Ottimizzazione del protocollo di detection su MCs

6.3.1 Prova di ripetibilità della funzionalizzazione APTES/SA

Per prima cosa si è voluta verificare la riproducibilità del protocollo di funzionalizzazione su MCs, a questo scopo gli array modificati con APTES/SA sono stati caratterizzati in frequenza e ne è stato stimato il ricoprimento superficiale medio per ciascuno di essi.

Nella figura 6.5 è riportato, in shift di frequenza relativa, l’andamento di diversi array funzionalizzati in due differenti prove. Le lettere identificative dei campioni impiegati nella presente prova di ottimizzazione in frequenza, così come quelle utilizzate nelle prove successive, sono attribuite sulla base della posizione di alloggiamento del campione sul disco piezoelettrico.

Figura 6.5 verifica della riproducibilità della funzionalizzazione delle superfici in silicio per mezzo del protocollo APTES/SA: nei

grafici vengono riportate due differenti prove di caratterizzazione in frequenza del layer di funzionalizzazione APTES/SA, l’andamento è riportato in shift di frequenza relativi.

Considerando che il ricoprimento teorico per la formazione di un monolayer di APTES/SA corrisponde a un

Δf/f0=-1.08x10-4, i ricoprimenti sperimentali osservati in queste due prove sono in generale prossimi al valore

teorico. Facendo un confronto tra le prove presentate, si osserva una maggior variabilità, anche se non così elevata, per la prova presentata in figura 6.5 (b). In questo caso, gli shift relativi associati sono prossimi a quello di formazione del monolayer, in particolare sono compresi in un range di Δf/f0 tra -9.0x10-5 e -1.3x10-4. Al

contrario in figura 6.5 (a), si osserva una maggior riproducibilità, per un range di Δf/f0 compreso tra -1.2x10-4 e -

1.5x10-4_{. In generale la riproducibilità del layer di funzionalizzazione viene considerata soddisfacente. Inoltre, il} fatto che gli shift relativi siano prossimi a quello di formazione del monolayer sembra assicurare una buona stabilità della funzionalizzazione al fine del coating con PtG.

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6.3.2 Prova di ripetibilità dell’immobilizzazione di PtG e passivazione con BSA 1%, con confronto tra funzionalizzazione APTES/SA e APTES/GA

All’inizio del capitolo, a riprova della validità del protocollo di funzionalizzazione adottato, è stato mostrato un confronto tra la modifica della superficie con APTES/SA o con APTES/GA. Tenendo presente questa condizione, si è deciso di sviluppare una prova attraverso la quale fosse possibile, non solo verificare la riproducibilità del coating e della passivazione su APTES/SA, ma valutarne l’effettivo miglioramento rispetto all’approccio con APTES/GA. Di seguito vengono riportati in figura 6.6 i grafici di confronto tra le due metodologie. L’andamento dei vari passaggi di funzionalizzazione, coating, passivazione ed incubazione dell’Ab è riportato in shift di frequenza relativi, e le condizioni di incubazione dei campioni sono riportate in tabella 6.1.

Tab.6.1 APTES/SA APTES/GA

B No-PtG/BSA/Ab-HRP F PtG/BSA/Ab-HRP F PtG/BSA/Ab-HRP G PtG/BSA/Ab-HRP H PtG/BSA/No-Ab-HRP H PtG/BSA/No-Ab-HRP J PtG/No-BSA/Ab-HRP J PtG/No-BSA/Ab-HRP K PtG/No-BSA/Ab-HRP K PtG/No-BSA/Ab-HRP L PtG/BSA/Ab-HRP L No-PtG/BSA/Ab-HRP

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Figura 6.6 Confronto ripetibilità funzionalizzazione APTES/SA e APTES/GA, rispettiva stabilità e riproducibilità del coating con PtG: Nei grafici vengono riportati gli andamenti, in shift di frequenza relativi, delle varie fasi del saggio (a-b) funzionalizzazione, (c-d)

coating con PtG, (e-f) passivazione e (g-h) incubazione anticorpo.

Partendo dal confronto tra le funzionalizzazioni, è confermata la maggior riproducibilità del metodo APTES/SA. Di seguito viene riportata la tabella riassuntiva dei valori del ricoprimento sperimentale stimato nei due casi, espresso sia in shift di frequenza relativi sia in molecole/cm2_:

Tab 6.2 Ricoprimento teorico

molecole/cm2_(x1014₎ Ricoprimento sperimentale molecole/cm2 _(x1014₎ Shift in frequenza relativa Δf/f0(x10-4) APTES/SA 3.95 3.86±0.70 -1.06±0.18 APTES/GA 3.95 17.5±4.81 -4.79±1.27

Dalla tabella 6.2 è possibile osservare come la funzionalizzazione con APTES/SA permetta di ottenere un ricoprimento sperimentale molto prossimo a quello teorico, mentre l’approccio APTES/GA restituisce un ricoprimento di molto superiore al doppio rispetto a quello stimato per la formazione del monolayer.

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Viene inoltre osservato come, la minor stabilità e riproducibilità del layer APTES/GA, influisca sul coating con PtG. In figura 6.6 (d) è, infatti, evidente l’elevata variabilità tra i diversi array. Al contrario, nel caso di funzionalizzazione APTES/SA, il coating risulta molto riproducibile e il segnale di aspecifico rientra nel valore di shift relativo legato all’errore strumentale (±6x10-6_{). A differenza di quanto appena osservato, il controllo No PtG} su APTES/GA è caratterizzato da uno shift relativo a valore positivo. Il fenomeno è probabilmente dovuto all’instabilità del layer di funzionalizzazione, che influisce non solo sulla stabilità del coating, ma anche sulla successiva incubazione con l’Ab.

Ritornando all’analisi del coating su APTES/SA, si osservi come i cinque array incubati in PtG presentino una buona riproducibilità. Inoltre, questo tipo di funzionalizzazione permette di raggiungere, in tre casi su cinque, ricoprimenti sperimentali prossimi al range teorico (5.81÷7.35x1012_{). In media il ricoprimento sperimentale} misurato è di 4.25±0.73x1012_{. In tabella 6.3 sono riportati gli shift in frequenza relativa e il corrispondente valore} di ricoprimento di PtG, espresso in molecole/cm2_{, per ciascun array funzionalizzato con APTES/SA.}

Tab 6.3 Ricoprimento sperimentale

molecole/cm2 _(x1012₎

Shift in frequenza relativa Δf/f0 (x10-4₎ B (Blk-No PtG) 0.27 ± 0.17 -0.07± 0.04 F 3.21± 0.28 -0.81± 0.07 H 3.96± 0.68 -1.00± 0.02 J 4.29± 0.31 -1.08± 0.01 K 5.14± 0.41 -1.30± 0.05 L 4.63± 0.33 -1.17± 0.01

Per quanto riguarda la passivazione, osserviamo che dei due controlli No BSA (array J e K) su funzionalizzazione APTES/SA, mostrano un comportamento differente. L’array J presenta uno shift relativo a valore positivo, che rientra però all’interno del range di rumore strumentale, comportamento che ci si sarebbe aspettati a livello teorico; mentre l’array K è caratterizzato da uno shift negativo confrontabile o superiore agli shift osservati per gli array passivati. La necessità di eseguire un’incubazione con BSA dopo il coating con PtG, deriva dal fatto che la passivazione permette di occupare i siti superficiali rimasti liberi, riducendo il segnale aspecifico in fase d’immobilizzazione dell’Ab.

Per quanto riguarda la passivazione su funzionalizzazione APTES/GA, dove i controlli No-BSA sono rappresentati degli array J e K, si osserva un comportamento simile a quello descritto per APTES/SA. In particolare, l’array J presenta uno shift prossimo al livello di errore strumentale, mentre l’array K presenta un evidente shift negativo.

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Per quanto riguarda la caratterizzazione post incubazione con Ab-HRP, si osserva come, indipendentemente dal metodo di funzionalizzazione, la maggior parte degli shift relativi misurati abbia un valore positivo. Tale condizione potrebbe essere imputabile ad una instabilità della passivazione a mezzo BSA durante i successivi lavaggi.