Le molecole fluorescenti utilizzate per valutare la [Ca 2+ ]

Le prime misure della concentrazione intracellulare di Ca²+ sono state possibili grazie a molecole naturali, come la fotoproteina equorina (Ridgway e Ashley, 1967), o di sintesi, come gli indicatori metallocromici arsenazo III o antipirilazo III (Thomas, 1982). Tuttavia, queste molecole risentivano di una limitazione sperimentale importante: l'indicatore di Ca²+ doveva essere introdotto direttamente all'interno della cellula per microiniezione, perché né una proteina né una molecola carica, come un indicatore metallocromico, attraversano la membrana di una cellula viva limitandone l’uso ad un numero ridotto di tipi cellulari, nei quali era praticabile la microiniezione dell'indicatore. La situazione è radicalmente cambiata con lo sviluppo da parte di R. Tsien e dei suoi collaboratori (1982) di un secondo metodo di misura della concentrazione dello ione calcio intracellulare: quello degli indicatori fluorescenti intrappolabili nel citoplasma. Questi indicatori, oltre a rivoluzionare lo studio dell' omeostasi intracellulare di Ca²+, sono stati il prototipo di una varietà di indicatori per altri parametri fisiologici, quali il pH (Rink et al., 1982), la concentrazione di Na+ (Minta e Tsien, 1989) o di Mg²+ (Raju et al., 1989), ecc.

Gli elementi essenziali di un indicatore sono la selettività, la qualità del segnale e la facilità d'uso. Gli indicatori fluorescenti di Ca²+, il cui precursore è stata la molecola quin-2, ma che attualmente annoverano decine di composti diversi, hanno come punto di partenza un chelante selettivo per Ca²+, come l'EGTA o il BAPTA (Fig 23).

Fig 23 Struttura chimica di EGTA e BAPTA

La porzione della molecola che lega il Ca²+ è costituita da una gabbia carbossilica che si adatta esattamente alle dimensioni dello ione: da qui ha origine la selettività. Alla gabbia carbossilica è associato un gruppo fluoroforo, che conferisce alla molecola una fluorescenza dipendente dal legame di Ca²+ con la gabbia carbossilica. Per la loro struttura, e in particolare per la presenza dei gruppi carbossilati che legano lo ione Ca²+, anche questi indicatori non attraversano liberamente le membrane cellulari. Per risolvere questo problema, la molecola attiva è stata ulteriormente modificata da Tsien e collaboratori, esterificando (e quindi neutralizzando) i gruppi carichi. In questa forma la molecola è incapace di legare Ca²+, ma è in grado di transitare direttamente attraverso la membrana plasmatica e raggiungere il citoplasma. Enzimi che fanno parte del corredo normale della cellula (le esterasi) idrolizzano l'estere ed eliminano il gruppo organico aggiunto, ripristinando la forma attiva della molecola capace di legare Ca2+ e quindi di sviluppare fluorescenza (Fig.24). La molecola è inoltre diventata polare e non può più uscire dalla cellula per diffusione semplice. Questo approccio ha il vantaggio di eliminare la fase di

iniezione con microaghi che da un lato richiede mezzi tecnici non indifferenti e dall’ altro rischia di danneggiare la cellula da studiare.

Fig.24 Meccanismo di de-esterificazione da parte di esterasi.

Rispetto al primo indicatore fluorescente prodotto da Tsien, gli indicatori sviluppati negli anni successivi (Grynkiewicz et al., 1985) sono dotati di diverse caratteristiche chimiche, che li rendono ancora più adatti agli studi fisiologici. Queste molecole emettono fluorescenza una volta esposte a luce ultravioletta (UV), ma la lunghezza d’onda della luce UV che determina la fluorescenza può essere diversa a seconda che la molecola sia legata o meno a ioni calcio. Per questo motivo, la quantità del calcio liberato nel citosol può essere quantificata misurando il rapporto tra le intensità di fluorescenza misurate alle due lunghezze d’onda, e si parla in questo caso di sonde raziometriche. In altri casi la sonda non è fluorescente in assenza di Ca2+ e il suo progressivo aumento viene rilevato con un aumento dell’intensità di fluorescenza ad una stessa lunghezza d’onda (sonde non raziometriche).

Tab. 4 Schema delle sonde raziometriche e non raziometriche

RAZIOMETRICHE NON RAZIOMETRICHE

Sono più utili per misurazioni quantitative della concentrazione di Ca2+

Utilizzati per i dati qualitativi, indicando variazioni relative del Ca2+.

Presentano spettri di eccitazione e emissione diversi a seconda che siano o meno legati al Ca2+.

La concentrazione di calcio è misurata come rapporto fra i valori di intensità di fluorescenza che vengono registrati a due lunghezze d’onda.

Cambiamento nella loro emissione di fluorescenza quando si legano al Ca2+ .

Svantaggio : il loro intervallo

dinamico (differenza di intensità tra Ca2+-libero e Ca2+-legato) è spesso piccolo, rendendo così più difficile rilevare modeste modifiche nelle variazioni di concentrazione.

Svantaggio: le variazioni di emissione di fluorescenza non

riflettono differenze nella concentrazione di Ca2+. Ad esempio, cellule adiacenti all'interno di un singolo campo visivo possono venire caricate con quantità differenti di indicatore e ciò porta a cellule adiacenti con diverse intensità di fluorescenza.

Senza calibrare la fluorescenza all'interno di ogni singola cellula, è impossibile stabilire se le diverse intensità di fluorescenza riflettono esclusivamente diversità nel caricamento della quantità di indicatore, o invece variazione della loro concentrazione di Ca2+. Per questo motivo, gli indicatori a singola lunghezza d'onda sono più utili per misurare le variazioni relative di concentrazione di Ca2+.

Le metodiche del Ca2+ imaging hanno permesso di identificare molti dei processi cellulari controllati dalla concentrazione di calcio. Tra questi processi troviamo le vie di risposta cellulare, i movimenti cellulari, l’assemblaggio e il disassemblaggio delle componenti del citoscheletro, la secrezione e l’endocitosi. Inoltre, misure della [Ca2+

]i possono essere effettuate utilizzando la microscopia confocale, che consente una localizzazione tridimensionale del segnale; è inoltre possibile indirizzare i fluorocromi in specifiche parti della cellula, quali i mitocondri, il reticolo endoplasmatico e la membrana plasmatica.

Criteri di selezione degli indicatori del calcio

Parametro chiave nella scelta dell’indicatore è la sua costante di dissociazione (Kd); essa rappresenta una misura dell’affinità dell’indicatore per lo ione Ca2+

ed è il parametro di conversione che collega la concentrazione di ioni calcio ai segnali di fluorescenza. Questo parametro varia da indicatore a indicatore, quindi è importante selezionare l’indicatore sulla base del range di concentrazioni di uno ione attese in un esperimento. L'intervallo di concentrazioni nel quale un indicatore produce una risposta osservabile è da circa 0,1 × Kd a 10 × Kd. Indicatori con bassa affinità sono adatti per concentrazioni elevate di calcio, ma non sono sufficientemente sensibili per concentrazioni inferiori. Al contrario, indicatori ad alta affinità Ca2+sono adatti per seguire cambiamenti nella concentrazione di Ca2+ in un range di concentrazioni relativamente basse.

In alcune situazioni, la combinazione di indicatori a bassa ed alta affinità può essere necessaria per seguire con precisione variazioni di calcio intracellulare. La Kd di indicatori del Ca2+ in vivo dipende anche da molti fattori, tra cui pH, temperatura, forza ionica, viscosità, la presenza di sistemi tampone (proteine leganti) e la presenza di Mg2+ e altri ioni. Di conseguenza, i valori di Kd intracellulari sono solitamente significativamente superiori rispetto ai valori misurati in soluzioni acellulari.

-modalità di misura (dati qualitativi vs. quantitativi, tipo di strumento, sorgente di rumore etc.):

anche le modalità di misurazione svolgono un ruolo importante nella scelta dell’indicatore; queste dipendono dal fatto che si voglia avere dei valori quantitativi o qualitativi della concentrazione, ma anche dalla preferenza di lunghezza d’onda di eccitazione e emissione che dipendono dal tipo di strumentazione utilizzata.

-intensità della fluorescenza emessa dall’indicatore: se durante un esperimento si hanno

variazioni della concentrazione intracellulare dell’indicatore anche l’intensità di fluorescenza varierà, indipendentemente dalla concentrazione di Ca2+. Cause tipiche delle variazioni di concentrazione dell’indicatore sono il photobleaching, la compartimentalizzazione o l’estrusione della sonda. Tuttavia, è molto importante sottolineare che l'intensità di fluorescenza è anche una funzione di diversi altri fattori (es. il percorso della lunghezza di eccitazione). Pertanto, possibili modifiche e artefatti di intensità di fluorescenza devono essere considerati attentamente per monitorare fedelmente i segnali del calcio (Bootman et al., 2013).

-registrazione simultanea di altri parametri biologici : le condizioni locali come la viscosità, pH,

ecc possono alterare le proprietà dell’indicatore. Variazioni di tali condizioni, possono verificarsi tra indicatori situati nel citosol o organuli come nuclei, mitocondri, o strutture vescicolari.

2.SCOPO

Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e mettere a punto la tecnica dell’imaging del calcio nelle cellule gustative presenti sulla superfice della lingua per valutarne la risposta a stimoli complessi, rappresentati dalla miscela di più molecole chimiche.

Questo approccio permette di emulare quanto accade in vivo durante il consumo di alimenti, quando le cellule gustative sono esposte simultaneamente a più stimoli sensoriali. In particolare abbiamo utilizzato come stimolo un dolcificante sintetico (Dietor contenente saccarina, una sostanza capace di ineragire sia con i recettori TAS1 che con i TAS2, assieme a un’altra molecola dolce, l’eritritolo, naturalmente presente in alcuni alimenti).

Rispetto al metodo convenzionale basato sull’analisi delle risposte evocate dall’applicazione di una singola molecola, questo approccio può risultare utile per ampliare le conoscenze sulle complesse relazioni che intervengono tra cellule gustative e stimoli organici.

3 MATERIALI E METODO