Che lo squilibrio proNGF/NGF e TrkA/p75NTR possa avere un ruolo nella patogenesi della malattia di Alzheimer è stato evidenziato da diversi modelli murini caratterizzati da inibizione o soppressione della funzione dell’NGF e dei suoi recettori.
3.2.1 I topi AD11
I topi AD11 sono topi transgenici che esprimono anticorpi neutralizzanti anti-NGF, gli anticorpi mAbaD11, nel cervello, e sono la prima dimostrazione che il deficit dell’NGF potrebbe avere un ruolo nella AD [239][240]. Questi topi esprimono gli anticorpi anti- NGF principalmente in età adulta, dopo un normale sviluppo del cervello, per cui rappresentano un ottimo modello per lo studio di una patologia cronica come la malattia di Alzheimer, a differenza dei topi NGF knockout omozigoti che muiono precocemente [241]. I topi AD11 mostrano: compromissione della memoria [239][242][240]; degenerazione dei neuroni colinergici del prosencefalo basale, che parte da 2 mesi di età, progredisce fino a 6 mesi di età, e rimane stabile successivamente [239][243][244]; iperfosforilazione di Tau con formazione di aggregati, a partire da due mesi di età, che comincia dalla corteccia entorinale [50][245], e al microscopio elettronico appaiano morfologicamente simili a quelli che si
38 trovano nel cervello di soggetti con la AD [245]; accumuli di Aβ, a partire da 6 mesi di età, innanzitutto intracellulari, localizzati nei neuriti distrofici dell'ippocampo [245], nei topi più anziani anche extracellulari, sotto forma di placche senili [246].
È interessante notare che nei topi AD11 la deposizione di Aβ si verifica in seguito ad un alterata processazione dell’APP endogena. Questa osservazione permette di definire i topi AD11 come un modello per la forma sporadica della AD, in opposizione ad altri topi transgenici che sovra-esprimono forme mutate di APP umana [247].
Iniezioni intranasali di NGF nei topi AD11, eseguite nelle fasi lievi e moderate della neurodegenerazione, caratterizzate da perdita di neuroni colinergici, accumulo intracellulare di Tau iperfosforilato, aggregazione di Aβ e deficit comportamentali, revertono il deficit colinergico, la sovraespressione di Tau iperfosforilato, gli accumuli di Aβ [248] e i deficit comportamentali [242].
I topi AD11 dimostrano che alterazioni nella segnalazione dell’NGF comportano neurodegenerazione simil-AD.
La neurodegenerazione sarebbe legata al fatto che gli anticorpi usati, gli anti-NGF mAbαD11, legano preferenzialmente l’NGF maturo, comportando una riduzione dell’NGF maturo e un aumento del proNGF, il quale interagendo con il complesso recettoriale p75NTR/sortilina, attiverebbe i meccanismi di neurodegerazione e amiloidogenesi [247].
In aggiunta a tale meccanismo, la neurodegenerazione potrebbe essere legata anche all’espressione di un anticorpo nel cervello, che potrebbe indurre neuroinflammazione e squilibrio immuno-trofico [249].
3.2.2. I Topi MNAC13
L’anticorpo monoclonale mAbMNAC13, primo anticorpo anti TrkA con dimostrate proprietà antagoniste nei sistemi biologici, è un anticorpo diretto contro il recettore TrkA, che inibisce efficacemente il legame dell’NGF a cellule che esprimono il recettore TrkA umano o di ratto [250], legandosi al dominio extracellulare di TrKA, in vitro e in
39 vivo [251] [252]. Si tratta di anticorpi estremamente specifici, che legano solo TrkA, mentre non legano TrkB e TrKC, né p75NTR [250][253]. Partendo dagli anticorpi MNAC13, sono stati realizzati topi transgenici che esprimo anticorpi neutralizzanti anti- TrkA mAbMNAC13 [251] con l’approccio del “neuro-antibody” [254][255]. A differenza dei topi omozigoti per TrkA knockout [212], i topi MNAC13 nascono normalmente e si sviluppano fino all’età adulta, in quanto esprimono gli anticorpi anti-TrkA principalmente in età adulta, nel cervello e anche in altri tessuti come la milza [255]. I topi MNAC13 mostrano [255]: compromissione della memoria visiva e di lavoro più precoce rispetto ai topi AD11; degenerazione dei neuroni colinergici del prosencefalo basale, a partire da due mesi d’età, con una perdita di neuroni superiore rispetto a quella osservata nei topi AD11 della stessa età; accumuli di Aβ nell’ippocampo, a partire da 14 mesi, sia intra che extracellulari, più tardivi e in numero inferiore rispetto ai topi AD 11 della stessa età; assenza di iperfosforilazione e localizzazione anomale di Tau.
I topi MNAC13 dimostrano che l’assenza del segnale di TrkA comporta neurodegenerazione simil-AD, e suggeriscono che la riduzione del segnale NGF/TrkA [255] ha un ruolo nella amiloidogenesi.
3.2.3 I topi AD12
I topi AD12 sono topi ottenuti dall’incrocio dei topi AD10, che esprimono anticorpi anti--NGF (esprimono anticorpi anti-NGF a livello sistemico, hanno un fenotipo che può essere sovrapposto a quello osservato nei topi AD11 [256], ma sono allevati più facilmente rispetto ai topi AD11 e quindi sono più adatti per esperimenti di incrocio), con i topi omozigoti per la mutazione p75NTR exon III, mutazione che annulla la funzione del gene [257]. Si tratta, dunque, di topi omozigoti per una mutazione annullante di p75NRT e che esprimono anticorpi anti-NGF a livello sistemico.
I topi AD12 mostrano [255]: ripresa dei neuroni colinergici rispetto agli AD11, a partire dai sei mesi di età; presenza di deficit della memoria visiva e di lavoro, nonostante la
40 ripresa dei neuroni colinergici; assenza di accumuli di Aβ in tutte le età di osservazione; patologia di Tau, esacerbata e anticipata rispetto ai topi AD10 e AD11, probabilmente responsabile della persistenza del deficit di memoria nonostante la ripresa dei neuroni colinergici.
I topi AD12 supportano l’ipotesi che lo squilibrio nel signaling proNGF/NGF e TrkA/p75NTR sarebbe implicato nella neurodegenerazione simil-AD.
Questo modello, però, suggerisce anche che TrkA e p75NTR sarebbero implicati nella neurodegenerazione simil-AD con ruoli diversi [255]: mentre la deplezione di TrkA sembra essere associata all’amiloidogenesi, l’assenza di p75NTR, in condizioni di deplezione dell’NGF maturo, sembra essere protettiva per la patologia Aβ e implicata nella patologia Tau [228].
Importante sottolineare che il topo AD12 non è privo di p75NTR, in quanto i domini transmembrana e intracellulare sono espressi, la qual cosa potrebbe portare a segnalazioni da parte del recettore, e a squilibri nelle vie di segnalazione neurotrofine/recettori [255].
41 SCOPI DELLA TESI
Lo scopo della mia tesi di ricerca è quello di studiare il fenotipo del topo transgenico Knockout eterozigote per il gene TrkA dal punto di vista della neurodegenerazione e di validarne il fenotipo in vivo come modello murino di neurodegenerazione simil- Alzheimer, dato che diversi modelli murini con inibizione del segnale NGF/TrkA sviluppano neurodegenerazione simil-AD.
Questa caratterizzazione può permetterre non solo di raggiungere ulteriori conclusioni sui meccanismi che, a partire dallo squilibrio proNGF/NGF e TrkA/p75NTR, conducono alle varie lesioni tipiche della malattia di Alzheimer, ma anche di esplorare le diverse attività di TrkA nel sistema nervoso centrale in vivo.
A tale proposito sono andata ad investigare se e come l’assenza di un allele per TrkA può avere un ruolo in quelli che sono gli aspetti tipici della malattia di Alzheimer, indagando il sistema colinergico, l’assetto cognitivo ed emozionale, la patologia Aβ e le popolazioni gliali, sulle quali il ruolo del signaling NGF/TrkA è ancora carente in letteratura.
42 MATERIALI E METODI
1 Animali
Per lo scopo della mia tesi sono stati utilizzati topi TrkA Knockout eterozigoti [TrkA (+/- )] e topi wild-type [WT o TrkA (+/+)] a 2 e 5 mesi di età.
Per ottenere topi TrkA knockout (-/+) è stato costruito un vettore in cui 51 amminoacidi del dominio catalitico di TrkA sono stati sostituiti con il gene Neo orientato nel verso opposto. Sul vettore è stato inserito anche un gene codificante per la timidina-chinasi, per la selezione negativa dei ricombinanti non omologhi.
Il vettore è stato trasfettato in cellule staminali embrionali di topo, e l’avvenuta ricombinazione omologa è stata testata con PCR e Southern-blot.
Agli animali sono state effettuate biopsie della coda per l'analisi genotipica con PCR. I topi sono stati nutriti con cibo e acqua ad libitum.
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le leggi nazionali e internazionali per il benessere degli animali da laboratorio (direttiva UE n. 2010/63 / UE e italiana DL n. 26 2014/04/03).