PREPARAZIONE FETTINE

La lingua è stata divisa in due, sotto al microscopio ottico, e la parte muscolare rimossa il più possibile per facilitare l’adesione dell’epitelio al filtro da 0.45 µm (Millipore). Successivamente al microtomo sono state effettuate fettine di 150 µm di spessore per permettere la visualizzazione delle papille gustative sia del tipo fungiforme che foliate. Per evitare che la lingua andasse incontro a disidratazione durante il taglio, la superficie dorsale è stata coperta con 0.1 ml circa di agar al 2% in PBS.

CARICAMENTO DEL Fluo-4

Fig.26 Struttura chimica

Nel corso del lavoro di tesi è stato utilizzato come fluorocromo il FLUO-4 nella forma acetometossi estere (FLUO-4-AM) (Invitrogen). Il Fluo-4 è una molecola della famiglia delle sonde per il calcio non-raziometriche, derivata dal chelante per il calcio BAPTA. La struttura del fluo-4 porta 2 gruppi fluoro, che conferiscono alla molecola un aumento della fluorescenza di eccitazione a 494 nm e di conseguenza livelli più alti dei segnali di fluorescenza rispetto i suoi analoghi (Fig. 26). Una volta all’interno della cellula il Fluo-4-AM viene idrolizzato dalle esterasi a FLUO-4, che resta nel citoplasma e tipicamente non genera artefatti derivati da problemi di compartimentalizzazione negli organelli (come mitocondri, reticolo endoplasmatico che contengono alte concentrazione di calcio).

Il fluo-4-AM presenta uno spettro di Ex/Em 494/506 nm e una Kd in soluzione di 335 nM: è pertanto una sonda fluorescente che assorbe nel blu ed emette nel verde; la sua intensità di fluorescenza aumenta dopo legame al Ca2+ all’interno della cellula (Fig. 27).

Fig. 27 Spettro eccitazione/emissione del Fluo-4 www.thermofisher.com)

Per valutare l’interazione tra la saccarina e i recettori del gusto, le cellule sono state dapprima caricate con la sonda fluorescente Fluo-4, utilizzando la forma acetometossiestere (AM), alla concentrazione finale di 2.5 µM (eccetto che in prove iniziale nelle quali è stata utilizzata una concentrazione 5 µM) e in seguito sono stati somministrati i vari stimoli gustativi. Se le cellule aumentavano l’emissione di luce fluorescente dopo l’esposizione agli stimoli gustativi, questa è considerata una buona indicazione riguardo la sua interazione con un recettore che innesca la via di trasduzione del segnale dell’IP3/DAG.

Il tempo di caricamento utilizzato era di 45-60 minuti a temperatura ambiente (circa 24 °C). Al termine del periodo di caricamento il PBS con la sonda viene rimosso e sostituito con PBS e le sezioni sono lasciate al buio per ulteriori 15 minuti prima di cominciare le misure.

La procedura operativa seguita è elencata di seguito in dettaglio:

1. Si mettono le fettine in una piastra da 3 cm di diametro, nella cui parte centrale è stato ricavato un pozzetto del diametro di circa 13 mm, il cui fondo è formato da un vetrino coprioggetto dal diametro di 16 mm e dello spessore di 0.1 mm. Nel pozzetto erano stati precedentemente aggiunti 500 µl di PBS, aspirandone successivamente 250 µl.

2. Vengono aggiunti 250 µl di Fluo-4 AM 5 µM in PBS per arrivare a una soluzione finale 2.5 µM. Le sezioni venivano lasciate “caricare” al buio a R.T. per 45-60 minuti.

3. Successivamente la capsula viene montata sul tavolino del microscopio.

4. Al termine dell’incubazione si aspirano 250 µl di Fluo-4 in PBS e vengono effettuati due lavaggi/aspirazione con 250/ µl di PBS seguiti da un periodo di ulteriori 15 minuti al buio. 5. Per valutare la risposta delle papille agli stimoli gustativi, le soluzioni sono state applicate tramite un sistema in cui il flusso attraverso le diverse line di perfusione era controllato da elettrovalvole. Le linee di perfusione convergevano in un puntale da 20 µl posizionato in prossimità della sezione esaminata mediante un micromanipolatore meccanico. Inoltre all’interno della camerina veniva inserito un sistema di aspirazione collegato ad una pompa peristaltica, la cui velocità era regolabile, in modo tale che il volume all’interno del preparato si mantenesse approssimativamente costante.

6. Per la rilevazione della fluorescenza abbiamo utilizzato un microscopio ottico invertito (Leica DMI 4000B) dotato di un blocchetto di fluorescenza in cui il filtro di eccitazione era un passabanda centrato a 470 nm (HWBW 40 nm), quello di emssione un passa banda centrato a 525 nm (HWBW 50 nm) e lo specchio dicroico un passa alto a 500 nm. La sorgente luminosa utilizzata era una lampada alogena sia per la sorgente di luce trasmessa che per quella di fluorescenza.

È stato utilizzato il software Leica Application Suite Advanced Fluorescence (Leica Microsystems LAS AF) che ha la capacità di pilotare la sorgente luminosa e guidare l’acquisizione delle immagini da parte della telecamera a intervalli prestabiliti (modalità time- lapse). Il software premette inoltre di quantificare i valori di fluorescenza in regioni di interesse (ROI) ed è stato utilizzato per le misure successive all’acquisizione delle immagini.

Per gli esperimenti sono stati impiegati obiettivi 5x e 60x, le immagini sono state acquisite usando la camera digitale Leica (DFC-350 FX). Per migliorare il rapporto segnale rumore abbiamo utilizzato una lente riduttrice 0.63x, in modo da concentrare la luce emessa dal preparato sul sensore della telecamera. L’ingrandimento complessivo del sistema di acquisizione immagini è stato quindi 63x0.63, ovvero 39.7 (Dailey et al, 2016) .

Il microscopio era inoltre dotato di ulteriori due blocchetti di fluoresecnza nelle regioni del giallo e del rosso.

Tabella 7 Bande di eccitazione e di emissione dei filter cube a disposizione. FILTER CUBE ECCITAZIONE EMISSIONE

GFP BP 470/40 BP525/50

mCherry HQ 580/20 HQ 630/60

Rhod-et BP 546/10 BP 585/40

Il protocollo di acquisizione immagini permette di controllare la durata e l’intensità della luce e la cadenza della sua presentazione. Inoltre è possibile anche controllare un fattore di amplificazione, che permette di moltiplicare il segnale generato dal sensore della telecamera prima della sua conversione analogico-digitale tramite una scheda a 12 bit. Il fattore di amplificazione incrementa sia il segnale che il rumore generato dal sensore, ma quest’ultimo è relativamente basso in quanto la telecamera è raffreddata tramite un sistema Peltier. In compenso, l’amplificazione prima della digitalizzazione è vantaggiosa in quanto incrementa la capacità di risoluzione del segnale.

La durata dell’impulso luminoso è stata di di 50 ms, grazie all’adozione di una lente di riduzione dell’ingrandimento e all’utilizzo del massimo fattore di amplificazione possibile (10x). Ogni esperimento è costituito da un gruppo di episodi (series) ognuno dei quali è composto da uno stack di immagini. Le immagini vengono acquisite ogni 2 secondi. Pertanto, l’acquisizione di una series di 4 minuti (240s), acquisite ogni due secondi, ha portato ad uno stack di 120 immagini. Nel caso di esperimenti nei quali venivano acquisite 8 series, il file complessivo delle 8 series comprendeva 960 immagini, ognuna da oltre 2 Mb, per una dimensione totale di oltre 2 Gb. I files sono stati salvati sul disco rigido del computer per essere successivamente analizzati offline tramite il software LAS AF.

4. RISULTATI e DISCUSSIONI

4.1 MESSA A PUNTO DEL METODO

Nella fase iniziale del lavoro è stato messo appunto il protocollo da utilizzare per le misurazioni delle variazioni di fluorescenza in risposta alla variazione del calcio intracellulare in cellule gustative, considerando che sono molteplici i parametri che influenzano tali misure. Tra questi i principali sono: la concentrazione della sonda, il tempo di caricamento, il tempo e il volume della sostanza usata per il lavaggio successivo al caricamento; per quanto riguarda invece i parametri che influenzano l’acquisizione delle immagini e la misurazione della fluorescenza emessa, abbiamo: l’intensità della luce di esposizione ed il tempo di esposizione. In particolare i parametri che si è cercato di ottimizzare per un adeguato utilizzo di queste sonde sono: la concentrazione e i tempi di caricamento.

Abbiamo in primo luogo variato sia il tempo di caricamento, che la concentrazione della sonda ed il tempo di lavaggio, come illustrato nella tabella.

TEMPO DI