prosencefalo basale e dello striato ho valutato la densità cellulare dei neuroni colinergici, dopo aver effettuato un’immunoistochimica anti-CAT, a livello di nuclei del setto mediale, benderella di Broca, nucleo basale di Meynert e striato.
I risultati non evidenziano differenze nel numero di neuroni colinergici nelle varie aree analizzate negli animali a 2 mesi di età rispetto ai controlli (figg. 9,10), mentre negli animali a 5 mesi, seppur la differenza non sia statisticamente significativa, si evidenzia un trend di riduzione nei topi TrkA (+/-) rispetto ai topi WT (figg. 11,12).
52 Figura 9. Immunoistochimica anti-CAT di striato (A, B), nucleo basale di Meynert (C, D), nuclei del setto mediale e Benderella diagonale di Broca (E, F) a 2 mesi di età. Le immagini sulla sinistra (A, C, E) sono dei topi WT, mentre quelle a destra (B, D, F) dei topi TrkA (+/-).
53
Figura 10. Gli istogrammi mostrano i valori della densità cellulare dei neuroni colinergici delle varie aree analizzate per i topi TrkA (+/-) e WT a 2 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
Striato Nuclei del Setto Mediale
54 Figura 11. Immunoistochimica ani-CAT di striato (A, B), nucleo basale di Meynert (C, D), nuclei del setto mediale e Benderella diagonale di Broca (E, F) a 5 mesi di età. Le immagini sulla sinistra (A, C, E) sono dei topi WT, mentre quelle a destra (B, D, F) dei topi TrkA (+/-).
55 Figura 12. Gli istogrammi mostrano i valori della densità cellulare dei neuroni colinergici delle varie aree analizzate per i topi (-/+) e WT a 5 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
Striato Nuclei del Setto Mediale
56 2 Valutazione degli aspetti cognitivi
Per valutare gli aspetti cognitivi ho sottoposto i topi TrkA (+/-) e i topi WT al test comportamentale di riconoscimento degli oggetti (ORT) (fig. 13), testando i topi a 5 mesi d’età.
Ho scelto di esprimere i risultati con l'Indice di preferenza: nella seconda fase del test ho considerato il rapporto tra il tempo trascorso ad esplorare l’oggetto B e il tempo totale e, nella terza fase, il rapporto tra il tempo trascorso a esplorare l’oggetto C sul tempo totale trascorso ad esplorare entrambi gli oggetti, cioè rispettivamente B / (A + C) x 100 (%) e C / (A + C) x 100 (%).
Come è possibile vedere in fig. 14, c’è differenza significativa tra i topi TrkA (+/-) e i topi WT a 5 mesi nella seconda fase del test.
I risultati indicano che i topi TrkA (+/-) di 5 mesi di età presentano deficit cognitivi, in particolare di attenzione (seconda fase del test), mentre non mostrano deficit di memoria (terza fase del test).
Figura 13. Rappresentazione grafica delle fasi del test di riconoscimento degli oggetti.
Seconda fase parte 1 e parte 2: valutazione dell’attenzione. Terza fase: valutazione della memoria.
57 Figura 14. Gli istogrammi mostrano la seconda e la terza fase del test di riconoscimento degli oggetti (ORT) in animali TrkA (+/-) e WT a 5 mesi di età.
58 3 Valutazione della patologia amiloide a carico del peptide Aβ
Allo scopo di valutare la presenza della patologia amiloide a carico del peptide Aβ ho effettuato un’immunoistochimica con anticorpo primario anti-Aβ A4, su topi TrkA (+/-) e topi WT a 2 e a 5 mesi di età. L’anticorpo che ho utilizzato è un anticorpo che lega Aβ 40 e Aβ 42 all’estremità carbossi-terminale.
I risultati della mia analisi mostrano che a due mesi di età vi è un aumento della marcatura per Aβ nei vasi dei topi TrkA (+/-), in particolare a livello dei piccoli vasi di ippocampo e corteccia entorinale, che non si osserva nei topi WT della stessa età (figg 15, 17). A 5 mesi di età, invece, nei topi TrkA (+/-) resta evidente l’ aumento della marcatura per Aβ nei vasi (figg. 16 e 17), e si osserva anche la presenza di aggregati amiloidi nella formazione ippocampale (fig. 16), principalmente a livello del corno d’ammone e del giro dentato. Il fenotipo amiloide risulta variabile tra un animale e l’altro, e nel complesso l’1.39 +/- 0,26% della superficie ippocampale risulta occupata da aggregati amiloidi. Nei topi WT della stessa età si riscontra la presenza di aggregati amiloidi corrispondenti allo 0,09 +/- 0,01 % della superficie ippocampale.
Figura 15. Immunoistochimica anti-Aβ dell’ippocampo a ingrandimento 4x (A, B) e dell’ippocampo a ingrandimento 10 x (C, D) nei topi a 2 mesi di età. Le immagini sulla sinistra (A, C ) sono del topo WT, mentre quelle a destra (B, D) del topo TrkA (+/-). Nei topi TrkA (+/-) si osserva un aumento della marcatura per Aβ nei vasi rispetto ai topi WT.
59 Figura 16. Immunoistochimica anti-Aβ dell’ippocampo a ingrandimento 4x (A, B) e dell’ippocampo a ingrandimento 10 x (C, D) nei topi a 5 mesi di età. Le immagini sulla sinistra (A, C ) sono del topo WT, mentre quelle a destra (B, D) del topo TrkA (+/-). Nei topi TrkA (+/-) si osserva aumento della marcatura per Aβ nei vasi rispetto ai topi WT, e presenza di aggregati di Aβ.
Figura 17. Immunoistochimica anti-Aβ della corteccia entorinale a ingrandimento 10 x. Le immagini sulla destra sono del topo WT a 2 mesi (A) e a 5 mesi (C), mentre quelle sulla sinistra sono del topo TrkA (+/-) a 2 mesi (B) e a 5 mesi (D). Nei topi TrkA (+/-) si osserva aumento della marcatura di Aβ sia a 2 che a 5 mesi rispetto ai topi WT.
60 4 Valutazione emozionale
Per valutare l’aspetto emozionale dei topi TrkA (+/-), in particolare i livelli d’ansia, ho utilizzato il test elevated plus maze, testando topi TrkA (+/-) e topi WT a 5 mesi di età. Ho espresso i risultati considerando il tempo in cui i topi, sia TrkA (+/-) che WT, sono rimasti nei bracci chiusi e nei bracci aperti del labirinto usato per il test.
Come si vede dalla fig. 18, è emersa una differenza significativa tra i due gruppi, in quanto i topi TrkA (+/-) passano più tempo nei bracci aperti rispetto ai WT, potendo concludere, dunque, che i topi TrkA (+/-), a 5 mesi, sono meno ansiosi dei topi WT.
Figura 18. Gli istogrammi mostrano il tempo che i topi TrkA (+/-) e i topi WT hanno trascorso nei bracci chiusi (A) e nei bracci aperti (B) nell’Elevated plus maze, a 5 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
A
61 5 Valutazione morfologica della microglia
Per caratterizzare la morfologia della microglia ho effettuato l’immunoistochimica anti- IBA1, usando un anticorpo primario diretto contro IBA1, una proteina legante il calcio espressa in modo specifico dai macrofagi e dalla microglia.
Per l’analisi ho valutato diversi parametri: la lunghezza media dei filamenti, il numero medio dei filamenti, l’area cellulare media, il volume cellulare medio e la densità cellulare.
Ho analizzato 3 animali TrkA (+/-) e 3 animali WT, a livello di regioni tipicamente interessate dalla malattia di Alzheimer, ippocampo e corteccia entorinale.
A 2 mesi di età non ho osservato differenze significative tra topi TrkA (+/-) e i topi WT, ma si può notare un trend di riduzione dei parametri analizzati rispetto ai WT, eccetto che per la densità cellulare (figg. 19, 20, 21).
A 5 mesi di età, invece, ho osservato una riduzione significativa della lunghezza media dei filamenti, del numero medio di filamenti, dell’area cellulare media e del volume cellulare medio, nell’ippocampo e nella corteccia entorinale, ma nessuna differenza significativa nella densità cellulare tra topi TrkA (+/-) e topi WT (figg. 22, 23, 24).
62 Figura 19. Immunoistochimica anti-IBA1. Immagini di microglia in topi a 2 mesi di età. Colonna A: cellule microgliali di topi WT partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna B: cellule microgliali di topi TrkA (+/-) partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna C: campi di microglia di topi WT partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna D: campi di microglia di topi TrkA (+/-) partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale.
63 Figura 20. Gli istogrammi mostrano i valori dei parametri morfologici analizzati per la microglia nell’ippocampo dei topi TrkA (+/-) e dei topi WT a 2 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
64 Figura 21. Gli istogrammi mostrano i valori dei parametri morfologici analizzati per la microglia nella corteccia entorinale dei topi TrkA (+/-) e dei topi WT a 2 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
65 Figura 22. Immunoistochimica anti-IBA1. Immagini di microglia in topi a 5 mesi di età. Colonna A: cellule microgliali di topi WT partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna B: cellule microgliali di topi TrkA (+/-) partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna C: campi di microglia di topi WT partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale. Colonna D: campi di microglia di topi TrkA (+/-) partendo dall’alto al basso dell’ippocampo e della corteccia entorinale.
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Figura 23. Gli istogrammi mostrano i valori i parametri morfologici analizzati per la microglia nell’ippocampo dei topi TrkA (+/-) e dei topi WT a 5 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
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67 Figura 24. Gli istogrammi mostrano i valori dei parametri morfologici analizzati per la microglia nella corteccia entorinale dei topi TrkA (+/-) e dei topi WT a 5 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
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68 5 Valutazione morfologica degli astrociti
Per caratterizzare la morfologia degli astrociti ho effettuato un’immunoistochimica anti-GFAP, utilizzando un anticorpo primario diretto contro la proteina fibrillare acida degli astrociti. Per l’analisi ho scelto di valutare diversi parametri: la lunghezza media dei filamenti, il numero medio dei filamenti, l’area cellulare media, il volume cellulare medio e la densità cellulare.
A due mesi di età non ho osservato differenze significative tra topi TrkA (+/-) e topi WT (figg. 25, 26), mentre a 5 mesi di età ho osservato una netta differenza, con importante e significativa riduzione di tutti i parametri valutati nei topi TrkA (+/-) rispetto ai topi WT (figg. 27, 28).
69 Figura 25: Immunoistochimica anti-GFAP. Immagini di Astrociti in topi a 2 mesi di età. Colonna A: campi di astrociti e singole cellule di topi WT dell’ippocampo. Colonna B: campi di astrociti e singole cellule di topi TrkA Knockout dell’ippocampo.
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Figura 26. Questi istogrammi mostrano i valori dei parametri morfologici analizzati per gli astrociti nell’ippocampo dei topi TrkA Knockout (+/-) e dei topi WT a 2 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
71 Figura 27: Immunoistochimica anti-GFAP. Immagini di Astrociti in topi a 5 mesi di età. Colonna A: campi di astrociti e singole cellule di topi WT dell’ippocampo. Colonna B: campi di astrociti e singole cellule di topi TrkA Knockout dell’ippocampo.
72 Figura 28. Questi istogrammi mostrano i valori dei parametri morfologici analizzati per gli astrociti nell’ippocampo dei topi TrkA Knockout (+/-) e dei topi WT a 5 mesi di età. Le barre rappresentano la media ± l’errore standard.
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73 DISCUSSIONE
L’interesse per la caratterizzazione fenotipica dei topi TrkA (+/-) e sui risultati ottenuti nasce dalle recenti acquisizioni sul ruolo dello squilibrio della segnalazione NGF/TrkA nella patogenesi della malattia di Alzheimer.
Per la mia tesi ho utilizzato topi transgenici knockout per TrkA. Ho utilizzato topi eterozigoti (TrkA +/-), poiché i topi omozigoti per TrkA knockout muoiono per lo più nei primi giorni dopo la nascita, e comunque non sopravvivono oltre il mese di vita [214].
La prima valutazione che ho effettuato ha riguardato aspetti legati ai neuroni colinergici che dal prosencefalo basale innervano la corteccia (mediante immunoistochimica anti-CAT), e che sono coinvolti nell’uomo, in fenomeni cognitivi, di modulazione della memoria e dell’attenzione. Ho, quindi, eseguito test comportamentali legati a queste proprietà cognitive.
È noto, infatti, il ruolo del segnale NGF/TrkA nella sopravvivenza e nella differenziazione dei neuroni colinergici del prosencefalo basale, e, in minor parte, dello striato [258][259][231][260][202].
La disfunzione dei neuroni colinergici del prosencefalo basale, inoltre, rappresenta uno degli eventi più precoci nella malattia di Alzheimer, associata al declino cognitivo [261]. Le popolazioni cellulari del prosencefalo basale e dello striato esprimono TrkA [202][262][263], mentre l’NGF è prodotto nelle regioni target di queste cellule [264][265][266], e trasportato in modo retrogrado al corpo cellulare dei neuroni colinergici [208].
Dalla mia analisi risulta che all’immunoistochimica anti-CAT i topi TrkA (+/-) mostrano, all’età di 5 mesi, un trend di riduzione dei neuroni colinergici del prosencefalo basale rispetto ai topi WT, ancorchè non statisticamente significativo, mentre all’età di 2 mesi non si osservano differenze. L’assenza di una differenza significativa rispetto ai WT suggerirebbe che la presenza di un allele WT del gene che codifica per TrkA sia sufficiente a garantire l’effetto trofico mediato dal TrkA sui neuroni colinergici. Tuttavia, la tendenza ad un deficit cognitivo a 5 mesi, ancorchè non significativa, è in
74 linea con il ruolo del segnale NGF/TrkA nella sopravvivenza e nella differenziazione del sistema colinergico. L’assenza di differenze tra TrkA knockout e Wt a 2 mesi di età potrebbe indicare che i deficit legati al ridotto signaling attraverso TrkA compaiono in seguito.
D’altra parte, i risultati in letteratura con i topi transgenici NGF knockout [241][267], ed i topi transgenici TrkA knockout [214][213][268], non hanno mostrato significativa riduzione nelle dimensioni e/o nel numero dei neuroni colinergici del prosencefalo basale e questo è stato interpretato come il risultato di una compensazione durante lo sviluppo, innescata dalla totale assenza della NT o del suo recettore. Consistentemente, nei topi transgenici anti-NGF AD11 [239] e anti-TrkA MNAC13 [255], nei quali l’interferenza con l’NGF o con il recettore TrkA è postnatale, si determina un chiaro deficit colinergico.
I miei risultati dimostrano che nei topi eterozigoti TrkA (+/-) si determina una tendenza ad un deficit, che si riflette anche in alcuni parziali deficit comportamentali.
Infatti sottoponendo i topi a 5 mesi di età al test comportamentale ORT, ho, poi, osservato che i topi TrkA (+/-) mostrano deficit di attenzione, ma non di memoria, con una differenza significativa rispetto ai WT. Questo risultato di mancato deficit di memoria si può spiegare con il fatto che nei topi TrkA (+/-) un certo trofismo viene mantenuto per la presenza dell’allele WT. Inoltre, la presenza di un deficit di attenzione dimostra che questo aspetto e’ piu’ sensibile ad un ridotto tono dell’innervazione colinergica, rispetto al task di memoria, ma potrebbe essere anche dovuto al contributo di altri fattori, che restano da esaminare. Il deficit di attenzione, infatti, potrebbe essere legato anche all’accumulo di Aβ nei vasi, che si osserva nei topi TrkA (+/-) a partire dai 2 mesi di età. Diversi studi dimostrano il possibile ruolo dell’angiopatia amiloide nello sviluppo dei deficit cognitivi [65][66], e correlano la stessa a declino cognitivo lieve [270]. La deposizione di amiloide nelle pareti dei vasi cerebrali è considerato oggi un meccanismo attivo nella patogenesi della malattia [271]. L’angiopatia amiloide, che nella AD raramente causa emorragie, può contribuire
75 attivamente al declino cognitivo a causa della ischemia cerebrale che ne consegue, che può alterare il metabolismo cellulare e causare stress ossidativo con danno neuronale e capacità cognitive non ottimali [271].
In base ai risultati ottenuti, ho poi deciso di effettuare l’elevated plus maze sui topi TrkA (+/-) e sui topi WT di 5 mesi, dal momento in cui il test è stato utilizzato in letteratura per valutare il comportamento disinibito dei topi, tipico dei soggetti affetti da malattia di Alzheimer. I topi TrkA (+/-) hanno mostrato di essere meno ansiosi rispetto ai WT della stessa età, restando più tempo nei bracci aperti che nei bracci chiusi del labirinto, con una differenza statisticamente significativa, risultato che correla con un comportamento più disinibito dei topi.
Lo stesso risultato è stato riscontrato in diversi modelli murini con neuro- degenerazione AD-simile [285][286][287][288].
Dal momento che in modelli murini con deficit del segnale NGF/TrkA vi è neurodegenerazione AD-simile con presenza di aggregati di Aβ [239] [255], sono andata ad indagare lo stesso aspetto nel topo TrkA (+/-), effettuando una immunoistochimica anti Aβ su topi di 2 e 5 mesi di età.
Dalla mia analisi risulta che i topi TrkA (+/-) a 2 mesi di età mostrano un aumento della marcatura per Aβ a livello dei vasi rispetto ai WT, in particolare a livello dei piccoli vasi di ippocampo e corteccia entorinale. Nei topi TrkA (+/-) a 5 mesi di età rimane l’aumentata marcatura per Aβ a livello vascolare, e si osserva anche la presenza di aggregati amiloidi nella formazione ippocampale, principalmente a livello del corno d’ammone e del giro dentato.
Il fenotipo amiloide risulta variabile tra un animale e l’altro, il carico di aggregati amiloidi risulta inferiore rispetto a quello osservato nel topo AD11, e l’età di comparsa è paragonabile al topo AD11 e più precoce del topo MNAC13. Questo risultato rappresenta, forse, il dato più significativo della mia tesi e costituisce un aspetto molto interessante. Infatti la ridotta espressione del recettore TrkA sembra avere un ruolo nella amiloidogenesi, risultato che conferma l’ipotesi secondo cui la
76 neurodegenerazione simil-AD potrebbe essere legata a uno squilibrio di proNGF/NGF e, di conseguenza, a una ridotta segnalazione di TrkA e un’aumentata segnalazione di p75NTR [255].
Studi recenti, in accordo, dimostrano che il segnale NGF/TrkA è associato alla processazione di APP [269], in particolare ne favorisce il clivaggio ad opera della via anti-amiloidogenica.
Nei topi WT a 5 mesi di età si osservano minimi acculi di Aβ giustificabili con il normale invecchiamento degli animali.
Nei diversi modelli con alterazione del segnale NGF/TrkA si sono ottenuti, in letteratura, risultati discordanti riguardo alla patologia Tau: mentre nei topi AD11 si è osservata patologia Tau, la stessa non è presente nei topi MNAC13. Sarebbe interessante andare ad investigare il comportamento di Tau anche nei topi TrkA (+/-), per avere maggiore chiarezza sui possibili meccanismi che inducono la patologia Tau.
Per la stretta correlazione spaziale tra placche amiloidi e glia, ho deciso di caratterizzare microglia e astrociti nelle aree primariamente e caratteristicamente interessate dalla AD, ippocampo e corteccia entorinale [111].
Per caratterizzare la microglia ho eseguito una valutazione morfologica della stessa analizzando diversi parametri: la lunghezza media dei filamenti, il numero medio dei filamenti, l’area cellulare media, il volume cellulare medio e la densità cellulare. Dall’analisi ho osservato che nei topi TrkA (+/-) di 2 mesi di età non vi sono differenze rispetto ai WT, mentre nei topi TrkA (+/-) di 5 mesi di età le cellule microgliali mostrano significative differenze morfologiche rispetto ai topi WT, con riduzione di tutti i parametri analizzati ad eccezione della densità cellulare, in tutte le aree analizzate. Questo è un risultato significativo, soprattutto se associato alla individuazione di una neuropatologia a carico del peptide Aβ in questi topi.
La riduzione di lunghezza e numero dei filamenti della microglia con ispessimento degli stessi è stata considerata un indice di attivazione delle cellule della microglia [119], con assunzione di morfologia ameboide. Nel mio caso, però, ho osservato riduzione di
77 lunghezza e numero dei filamenti accompagnata a riduzione dell’area e del volume cellulare, il che potrebbe indicare una disfunzione della microglia più che una sua attivazione. Alcuni studi, infatti, dimostrano l'esistenza di una forma di microglia distrofica, che sembra aumentare con l'età [272], ma anche in condizioni neurodegenerative come la AD [272]. Le cellule microgliali distrofiche sono caratterizzate da prolungamenti corti, frammentati e sottili, caratteristiche che potrebbero indurre a pensare, erroneamente, che si tratti di microglia attivata.
La disfunzione della microglia nella malattia di Alzheimer è stata associata alla neurogenerazione, sia per il ridotto effetto neuroprotettivo, sia per la ridotta clearance di Aβ [271].
I risultati osservati nei topi TrkA (+/-), dunque, suggerirebbero che la ridotta espressione di TrkA potrebbe influenzare negativamente l’attività della microglia, comportando una disfunzione della stessa, e, dunque, che la carenza di TrkA potrebbe avere un ruolo nella neurodegenerazione anche attraverso la microglia. Posso ipotizzare che l’aumento di peptide Aβ che ho osservato possa essere determinato anche da una ridotta fagocitosi del peptide stesso da parte della microglia nei topi TrkA (+/-).
È noto che la microglia risponde all’NGF [273], e, in particolare, l’NGF influenza la sopravvivenza, la differenzazione, e l’attivazione della microglia, stimolando la chemiotassi e la proliferazione [274], attraverso il recettore TrkA, tanto che bloccando TrkA in colture di microglia tali funzione sono state inibite [274]. Resta da dimostrare il ruolo di TrkA in vivo.
Recentemente si è osservato che l’NGF sembrerebbe favorire la fagocitosi anche aumentando i livelli di catepsina S, un membro della famiglia delle proteasi lisosomiali in grado di digerire Aβ [275]; sarebbe, dunque, interessante indagare se i livelli di Catepsina S nei topi TrkA (+/-) siano ridotti.
78 Per l’analisi degli astrociti ho effettuato un’immunoistochimica anti-GFAP, e ho scelto di valutare diversi parametri: la lunghezza media dei filamenti, il numero medio dei filamenti, l’area cellulare media, il volume cellulare medio e la densità cellulare. Dall’analisi è emerso che nei topi TrkA (+/-) vi è una differenza significativa in tutti i parametri analizzati rispetto ai topi WT, principalmente a 5 mesi di età, con ridotta densità cellulare e atrofia astrocitaria.
L’atrofia degli astrociti, caratterizzata da riduzione delle dimensioni cellulari e del numero dei processi [123], è stata rilevata nel normale invecchiamento [276] nello stress cronico [277], in modelli murini della AD [278], in particolare nelle fasi precoci della malattia, e su reperti autoptici di una famiglia affetta da AD [279].
Nella malattia di Alzheimer, l’atrofia astrocitaria sembra interessare le prime fasi della malattia, come dimostrato su animali transgenici. La precoce atrofia potrebbe essere patologicamente rilevante, dal momento in cui questa popolazione cellulare è essenziale per l’omeostasi neuronale e sinaptica e potrebbe avere conseguenze disastrose sulle prestazioni e sulla sopravvivenza dei neuroni e sull’attività sinaptica [279]. Nello specifico può portare a perdita dei contatti sinaptici, alterazione della trasmissione e indebolimento della plasticità sinaptica, che sono proprio i primi eventi