatorie e contribuiscono alla patologia del SNC. Tuttavia, le prove attuali non consentono di stabilire una relazione causale tra disbiosi intestinale, accumulo di Aβ e p-Tau intestinale, infiammazione enterica e patologia di Alzheimer. Inoltre, vi è una mancanza di dati sulle possibili alterazioni morfofunzionali della barriera epiteliale intestinale nella MA, che potrebbero contribuire alla traslocazione batterica nella lamina propria con conseguente attivazione di vie immunitarie / infiammatorie. Pertanto, sono attese indagini approfondite basate su approcci integrati / olistici per comprendere la relazione tra disbiosi intestinale, accumulo intestinale delle proteine Aβ e p-Tau e risposte neurogeniche / infiammatorie enteriche nelle prime fasi di MA, nonché per chiarire come tali alterazioni potrebbero contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale(Fig.15).

76

Modelli sperimentali

Alterazioni del microbiota intestinale, della barriera epiteliale intestinale e del sistema neuro-immune

enterico Topo APP/PS1 (modello genetico

di MA)  ↓Livelli fecali di AGCC  ↑Precursore proteina β amiloide, proteina β amiloide, BACE-1 e P-Tau

 Infiammazione intestinale (↑livelli luminali di IgA, COX-2 e TIMP-1)

 ↑Macrofagi intes nali CD68

 ↓Ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS) e colina acetiltransferasi (ChAT)

Topo TgCRND8 (modello

genetico di MA)  ↑Precursore della proteina β amiloide nei neuroni mienterici  Infiammazione intestinale(↑TLR-4)

 Attivazione gliale enterica (↑GFAP, nes na)  Perdita enterica neuronale

 Atrofia delle cellule muscolari lisce Topo 5xFAD (modello

transgenico di MA)  ↑Rapporto Firmicutes/Bacteroides  ↑ accumulo di AβPP

77

Interpretazione schematica della comunicazione intestino-cervello (Fig.16)

Fig.16 Diagramma che mostra i percorsi intestinali fisiopatologici comuni alle principali malattie neurodegerative, tra cui MP e MA. In particolare, la disbiosi intestinale e una maggiore permeabilità intestinale possono promuovere eventi neuro / infiammatori enterici che, oltre all'induzione di disfunzioni motorie intestinali, potrebbero innescare, attraverso le vie ascendenti intestino-cervello, neuroinfiammazione e neurodegenerazione nel

sistema nervoso centrale. In questa impostazione, la neuroinfiammazione centrale e la successiva neurodegenerazione potrebbero contribuire ad esacerbare le condizioni neuro-immuni / infiammatorie enteriche attraverso percorsi discendenti cervello-intestino, in una sorta di circuito positivo che potrebbe guidare la cronicizzazione del processo neuroinfiammatorio in corso. Malattia di Alzheimer MA, malattia di Parkinson MP.

78

Conclusioni

Dati attuali provenienti da studi clinici suggeriscono che la disbiosi intestinale e l'infiammazione enterica potrebbero rappresentare un percorso comune alle malattie neurodegenerative. Anche se ogni malattia effettivamente presenta caratteristiche cliniche, neuropatologiche e genetiche distinte, i pazienti con MP e MA sono caratterizzati da variazioni significative nella composizione del microbiota intestinale e da segni di infiammazione enterica sin dalle prime fasi della malattia. Oltre all'induzione delle disfunzioni intestinali, questi cambiamenti potrebbero favorire condizioni di infiammazione periferica cronica e contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale. A sostegno di questa teoria, è stato dimostrato che le alterazioni dei batteri intestinali e le risposte neurogeniche / infiammatorie enteriche nei pazienti con MP e MA sono correlate alla gravità della malattia. Inoltre, i pazienti con MP mostrano una permeabilità intestinale alterata che sembra contribuire all'insorgere dell'infiammazione enterica. Tuttavia, gli studi clinici non consentono di stabilire una relazione causale e reciproca tra disbiosi intestinale, permeabilità intestinale alterata e infiammazione enterica. Inoltre, non è chiaro se le alterazioni della rete enterico batterica-neuro-immune precedano e/o seguano l'insorgenza di neurodegenerazione centrale. A questo proposito, lo sviluppo di modelli sperimentali di malattie neurodegenerative, tra cui MP e MA ha permesso di comprendere meglio il ruolo fisiopatologico della rete enterica di batteri neuro- immuni nell'insorgere della neurodegenerazione centrale. Infatti, anche se ciascun modello sperimentale presenta caratteristiche patofisiologiche distinte per ogni malattia, la disbiosi intestinale, la permeabilità intestinale alterata e le risposte enteriche neurogeniche / infiammatorie si verificano come eventi precoci nella MP e nella MA. Inoltre questi processi, oltre a determinare disfunzioni intestinali, sembrano contribuire alla neuroinfiammazione e alla neurodegenerazione nel SNC. A sostegno di questa visione, è stato visto che la manipolazione farmacologica o la deplezione del bersaglio del microbiota intestinale negli animali con MP e MA contrastano la progressione della neurodegenerazione centrale così come i sintomi intestinali e periferici.

79

Sulla base delle considerazioni sopra riportate e unendo le evidenze pre-cliniche e cliniche ottenute dalla mia rassegna della letteratura, è ipotizzabile che nelle primissime fasi della malattia i pazienti con disturbi neurologici siano caratterizzati da interazioni anomale tra microbiota intestinale, barriera intestinale e sistema neuro-immune enterico, che porta all'attivazione infiammatoria enterica. Negli stadi successivi della malattia, l'attivazione infiammatoria enterica / immunitaria innesca probabilmente eventi di infiammazione e neurodegenerazione nel SNC attraverso le vie ascendenti dell’asse intestino-cervello. In questo contesto, la neuroinfiammazione centrale e la successiva neurodegenerazione potrebbero contribuire ad aggravare le risposte enterico neuroimmuni / infiammatorie, attraverso le vie discendenti dell’asse cervello-intestino, generando così una sorta di ciclo positivo che potrebbe guidare la cronicizzazione dei processi neuroinfiammatori e neurodegenerativi centrali e periferici in corso. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base delle alterazioni della rete enterica di batteri neuro- immuni nei disturbi neurologici e il loro ruolo nella fisiopatologia della neurodegenerazione centrale rimangono scarsamente compresi. Notevoli lacune nelle nostre conoscenze sui fattori che potrebbero influenzare le interazioni tra il microbiota intestinale, la barriera intestinale e il sistema enterico neuroimmune sia in condizioni fisiologiche che in presenza di disturbi neurologici riguardano il sesso, il background genetico e / o fattori ambientali, come la dieta. Nonostante prove consistenti che maschi e femmine mostrino differenze di genere nel sistema immunitario e nella composizione del microbiota intestinale [171], [172] e che le differenze di genere sono rilevanti nei disturbi neurologici, tra cui MP e MA, l'influenza del genere nell'interazione tra batteri enterici e neuroimmuni rimane poco comprensibile.

In riferimento allo studio di Carmen Haro et al. [173] la composizione del microbiota intestinale sembra essere più influenzata dai segnali ambientali e dietetici che dai fattori genetici.

Infatti, diverse linee di evidenza supportano l’ipotesi che la dieta può modificare la composizione del microbiota intestinale, con conseguenti alterazioni della

80

permeabilità intestinale e attivazione delle cellule immunitarie/infiammatorie che, a loro volta, potrebbero innescare eventi di infiammazione e neurodegenerazione nel SNC attraverso le vie ascendenti dell’asse intestino-cervello [174], [175], [176]. Pertanto, interventi basati sull'alimentazione e/o una terapia diretta con prebiotici e probiotici, potrebbero offrire un’ opportunità per integrare le tradizionali terapie della MP e superare alcune delle loro carenze, inclusa la mancanza di efficacia per i sintomi/disfunzione gastrointestinale (Fig.16).

Tuttavia, manca una visione integrata sull'impatto della dieta nelle alterazioni microbiota intestinale e nelle risposte neuro-immunitarie nella MP e nella MA (Fig.17).

Fig.17 I precursori e cofattori dei fosfolipidi nella dieta possono aumentare la formazione e la funzione della membrana neuronale e ridurre l'infiammazione, influenzando sia SNE che SNC e riducendo le anomalie motorie e non motorie nella MP. Probiotici , prebiotici e / o sinbiotici potrebbero influire sulla composizione del microbiota intestinale , migliorare l'integrità epiteliale intestinale e ridurre la risposta pro-infiammatoria, influenzando l'inizio o la progressione del processo neurodegenerativo .

In conclusione, sulla base delle conoscenze attuali, restano da affrontare alcune questioni importanti:

81

(1) Qual è il ruolo effettivo della barriera epiteliale intestinale nell'attivazione enterica immune/infiammatoria nelle prime fasi delle malattie neurodegenerative? (2) Essa rappresenta il crocevia tra i cambiamenti nel microbiota intestinale e l'attivazione infiammatoria enterica/immunitaria?

(3) Come può l'attivazione delle cellule immunitarie/infiammatorie intestinali innescare eventi di neuroinfiammazione e neurodegenerazione nel SNC?

(4) Qual è il ruolo dell'asse intestino-cervello batterico-neuronale-immunitario nell'insorgenza della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione nel SNC? (5) Le alterazioni della rete enterica batterica-neuro-immune possono rappresentare biomarcatori precoci delle principali malattie neurodegenerative?

(6) Qual è la relazione tra genere, microbiota intestinale, barriera della mucosa intestinale e interazione del sistema neuro-immune enterico e disturbi neurodegenerativi?

(7) Può il background genetico dei pazienti con MP e MA influenzare il microbiota intestinale, la barriera della mucosa intestinale e l'interazione del sistema neuro- immune enterico?

(8) Qual è l'impatto di fattori ambientali, come la dieta, nelle alterazioni della rete enterico-batterica-neuro-immune, disfunzioni intestinali e malattie neurodegenerative?

Per chiarire questi punti, la ricerca dovrebbe essere indirizzata a indagare, attraverso approcci olistici, le alterazioni del microbiota intestinale, la barriera epiteliale intestinale e il sistema neuro-immune intestinale che interagiscono sia nei modelli animali indotti geneticamente che in quelli indotti da tossine sin dalle prime fasi della malattia. Dovrebbero inoltre essere implementati studi traslazionali su pazienti maschi e femmine nelle primissime fasi delle malattie, nonché in soggetti con disfunzioni GI e predisposizione genetica a sviluppare malattie neurodegenerative. Svelare questi aspetti potrebbe aprire la strada a importanti cambiamenti per la prevenzione e la gestione clinica dei principali disturbi neurologici e delle disfunzioni intestinali correlate.

82

Inoltre, sulla base di queste considerazioni, emerge un altro quesito fondamentale: La modulazione farmacologica del microbiota intestinale, della barriera mucosa intestinale e/o del sistema immunitario enterico può conferire benefici alle malattie neurodegenerative centrali in termini di prevenzione, cura o mantenimento della remissione?

In risposta a questa domanda possiamo ipotizzare delle prospettive sulle quali le ricerche future potrebbero focalizzarsi: la prima riguarda la modulazione del microbiota tramite l’utilizzo di probiotici, prebiotici e simbiotici.

Questi ultimi appaiono per molti aspetti approcci terapeutici attuali e promettenti in quanto potrebbero influire sulla composizione del microbiota intestinale e possibilmente migliorare l'integrità epiteliale intestinale e ridurre la risposta pro- infiammatoria, influenzando l'inizio o la progressione del processo neurodegenerativo .

Tuttavia, la variabilità nelle ricerche finora condotte riguardo ceppi, dosaggi e durata del trattamento e le diverse popolazioni di studio che differiscono per sesso, età e indice di massa corporea, non permette di arrivare a conclusioni certe [177]. Inoltre, gli studi futuri su probiotici dovrebbero includere l’analisi del microbiota per poter verificare la loro presenza nella flora intestinale di un sottoinsieme rappresentativo di pazienti esposti, e devono subire la stessa metodologia rigorosa applicata alla sperimentazione clinica in campo farmacologico. I prebiotici sembrano essere opzioni terapeutiche promettenti per le malattie gastrointestinali, ma sono necessari ulteriori studi, con più ampie popolazioni di studio, che permettano di stabilirne efficacia, modalità e durata di trattamento.

Un altro target farmacologico sul quale le ricerche potrebbero concentrarsi consiste nella sintesi di principi attivi adibiti al rafforzamento della barriera epiteliale intestinale. Come abbiamo precedentemente affrontato, cambiamenti specifici nella composizione del microbiota intestinale possono portare ad una rottura della barriera epiteliale intestinale e ad un aumento della permeabilità della mucosa, con conseguente traslocazione batterica nella mucosa e possibile disseminazione sistemica.

83

La scoperta ad esempio nel 2014 della proteina JAM-A che contribuisce a mantenere unite le cellule che compongono la barriera intestinale, potrebbe aprire nuovi importanti scenari clinici [178]. Una prospettiva futura potrebbe consistere nella messa a punto di farmaci che, aumentando la presenza di questa fondamentale proteina, permettano di rafforzare l’azione difensiva della barriera intestinale. Il muco svolge ruoli importanti nella funzione di barriera intestinale e nella simbiosi con il microbiota e una sua alterazione nella composizione e / o secrezione è associata a malattie nell'uomo. Considerando che un aumento della produzione di muco è indicativo di una risposta sana dell'epitelio intestinale, una costante produzione di muco è continuamente osservata nelle malattie infiammatorie intestinali. Da questo deduciamo che una modulazione della produzione di muco, potrebbe essere un ulteriore target sul quale la ricerca potrebbe focalizzarsi. Tale potenziale osservato, se confermato, potrebbe effettivamente contribuire a conseguenti benefici come una maggiore difesa della barriera intestinale, una minore suscettibilità alle infezioni e una migliore regolazione dell'assorbimento.

Ci sono sempre più prove che l’infiammazione sia un importante meccanismo di guida nella progressione delle malattie neurologiche anche se non costituisce probabilmente l’evento iniziale, ma è importante per la neurodegenerazione che segue.

Intervenire quindi sui processi infiammatori potrebbe essere un ulteriore proposito di ricerca scientifica futura. Da qualche anno, in via sperimentale, i ricercatori della Emory University School of Medicine stanno testando a livello preclinico un farmaco anti-infiammatorio che sembra essere in grado di proteggere i neuroni e ridurre i deficit motori del Parkinson, indirizzandosi verso il fattore di necrosi tumorale (TNF), una molecola di segnalazione infiammatoria critica.

Tutte le teorie precedentemente proposte rimangono al momento in fase di progettazione o studio preclinico e quello che manca nell’effettivo sono studi clinici per approfondirle, confermarle o smentirle e consentire di conseguenza alla ricerca