Test del micronucleo con blocco della citodieresi (CBMN-cyt) Il test del micronucleo con blocco della citodieresi (cytome) ha permesso d

valutare i potenziali effetti genotossici indotti dalle nanoparticelle di TiO2 pristine, silicate e citrate, e dal materiale di riferimento P25 sulla base di varie tipologie di aberrazioni cromosomiche presenti: micronuclei, ponti nucleoplasmatici ed evaginazioni nucleari; allo stesso tempo, è stata valutata anche la stima degli effetti citostatici e citotossici grazie all’utilizzo dell’indice di replicazione e degli indici apoptotico e necrotico.

4x104 Balb/3T3/pozzetto sono state messe in coltura in piastre da 6 pozzetti da 9.5 cm2 _{di superficie di coltura (DB Falcon, Italia). A 24 ore di incubazione, le} cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di TiO2 NP (10 - 20 - 40 µg/cm2), è stato testato anche il controllo positivo (0.15 µg/mL mitomicina-C). Dopo 44 ore dalla messa in coltura delle cellule sono stati aggiunti 6 µg/mL di citocalasina-B (Sigma-Aldrich, Italia) per garantire il blocco della citodieresi e la formazione di cellule binucleate.

A 7 ore dall’inizio dell’esperimento è stato effettuato il recupero delle cellule: è stato aspirato il mezzo di coltura contenente le TiO2 NP e, dopo opportuni lavaggi con PBS, le cellule sono state tripsinizzate, trasferite in tubi da 15 mL (DB Falcon, Italia) e centrifugate per 10 minuti a 1000 rpm. È stato, quindi, eliminato il surnatante ed effettuato un lieve trattamento ipotonico, risospendendo le cellule per 1 minuto in 5 mL di soluzione ipotonica (KCl 0.075 M) a 37°C. Sono stati aggiunti 400 µL di prefissativo (una soluzione 3:5 di metanolo e acido acetico) al fine di bloccare l’azione della soluzione ipotonica e, dopo aver risospeso le cellule, è stata effettuata una nuova centrifugazione (1000 rpm per

10 minuti). Il surnatante è stato poi rimosso e le cellule sono state risospese in 10 mL di metanolo assoluto e congelate a -20°C.

Al momento dell’allestimento dei vetrini le cellule sono state scongelate e nuovamente centrifugate, per essere poi risospese in fissativo fresco. Circa 80 µL di tale sospensione sono stati depositati su vetrini porta-oggetto precedentemente lavati. Una volta pronti, i vetrini sono stati posti per circa 15 minuti all’interno di vasi di Coplin contenenti una soluzione al % di Giemsa (Sigma-Aldrich, Italia) tamponato a pH 7.4 con Sorensen’s buffer (NaH2PO4; K2HPO4). L’eccesso di colorazione è stato rimosso effettuando un lavaggio in acqua deionizzata e i vetrini sono stati posti ad asciugare all’aria prima di procedere alla lettura dei preparati, effettuata con un microscopio ottico ed un ingrandimento a 4 X. L’analisi dei vetrini ed il conteggio delle cellule è stato eseguito secondo i parametri indicati da Fenech (2007).

3.6.1 Criteri di conteggio delle cellule vitali e citostasi

L’osservazione dei vetrini mediante microscopio ottico consente di individuare cellule vitali mono-, bi- (Figura 5 A) e multi-nucleate con caratteristiche ben precise: citoplasma intatto – senza alcuna interruzione della membrana plasmatica – e nuclei con morfologia regolare. La presenza di eventuali biomarcatori di genotossicità (micronuclei, ponti nucleoplasmatici ed evaginazioni nucleari) non costituisce motivo di esclusione di tali cellule dal conteggio, poiché non sono indicatori di non vitalità cellulare.

Figura 5. CBMN-cyt: esempi di cellule colorate e visualizzate al microscopio. (A) Cellula binuceata; (B) cellula apoptotica; (C) cellula necrotica; (D) Cellula binucleata con MN; (E) cellula binucleata con NPB e MN; (F) cellula binucelata con NBUD.

Il tasso di proliferazione delle Balb/3T3 e gli effetti citostatici indotti in presenza delle TiO2 NP sono stati valutati mediante il calcolo dell’indice di proliferazione cellulare (CBPI) che si ottiene dalla distribuzione del numero di cellule mononucleate (Mono), binucleate (BN) e multinucleate (Poly) secondo la formula:

Per valutare gli effetti citostatici delle TiO2 NP è stato utilizzato anche l’indice di replicazione (RI) che indica il numero relativo di nuclei in colture trattate rispetto alle colture di controllo non trattate e può essere usato per calcolare la % di citostasi mediante la seguente formula:

Rispetto al CBPI, l’indice di replicazione esprime valori in percentuale e ciò consente di paragonare i dati risultanti da diversi esperimenti, purché anche questi esprimano un valore di vitalità cellulare in percentuale.

3.6.2 Criteri di conteggio delle cellule non vitali e citotossicità

La citotossicità indotta dalle TiO2 NP e dai loro rispettivi controlli è stata valutata attraverso l’analisi delle cellule non vitali, ossia di cellule apoptotiche e necrotiche.

Le cellule apoptotiche (Figura 5 B) attuano un processo di morte programmata e sono riconoscibili per la presenza di cromatina condensata nel nucleo (apoptosi precoce) o di piccoli corpi nucleari (apoptosi tardiva). Nelle cellule apoptotiche la membrana citoplasmatica appare intatta e la colorazione della cromatina e del citoplasma è più intensa rispetto alle cellule vitali. L’indice apoptotico, espresso come dato percentuale, è calcolato come:

Per quanto concerne le cellule necrotiche (Figura 5 C), queste vanno incontro a morte cellulare a causa di danni alle membrane cellulari, agli organelli oppure a vie metaboliche essenziali per la loro sopravvivenza. In questo caso vi è uno stato di necrosi precoce, nel quale le cellule mostrano una colorazione citoplasmatica abbastanza chiara con presenza di numerosi vacuoli – principalmente nel citoplasma, talvolta nel nucleo –, membrana citoplasmatica danneggiata e nucleo generalmente intatto; mentre lo stato di necrosi avanzata presenta un citoplasma che appare danneggiato e/o irregolare e la membrana nucleare risulta solo parzialmente intatta con conseguente fuoriuscita di materiale nucleare. Caratteristica è la colorazione delle cellule necrotiche, il cui nucleo e citoplasma, in genere, sono meno intensi rispetto a quelli delle cellule vitali. L’indice necrotico (%) viene calcolato come:

3.6.3 Criteri di valutazione del danno genotossico

Al fine di valutare il danno genotossico indotto in colture di Balb/3T3 da TiO2 NP, per ciascun vetrino sono state analizzate un totale di 1000 cellule binucleate e 1000 cellule mononucleate in cui:

- i nuclei devono essere intatti e situati all’interno di un perimetro citoplasmatico ben definito;

- i due nuclei delle cellule binucleate devono avere la medesima dimensione ed intensità di colorazione, possono toccarsi ma non devono essere sovrapposti. Nel caso in cui sia presente una sovrapposizione dei nuclei, la cellula può essere conteggiata solo se i confini nucleari sono ben definiti;

- il confine citoplasmatico di una cellula deve essere intatto e ben distinguibile dal confine citoplasmatico delle cellule adiacenti.

I micronuclei (MN) sono morfologicamente identici ai nuclei, ma più piccoli: le loro dimensioni sono generalmente comprese tra 1/16 e 1/3 del diametro medio

dei nuclei principali (Figura 5 D). Non sono rifrangenti, quindi sono ben distinguibili da artefatti, come macchie di colorante, e non sono collegati ai nuclei principali con i quali condividono una colorazione di pari intensità. Nel caso di contatto tra MN e nuclei principali, i confini di entrambi devono essere ben distinti in modo da poter stabilire con precisione l’assenza di collegamento tra i due. La frequenza dei MN è ottenuta da mediante la formula:

Con ponte nucleoplasmatico (NPB) si intende una struttura continua, contenente DNA, che collega i due nuclei di una cellula binucleata, la cui colorazione presenta le stesse caratteristiche di quella dei nuclei (Figura 5 E). I NPB hanno una larghezza variabile ma generalmente non superiore ad ¼ del diametro dei nuclei principali. Seppure raramente, è tuttavia possibile visualizzare anche più di un NPB all’interno della stessa cellula binucleata. Una cellula binucleata contenete NPB, inoltre, può presentare anche uno o più MN contemporaneamente. La frequenza di NPB è calcolata come:

Le evaginazioni nucleari (NBUD) hanno la stessa morfologia dei MN, con i quali condividono le stesse caratteristiche di colorazione ma che risultano connessi al nucleo tramite un peduncolo (Figura 5 F). La frequenza delle evaginazioni nucleari è ottenuta secondo la formula: