Neutrofilia: la neutrofilia è un aumento del numero dei neutrofili che

può avvenire in risposta a stimoli fisiologici e patologici. La neutrofilia inoltre può essere distinta in.

• Neutrofilia matura: l’aumento riguarda i neutrofili segmentati maturi, non vi è incremento delle forme immature. [36, 65]

• Neutrofilia con deviazione a sinistra: si ha aumento sia delle forme mature che immature che sono rappresentate da neutrofili in banda e metamielociti. [36, 65]

Per quanto riguarda le cause che determinano neutrofilia si va a distinguere:

Neutrofilia fisiologica: è un aumento dei neutrofili di lieve entità, il loro valore può essere raddoppiato rispetto al valore più alto dell’intervallo di riferimento, l’aumento è solo a carico dei neutrofili maturi e quindi non vi è deviazione a sinistra. Questo tipo di neutrofilia è causato dal rilascio di epinefrina che è una catecolamina endogena che viene rilasciata in risposta a stimoli quali la paura e l’eccitazione, ma anche in seguito a convulsioni o esercizi fisici molto intensi di breve durata. Si determina in pochi minuti dall’insorgenza dello stimolo e si risolve dopo 20-30 minuti. A seguito della liberazione dell’epinefrina si ha una mobilitazione dei neutrofili marginali che passano pertanto in circolo aumentando il numero dei

neutrofili. Questo aumento tuttavia non è reale e si può parlare anche di “pseudoneutrofilia”. Nel cane adulto la neutrofilia fisiologica è abbastanza rara, più comune nel cucciolo, a volte può essere accompagnata da linfocitosi. [36, 65]

Neutrofilia da corticosteroidi: questo tipo di neutrofilia può essere causata da corticosteroidi endogeni, come il cortisolo, o da corticosteroidi esogeni quindi da farmaci antinfiammatori. Il rilascio di corticosteroidi endogeni è causato da gravi stress quali traumi, malattie debilitanti (sepsi, tossiemia), malattie metaboliche (insufficienza renale, diabete) interventi chirurgici, dolore, temperature corporee eccessivamente alte o basse nonchè da iperadrenocorticismo. La neutrofilia da corticosteroidi è matura, senza deviazione a sinistra, a meno che il pool di riserva dei neutrofili non sia esaurito al momento della stimolazione corticosteroidea, in ogni caso la deviazione a sinistra è di lieve entità. Il numero assoluto dei neutrofili può aumentare di 2-3 volte rispetto ai valori normali di riferimento. L’azione dei corticosteroidi si accompagna sempre ad eosinopenia, linfopenia e monocitosi. Nel caso in cui la neutrofilia sia causata da somministrazione esogena di corticosteroidi questa si manifesta dopo 4-8 ore dalla somministrazione e scompare dopo 24 ore. I corticosteroidi determinano neutrofilia diminuendo i legami d’adesione tra neutrofili ed endotelio ostacolando in questo modo la migrazione, detta diapedesi, dei neutrofili

dal circolo ai tessuti, inoltre aumentano la quota di neutrofili rilasciati dal midollo osseo. [36, 65]

Neutrofilia da infiammazione ed infezione: questo tipo di neutrofilia è causato da un aumento di richiesta dei neutrofili nei tessuti sede del processo infettivo o infiammatorio. I neutrofili, durante un’infiammazione, per un effetto endotossiemico-mediato, aumentano il loro legame di adesione con l’endotelio vascolare e migrano in gran numero nei tessuti sede del processo dove, richiamati da fattori chemiotattici, svolgono la loro funzione. I neutrofili sono quindi rapidamente consumati e la normale quota rilasciata dal midollo in tali circostanze non è più sufficiente. Gli agenti infettivi ed i prodotti del danno tissutale stimolano una varietà di cellule a rilasciare sostanze come interleuchine, fattori di crescita, citochine ed altri mediatori dell’infiammazione. In particolare le citochine rilasciate dalle cellule mononucleate locali raggiungono il midollo e possono agire sulle cellule staminali, sulle cellule progenitrici e sui precursori dei neutrofili incrementando la loro proliferazione, differenziazione, maturazione e rilascio dal midollo osseo in circolo. A ciò consegue una maggiore quota di neutrofili nel sangue che continua fino a quando lo stimolo infiammatorio non cessa. Nel caso di infiammazione acuta la neutrofilia è caratterizzata da deviazione a sinistra poiché il rapporto di spostamento dei neutrofili verso il sangue è più grande del loro

spostamento verso i tessuti, quando l’infiammazione diventa cronica vi è aumento nella proliferazione del midollo osseo con conseguente incremento del pool maturativo. [36, 65]

Neutrofilia da cause non infettive: può essere causata da malattie immunomediate, necrosi tissutale (infarto, trombosi, ustioni), chirurgia (stress e danno tissutale), emorragia, emolisi, tossicità chimica e da farmaci (compreso lo stadio iniziale della tossicità da estrogeni), tossiemia e pancreatite acuta. [36, 65]

Neutrofilia neoplastica: si verifica nella leucemia mieloide in cui vi è produzione incontrollata di queste cellule e numero elevato sia nel sangue che nel midollo, a volte si può avere anche neutrofilia in corso di sindrome paraneoplastica, è causata da produzione da parte del tumore di sostanze stimolanti tale compartimento. [36, 65]

3.3.2 Eosinofilia

E’ caratterizzata da un aumento del valore assoluto degli eosinofili oltre i valori di riferimento. L’eosinofilia può essere causata da:

• Malattie di tessuti ricchi di mastociti: sono la pelle, il polmone, il tratto gastroenterico e l’apparato genitale femminile durante l’estro.

• Parassiti: alcuni parassiti inducono una maggiore eosinofilia di altri poiché vi è una correlazione diretta tra l’entità del contatto tra i tessuti dell’ospite ed il parassita che causa l’aumento di una sostanza umorale prodotta dall’esposizione di linfociti sensibilizzati. Si ha eosinofilia nel caso di infestazioni sostenute da: Angiostrongylus vasorum, Ancylostoma spp, Dirofilaria immitis, Hepatozoon canis, Strongiloides spp, Toxocara canis e Trichuris vulpis.

• Allergie: l’eosinofilia si riscontra in corso di allergie respiratorie, gastroenteriche e cutanee.

• Ipoadrenocorticismo

• Condizioni idiopatiche: miosite, gastroenterite, panosteite e polmonite eosinofilia.

• Neoplasie: si può avere eosinofilia nella neoplasia mastocitaria o nella leucemia eosinofilica. [36, 65]

3.3.3 Basofilia

La basofilia è spesso difficile da diagnosticare poiché nel cane il basofilo ha scarsi granuli citoplasmatici ed il nucleo, seppur differente, viene spesso scambiato con quello del monocita. La basofilia spesso è associata ad

eosinofilia poiché hanno cause comuni. Si ha pertanto che la basofilia può essere causata da:

• Parassiti: possono determinare basofilia ectoparassiti, come le pulci e le zecche, parassiti gastrointestinali come i nematodi, parassiti vascolari quale la Dirofilaria immitis ed altri ancora.

• Allergie: la basofilia può comparire in corso di allergie da farmaci, alimenti, inalanti e punture di insetto.

• Neoplasie: si può riscontrare basofilia nella mastocitosi diffusa e anche in corso di leucemia basofilia. [36, 65]

3.3.4 Monocitosi

E’ caratterizzata da un aumento del numero assoluto di monociti, spesso può accompagnare una neutrofilia matura poiché neutrofili e monociti originano dalla stessa cellula staminale, ma talvolta può anche presentarsi da sola. Le cause di monocitosi sono:

• Infiammazione: la monocitosi è tipica degli stati infiammatori cronici di cui spesso è l’unico sintomo e si trova per lo più in corso di suppurazione, necrosi tissutale, reazioni granulomatose o pio granulomatose.

• Malattie immunomediate: si ha monocitosi in corso di anemia emolitica e poliartrite immunomediata.

• Corticosteroidi: un aumento dei corticosteroidi esogeni o endogeni determina appunto monocitosi, neutrofilia, eosinopenia e basopenia.

• Tumori maligni: si ha monocitosi soprattutto nel caso di grossi tumori con centro necrotico

• Leucemia monocitica o mielomonocitica. [36, 65]

3.3.5 Linfocitosi

La linfocitosi è caratterizzata da un aumento assoluto del numero di linfociti e può essere causata da:

• Età: gli animali giovani hanno più linfociti degli adulti.

• Vaccinazione: possono comparire i cosiddetti “immunociti”.

• Infezioni croniche: si può avere linfocitosi nell’infezione cronica da Ehrlichia.

• Ipoadrenocorticismo

• Neoplasie: la linfocitosi si può riscontrare in corso di leucemia linfoblastica acuta, leucemia linfocitica cronica ed infine anche in alcuni casi di linfoma. [36, 65]

3.4 Leucopenia

E’ una diminuzione del numero totale di WBC e può essere causata dalla diminuzione di una o più popolazioni leucocitarie. [36, 65]

3.4.1 Neutropenia

E’ una riduzione del numero assoluto dei neutrofili e costituisce la causa più frequente di leucopenia. I neutrofili costituiscono un’importante linea difensiva contro i microrganismi e pertanto la neutropenia predispone ad infezioni secondarie. I meccanismi che possono dare origine a tale alterazione sono vari e possono essere: una richiesta tissutale sopraffacente, con emivita dei neutrofili ridotta, una soppressione della produzione midollare, una granulopoiesi inefficace, un aumento della marginazione dei neutrofili dal pool circolante al pool marginale. Si può quindi avere:

Neutropenia da consumo tissutale acuto: quando la quota di neutrofili che migra nei tessuti eccede le capacità di riserva e produzione del midollo osseo si verifica neutropenia. Questo avviene per processi infiammatori o infettivi così gravi ed acuti che la granulopoiesi non ha il tempo di ricostituire il pool di riserva. In questi casi, oltre ad una diminuzione del numero di neutrofili, si evidenziano in circolo anche forme immature (deviazione a sinistra degenerativa) che il midollo rilascia prematuramente

per fronteggiare la richiesta tissutale. Qualora l’animale sopravviva alla fase iperacuta la neutropenia di solito è seguita da una leucocitosi neutrofilia dopo 72-96 ore. In questo tipo di neutropenia sono in causa soprattutto infezioni iperacute batteriche associate a sepsi ed endotossiemia. [36, 65]

Neutropenia da ridotta produzione midollare: la produzione midollare di neutrofili può essere ridotta in seguito a gravi danni diretti sulle cellule staminali e progenitrici ad opera di vari fattori quali, per esempio, farmaci chemioterapici o immunosoppressivi, radiazioni, tossici, farmaci, infiltrazione neoplastica del midollo osseo, detta mieloftisi. In questi casi il midollo osseo si presenta ipocellulare con una grave riduzione dei precursori granulocitari, eritroidi e megacariocitici. Occasionalmente il midollo può presentare una buona cellularità per una sostituzione da parte di cellule neoplastiche anomale (mieloftisi). Un danno midollare coinvolge tutte le linee cellulari e la neutropenia è solo la prima delle alterazioni che si evidenziano nel sangue periferico a causa della breve emivita dei neutrofili (circa 10 ore). Alcuni agenti infettivi possono essere i responsabili del danno midollare ed in particolar modo il parvovirus e l’Erhlichia canis. Vi è anche una rara forma di neutropenia ereditaria, l’emopoiesi ciclica dei cani da pastore scozzesi grigi, che è caratterizzata da grave neutropenia che ricorre ad intervalli di 11-14 giorni,

probabilmente per un difetto nella regolazione delle cellule staminali. [36, 65]

Neutropenia da granulopoiesi inefficace: la neutropenia è causata da disordini che interrompono la normale maturazione dei granulociti determinando un arresto del loro sviluppo. A livello midollare il numero delle cellule progenitrici è adeguato, il midollo mostra una buona cellularità, con un numero di precursori normale o aumentato (iperplasia del pool di proliferazione), ma le cellule del pool di riserva sono diminuite, dimostrando una maturazione arrestata, e poche cellule vengono rilasciate dal midollo. La malattie associate a questi quadri includono le malattie mieloproliferative, linfoproliferative, sindromi mielodisplastiche ed alcuni agenti citotossici quali la ciclofosfamide e la doxorubicina. [36, 65]

Neutropenia da aumentata emarginazione: è una pseudoneutropenia poiché i neutrofili si spostano dal pool circolante al pool marginale. Le cause che determinano questa ridistribuzione dei neutrofili sono l’endotossiemia e l’anafilassi. La migrazione dei neutrofili nei tessuti potrà dare origine ad una neutrofilia vera e propria. [36, 65]

3.4.2 Eosinopenia

L’ eosinopenia avviene in risposta all’azione di corticosteroidi esogeni ed endogeni. Si associa pertanto allo stress, in cui vi è rilascio di cortisolo, all’ipeadrenocorticismo ed alle terapie con corticosteroidi. Si riscontra anche in molte infezioni o infiammazioni acute, nei disordini metabolici, nei traumi e negli stati dolorosi che rappresentano, nel loro insieme, stimoli importanti al rilascio di cortisolo. I meccanismi con cui i corticosteroidi determinano l’eosinopenia sono: transitorio e reversibile sequestro degli eosinofili nel pool marginale (cessato lo stimolo gli eosinofili tornano in circolo) e una diminuzione della produzione e del rilascio degli eosinofili dal midollo, probabilmente per un’inibizione di citochine specifiche. Nel caso di somministrazione di corticosteroidi l’eosinopenia compare dopo 1- 6 ore e le concentrazioni ritornano normali dopo 12-24 ore. [36, 65]

3.4.3 Basopenia

I basofili sono in numero molto basso nel sangue pertanto, nella conta manuale, è difficile poterne riscontrare una diminuzione, mentre è più facile poterla diagnosticare con uno strumento capace di effettuare un conteggio differenziale automatico. La basopenia si può riscontrare in infiammazioni, anafilassi e somministrazione di corticosteroidi che determina anche abbassamento degli eosinofili. Pare tuttavia che la

diminuzione dei basofili , in caso di somministrazione di corticosteroidi, possa anche non essere presente. [36, 65]

3.4.4 Monocitopenia

Non è un rilievo significativo perché in genere i valori nello striscio di sangue di queste cellule sono ridotti. Inoltre i monociti sono distribuiti nello striscio in modo disuniforme e quindi la conta differenziale su vetrino può essere piuttosto imprecisa. [36, 65]

3.4.5 Linfopenia

E’ una diminuzione del numero assoluto dei linfociti. E’ determinata da varie cause e quindi si può avere:

Linfopenia fisiologica o da stress: la linfopenia dovuta all’azione dei corticosteroidi esogeni o endogeni si realizza attraverso vari meccanismi: ridistribuzione dei linfociti circolanti che rimangono transitoriamente sequestrati nei tessuti linfoidi o nel midollo osseo piuttosto che entrare nel sangue (sembra essere causato da un’inibizione dei recettori endoteliali per i linfociti, mediata dai corticosteroidi) oppure la linfopenia da corticosteroidi può essere causata dalla lisi dei linfociti, detta “effetto

citotossico”, che sembra essere tuttavia un effetto secondario che si verifica in caso di uso prolungato. La linfopenia è l’indicatore di stress più consistente ed affidabile. [36, 65]

Linfopenia da infezioni virali: la linfopenia si riscontra nella fase acuta di molte infezioni virali quali, per esempio, il cimurro e l’epatite del cane. Quando è in atto un’aggressione generalizzata di agenti infettivi i linfociti ricircolanti potrebbero essere bloccati nei linfonodi, siti di incontro con l’antigene, che si presentano reattivi-ingranditi. Questo tipo di linfopenia tende a scomparire nelle fasi successive dell’infezione. [36, 65]

Linfopenia da perdita di linfa: la perdita di linfa ricca di linfociti comporta chiaramente una riduzione di linfociti circolanti. Questa evenienza si verifica solo in due condizioni:

• La perdita di linfa efferente, ricca di linfociti, dal dotto toracico, come avviene nel chilotorace.

• La perdita di linfa afferente, ricca di linfociti, delle strutture linfatiche associate all’intestino, come avviene nella linfangectasia intestinale. [36, 65]

Linfopenia da ridotta produzione: le terapie immunosoppressive e le irradiazioni sopprimono la proliferazione clonale dei linfociti, questo tipo di linfopenia si sviluppa lentamente. Altre cause possono essere le immunodeficienze acquisite, come in alcune infezioni neonatali, che causano atrofia o necrosi timica (linfopenia persistente) ed ereditarie. [36, 65]

3.5 Trombocitosi

Questo disturbo consiste nel prolungato e costante aumento nel conteggio delle piastrine nel sangue periferico. Le cause risiedono in un’aumentata produzione di piastrine indotta da disordini mieloproliferativi (policitemia vera, leucemie), infiammazioni croniche (artrite reumatoide, cirrosi), neoplasie (linfomi, carcinomi, leucemia megacariocitica), infezioni, traumi, emorragie acute (nell’anemia rigenerativa che ne consegue il conteggio delle piastrine si eleva al massimo fino a due volte il valore normale), deficienza di ferro (frequente), iperadrenocorticismo. Inoltre vi può essere un eccessivo rilascio dal midollo in risposta ad esercizio, eccitazione, gravidanza, come risposta farmacologica ad adrenalina e vincristina e per un’elevata persistenza in circolo di piastrine (da splenectomia). [35, 64]

3.6 Trombocitopenia

La trombocitopenia è una diminuzione del numero assoluto di piastrine e può essere causata da vari problemi. Si riscontra pertanto:

Trombocitopenia da aumentata distruzione di piastrine: è la causa più frequente di trombocitopenia. A sua volta è distinguibile in:

• Trombocitopenia d’origine immunomediata: questa può essere

causata da forme primarie od autoimmuni in cui sono prodotti autoanticorpi antipiastrina diretti ed aderenti alla superficie dei trombociti, oppure da forme secondarie ad infezioni (per esempio virali), immunocomplessi (infezione da Ehrlichia), neoplasie (ad esempio in corso di linfoma in quanto è possibile un mancato riconoscimento degli antigeni self da parte dei linfociti neoplastici) ed alla somministrazione di farmaci. In tutte queste situazioni la piastrina può essere uno spettatore innocente poiché esiste un’affinità tra il complesso antigene-anticorpo con la membrana della piastrina stessa oppure perché l’adsorbimento dell’agente (aptene) patogeno o scatenante al trasportatore (membrana della piastrina) stimola la produzione anticorpale di IgG non fissanti il complemento che colpiscono direttamente la membrana piastrinica, in tutti i casi le piastrine così ricoperte da anticorpi sono rimosse prematuramente

dai macrofagi a livello splenico o epatico. Si ritrova anche nel LES o in corso di anemia emolitica immunomediata.

• Trombocitopenia di derivazione non immunologica: si può verificare per azione diretta lesiva sulle piastrine di farmaci (sulfamidici, antibiotici, anticonvulsivanti, antireumatici e tranquillanti) o di agenti infettivi (Ehrlichia canis o Ehrlichia platys) in combinazione ad un danno vascolare. Ciò determina l’aggregazione e la frammentazione delle piastrine (nei danni microvascolari con un comune denominatore che esita nella Coagulazione Intravasale Disseminata) o una contemporanea lesione endoteliale da parte degli agenti infettivi patogeni. Anche la vaccinazione con virus vivi attenuati può provocare aggregazione delle piastrine e un loro allontanamento da parte del sistema macrofagico-monocitico. [35, 64]

Trombocitopenia da diminuita produzione di piastrine: le cause generiche di questo tipo di trombocitopenia sono: ipoplasia, aplasia o mielofibrosi

midollare prodotta da farmaci (estrogeni, diuretici tiazinici,

ciclofosfamide), agenti infettivi (Erhlichia canis e virus in genere), immunomediata, tossici chimici esogeni e/o endogeni, ematopoiesi ciclica e irradiazioni. In genere questo tipo di trombocitopenia è preceduta da

linfopenia e granulocitopenia. Infine sono da segnalare trombocitopenie secondarie a disordini mielo/linfoproliferativi (leucemie) o infiltrativi midollari (ad esempio infezioni fungine quali l’istoplasmosi). Le basi fisiopatologiche alla base del disturbo sono:

• Interferenza con la sintesi proteica o di DNA con inibizione della mitosi (chemioterapici, irradiazione, infezioni virali).

• Produzione di fattori di crescita anormali o la presenza di inibitori o di una competizione per gli elementi nutritivi (infezioni croniche, neoplasie sistemiche).

• Presenza di autoanticorpi (immunomediate).

• Competizione spaziale o di elementi nutritivi (neoplasie,

infiltrazioni).

• Difetti nelle cellule staminali (citopenie cicliche dei pastori scozzesi grigi). [35, 64]

Trombocitopenia da sequestro o perdita di piastrine: queste due cause di trombocitopenia seppur diverse sono accomunate dall’esito finale sulle piastrine cioè una loro riduzione nel letto vascolare. In genere però la riduzione delle piastrine è modesta. Nelle cause di trombocitopenia per sequestro si ha una distribuzione anomala delle piastrine nel letto vascolare precedentemente alterato, come avviene nella splenomegalia (da torsione o da neoplasia), epatopatia (ipertensione portale), vasodilatazione (che

compare nello shock da endotossine generate da Salmonella o batteri Gram negativi che inducono anche una leucopenia per fenomeni di aggregazione e conseguente sequestro nella milza, fegato, polmoni) ed ipotermia. Le cause da trombocitopenia per perdita, conseguente a consumo esagerato, si riconoscono nell’emorragia grave, nella Coagulazione Intravasale Disseminata, nella formazione di trombi secondaria a danno vascolare e nell’aggregazione piastrinica secondaria ad infezioni. [35, 64]

CAPITOLO 4

LASERCYTE

LaserCyte® è un contaglobuli a fascio laser che, rispetto a quello ad impedenza elettrica, riesce a fornire preziose informazioni aggiuntive quali il conteggio differenziale dei leucociti ed il conteggio dei reticolociti, espresso sia in termini relativi che assoluti, per un totale di 24 parametri. Il campione di sangue da analizzare, nella quantità di 1,0-1,5 ml, ha come anticoagulante l’EDTA. Rispetto ai sistemi ad impedenza elettrica la quantità di sangue richiesta per svolgere l’analisi è superiore, tuttavia ciò pone al riparo da eventuali errori in cui si può incorrere utilizzando una esigua quantità di sangue quali, per esempio, un decremento del numero dei globuli rossi e dell’ematocrito e un innalzamento dei reticolociti, delle piastrine e dell’MCHC. All’interno dell’analizzatore, oltre al campione del paziente, si trova un tubo consumabile contenente:

• Nuovo Blu di Metilene: è usato per colorare il reticolo presente nei reticolociti e permette appunto all’analizzatore di conteggiarli

• Soluzione che rende sferici i globuli rossi: ciò consente alle cellule di emettere lo stesso tipo di luce scatter indipendentemente dal loro orientamento

• QualiBeads®: sono delle perline omogenee di Latex e servono per il controllo di qualità automatico

All’inserimento del campione un flusso di sangue intero diluito viene trasportato all’interno di una struttura detta ”cella a flusso” nella quale i globuli bianchi sono costretti a passare in singola fila mentre i globuli rossi possono anche passare appaiati. Tutte queste cellule vengono singolarmente analizzate dal raggio laser e si ottengono degli scatter luminosi che sono raccolti da quattro rilevatori posti in angoli specifici:

• scatter angolo assiale (forward axial scatter)

• scatter angolo in alto (high angle scatter)

• scatter angolo in basso (low angle scatter)

• scatter angolo sinistro (right angle scatter)

Queste rilevazioni forniscono un totale di sette misurazioni prese per ciascuna cellula, ma di queste misurazioni solo cinque vengono tuttavia lette. [13, 28]

4.1 Istogrammi

LaserCyte® fornisce per ciascuna di queste misurazioni un singolo istogramma che riporta sull’ascissa la forza del segnale, sull’ordinata la quantità. Si ottengono pertanto 5 istogrammi che sono:

• Istogramma dell’FSL (Forward Scatter Low): è dato dallo scatter basso e indica la dimensione delle cellule, non risulta influenzato da altre caratteristiche delle cellule stesse, viene usato per misurare l’MCV.

• Istogramma dell’FSH (Forward Scatter High): è dato dallo scatter in alto che è posto solo a due gradi di differenza dal rilevatore dell’FSL. Anche questo parametro indica la misura della cellula, ma fornisce anche informazioni sulla forma del nucleo ed il rapporto nucleo/citoplasma. Più la cellula sarà complessa più alta sarà la forza del segnale.

• Istogramma dell’EXT (Extinction): “estinzione”, indica la densità cellulare che è direttamente proporzionale alla quantità di luce assorbita dalle cellule.

• Istogramma del RAS (Right Angle Scatter): è dato dallo scatter angolo sinistro che è posto a 90 gradi ed indica la complessità e la