I punti di fusione sono stati determinati con un apparecchio di Reichert Köfler e non sono corretti.
Gli spettri di risonanza magnetica del protone (1H-NMR) sono stati eseguiti in soluzione di dimetilsolfossido esa-deuterato (DMSO-d6) con uno spettrometro Varian Gemini- 200 (200-MHz). La presenza di protoni scambiabili è stata confermata mediante l’uso di D2O.
Le cromatografie su strato sottile (T.L.C.) analitiche sono state realizzate su foglio di alluminio ricoperto di silice (MERCK 60, F-254, spessore 0.2 mm.).
Le cromatografie su colonna sono state effettuate utilizzando gel di silice (MERCK 60, 230-400 mesh ASTM).
1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-(5H)-one 2 (allopurinolo)[11]
Due vials, contenenti ciascuna 300 mg (2,78 mmoli) di 3-aminopirazolo-4-carbonitrile 1 (prodotto commerciale) e una quantità di acido formico sufficiente a coprire tutto il solido presente nella vial, sono poste a reagire addizionando anche una quantità catalitica di acido solforico concentrato. La reazione è svolta con MW, in più cicli consecutivi, con strumento Discover- CEM, impostando i seguenti parametri:
Potenza: 100 W Pressione: 100 psi Temperatura: 120 °C Tempo: 10' Ramp Time: 1' Cooling: On Stirring: Off
Avendo ripetuto più volte questo procedimento è stato visto che tra i vari parametri un eventuale aumento del Ramp Time per evitare un rapido aumento di temperatura e non sottoporre il campione a "stress" risulta essere del tutto inutile. Un ulteriore accorgimento viene preso tra un ciclo e l' altro di MW, aggiungendo in vial nuovamente acido solforico concentrato per catalizzare ulteriormente la reazione ed evitare quindi che possa persistere prodotto non reagito. (Controllo TLC: etile acetato 8 / metanolo 2). Una volta effettuato il controllo con TLC, ed aver quindi accertato che il prodotto partenza sia interamente reagito, la miscela presente nella vial deve poi essere versata lentamente in ghiaccio, quindi si attende il suo completo scioglimento affinché si formi un solido di un giallo molto tenue, che viene poi raccolto per filtrazione sotto vuoto ed essiccato sottovuoto con P2O5 come agente disidratante.
Si ottengono da questa reazione 0.523 mg di composto puro.
Resa: 69%
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 2 sono riportate nella Tabella 1.
4-Cloro-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina 3 Metodo convenzionale.[11]
L’intermedio 2 deve essere alogenato sul 4-ossidrile affinché diventi un buon substrato per le successive reazioni di sostituzione. Si pone in un palloncino, munito di refrigerante e tappo al cloruro di calcio, 300 mg (2,21 mmoli) di 2 al quale si aggiungono 7,5 mL di ossicloruro di fosforo POCl3 con funzione di agente clorurante, in presenza di 0,9 mL di
N,N-dimetilanilina. Il processo è svolto alla temperatura di 100°C (controllo con TLC;
eluente: etile acetato). L’eccesso di POCl3 è eliminato per evaporazione a pressione ridotta
e il residuo è trattato con ghiaccio, dopodichè la soluzione risultante è estratta con etile acetato; la fase acquosa è scartata, quella eterea è sottoposta a lavaggio con acqua ed essiccamento su MgSO4. Dall’evaporazione si raccoglie un solido giallo limone mg: 321.
Resa: 94%
Metodo con microonde:
Si preparano due vials e, in ciascuna di esse, a 100 mg di 2 si addiziona una quantità di POCl3 sufficiente a coprire tutto il solido e 0,1 L di N,N-dimetilanilina. La reazione è
svolta con MW, in due cicli consecutivi, con strumento Discover-CEM, impostando i seguenti parametri:
Potenza: 100 W Pressione: 100 psi Temperatura: 90 °C Tempo: 1' + 4'
Le soluzioni finali ottenute, di colore rosso scuro, sono riunite e versate lentamente in ghiaccio: si ottiene una soluzione che è estratta con etile acetato, lavata con acqua ed essiccata su MgSO4. Ciò che si ottiene viene evaporato a pressione ridotta in modo tale da
allontanare il solvente di estrazione e ciò che si ottiene da questo processo è un solido di colore giallo che corrisponde al cloro derivato 3.
Resa: 48%
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 3 sono riportate nella Tabella 2.
N-(4-metossifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 4a
(R)-N-[1-(4-metossifenil)etil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 4b
Si pongono a reagire 200 mg di 4-cloro-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina 3 (1,30 mmoli) con una quantità equimolare dell’ammina idonea ad ottenere il prodotto finale voluto, in 0,5/1 mL di toluene anidro, in presenza di 0,18 mL di trietilamina (1,30 mmoli). Per entrambi i prodotti si è scelto di svolgere le reazioni alle MW (Biotage-Initiator), impostando i seguenti valori:
Temperatura: 110°C Assorbimento: Normale Tempo: 40' + 40'
(Controllo TLC: etile acetato 8 / metanolo 2).
La sospensione finale è filtrata sotto vuoto; nel caso del composto 4a il prodotto precipita insieme al cloridrato di trietilammina formatosi (solido verde salvia chiaro) e nel residuo della soluzione toluenica evaporata a secchezza è presente una quantità trascurabile di prodotto finale. Il solido grezzo ottenuto è lavato con acqua, essiccato e cristallizzato da etile acetato, ottenendo 80 mg di prodotto giallo chiaro puro.
Resa: 4a: 30%
Nel caso del composto 4b quasi tutto il prodotto grezzo è ottenuto per evaporazione delle acque madri tolueniche, mentre il solido ottenuto per filtrazione della sospensione finale è costituito quasi completamente da cloridrato di trietilammina. Il residuo è ripreso con etile acetato e la soluzione è lavata con acqua, essiccata su MgSO4 ed evaporata a
pressione ridotta, ottenendo un residuo che è purificato per cromatografia su colonna di gel di silice (Ø = 1 cm; h = 7 cm) eluendo con una miscela etere di petrolio/etile acetato a polarità crescente, monitorando attentamente la presenza di una in purezza fluorescente alla lampada UV con Rf vicino a quello del prodotto desiderato. Si ottengono 133 mg di prodotto finale puro.
Resa: 4b: 38%.
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche dei composti 4a, 4b sono riportate nella Tabella 3.
6-Metilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-(5H)-one 5
Si effettua una reazione di ciclizzazione sul 3-aminopirazolo-4-carbonitrile 1 (300 mg, 2,78 mmoli) addizionandovi 1,0 mL di acido acetico glaciale in presenza di una quantità catalitica di acido solforico concentrato, impostando alle MW i seguenti valori, da ripetere in due cicli:
Potenza: 100W Pressione: 100psi Temperatura: 130°C Tempo: 1' + 10'
Così come per l'ottenimento del composto 2, anche in questo caso la reazione di ciclizzazione avviene in più passaggi alle MW, e l'accorgimento preso prevede l'aggiunta tra un ciclo e l'altro di nuovo acido solforico concentrato in modo tale da catalizzare ulteriormente la reazione evitando che rimanga dell'intermedio non reagito. a questo punto si procede con la TLC di controllo in miscela eluente etile acetato 8 / metanolo 2. A reazione avvenuta, la miscela viene versata direttamente in ghiaccio. Una volta che il ghiaccio si è completamente sciolto, si inizia ad osservare la graduale solidificazione del prodotto, che richiede alcune ore per solidificare completamente. A questo punto mi servo del crogiolo per filtrare il precipitato che verrà poi posto in essiccatore al fine di ottenere un prodotto solido bianco (270 mg).
Resa: 65%
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 5 sono riportate nella Tabella 1.
4-Cloro-6-metilpirazolo[3,4-d]pirimidina 6
Metodo con microonde: In due vials separate (2-5 mL), ciascuna contenente 100 mg (0,66
mmoli) di 5, si addiziona una quantità di POCl3 sufficiente a coprire tutto il solido e 0,1 mL
di N,N-dimetilanilina. La reazione è svolta con MW, in due cicli consecutivi, con strumento Discover-CEM, impostando i seguenti parametri:
Potenza: 90 W Pressione: 100 psi Temperatura: 110°C Tempo: 1' + 4'
La miscela finale contenuta nelle due vials, di colore rosso scuro, è versata lentamente in ghiaccio: si ottiene una soluzione che è estratta con etile acetato, lavata con acqua ed essiccata su MgSO4. Per evaporazione della soluzione organica si ottiene un solido di
colore giallo che corrisponde al cloro derivato. Questa procedura non ha portato, nel mio caso, ad esito positivo ed è per questo che la reazione nei successivi tentativi è stata portata avanti con metodo tradizionale.
Metodo tradizionale: L'intermedio 5 deve essere alogenato in modo tale da risultare un
substrato ottimale per le successive reazioni. In un palloncino da 10 ml, munito di refrigerante, tappo al cloruro di calcio e magnete, si addiziona 270 mg(1,8 mmoli) di composto 5, 8 ml di POCl3 mantenendo il tutto in agitazione ed infine 0,81 ml di N,N-
dimetilanilina. Il tutto verrà poi posto in bagno ad olio precedentemente riscaldato alla temperatura di 100°C. Ciò che si ottiene subisce poi un processo di evaporazione a pressione ridotta, evitando di portare il tutto a secco. A questo punto il prodotto ottenuto viene versato in una modesta quantità di ghiaccio a goccia a goccia, ma in modo rapido per evitare contatto prolungato con l'aria, agitando nel frattempo con una bacchetta di vetro. Si ottiene una soluzione che viene poi estratta con acetato di etile, lavata con acqua ed infine essiccata con MgSO4. Per evaporazione della soluzione organica si ottiene un solido di
colore giallo (80 mg) che corrisponde al cloro derivato.
Resa: 26%
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 6 sono riportate nella Tabella 2.
N-(4-metossifenil)-6-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 7a
Si pongono a reagire 70 mg di 4-cloro-pirazolopirimidina 6 (0,47 mmoli) con una quantità equimolare di p-anisidina (58 mg), in 0,5/1 mL di toluene anidro, in presenza di 0,07 mL di trietilamina (0,47 mmoli). Con strumento MW (Biotage-Initiator), impostando i seguenti valori:
Temperatura: 110°C Assorbimento: Normale Tempo: 40' + 40'
(Controllo TLC: etile acetato 8 / metanolo 2).
La sospensione finale è filtrata sotto vuoto; il solido ottenuto è lavato con acqua, per eliminare il cloridrato di trietilammina formatosi; dalla soluzione toluenica evaporata a secchezza si ottiene come residuo altro prodotto grezzo. Il solido grezzo ottenuto è purificato per cromatografia su colonna di gel di silice (Ø = 0.5 cm; h = 3 cm) eluendo con etile acetat.o Si ottengono 22 mg di prodotto finale puro.
Resa: 47a: 18%.
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 7a sono riportate nella Tabella 3.
1-Benziliden-2-metilidrazina 8[12]
In un pallone, munito di refrigerante e tappo al cloruro di calcio aggiungo 2,4 mL (0,045 moli) di metilidrazina e 4,44 mL (0,045 moli) di benzaldeide, entrambi prodotti commerciali, in 12 mL di etanolo, e si fa reagire la miscela (110 °C) per 3 ore a reflusso. Controllo poi con TLC usando miscela eluente cicloesano 7/etile acetato 3. Dopo due ore è possibile aggiungere un leggero eccesso di metilidrazina in ambiente di reazione. La miscela di reazione, dopo raffreddamento a temperatura ambiente, viene posta nel rotavapor per eliminare il solvente residuo. Dopo questa fase la miscela di reazione si presenta come un olio giallo limpido, dal quale si ottiene il prodotto 1-benziliden-2- metilidrazina 8, utilizzato per le successive reazioni senza ulteriore purificazione.
β-(2-Benziliden-1-metilidrazina)-α-cianoacrilato di etile 9[16]
Si fanno reagire 3,0 g di 1-benzilen-2-metilidrazina 8 (0,023 mmoli) con 3,9 g (0,023 mmoli) di etil(etossimetilen)cianoacetato (prodotto commerciale) solubilizzandolo in 10 mL di toluene distillato: la miscela viene posta a reagire per 3 ore, a 110°C, a reflusso. Viene poi effettuato controllo con TLC usando miscela eluente cicloesano 4/etile acetato 6. La sospensione finale, gialla e molto densa, viene filtrata sottovuoto lavando con toluene, ed il solido giallo limone ottenuto viene raccolto.
Resa: 81%
Caratteristiche fisico-chimiche e spettroscopiche del derivato fenilidrazonico 9
N N COOC2H5 CN C H3 Formula p.f. (°C) solv. crist. 1 H-NMR(DMSO-d6) (ppm) C14H15N3O2 153-155 Etile acetato 1.24 (t, 3H, CH2CH3); 3.61 (s, 3H, NCH3); 4.09-4.14-4.24 (q, 2H, CH2CH3); 7.45-7.48 (m, 3H, H3′, H4′, H5′); 7.94-7.98 (m, 2H, H2′, H6′); 8.07 (s, 1H, CH); 8.17 (s, 1H, CH).
1-Metil-3-amino-4-carbetossi-1H-pirazolo 10[16]
Una quantità di intermedio fenilidrazonico 9 pari a 3,40 g (0,013 moli) è sottoposta ad una reazione che porta alla ciclizzazione della catena laterale del fenile, operando in soluzione etanolica a caldo (110°C per 3h), per aggiunta di 3 mL di acido cloridrico concentrato, 1 mL dei quali soltanto dopo 2h dall’inizio del processo (Controllo TLC: etile acetato 9/metanolo 1). La miscela di reazione è sottoposta ad una serie di trattamenti: in primo luogo, deve subire un’evaporazione al rotavapor, per poi essere lavata con etere di petrolio 30-60 °C e nuovamente evaporata. Segue l’essiccamento, volto ad eliminare ogni traccia di solvente; il prodotto, dalla consistenza gelatinosa e color marrone scuro, viene disciolto in acqua ed il suo pH neutralizzato con K2CO3. Da questa soluzione si estrae con etile
acetato, che per effetto della presenza del pirazolo disciolto si imbrunisce: la fase acquosa contiene KCl e solo tracce di pirazolo e viene quindi scartata, mentre la fase organica è lavata con acqua e poi sottoposta a essiccamento con MgSO4·xH2O. Dopo un passaggio al
rotavapor, infine, in presenza di una minima quantità di etere di petrolio 30/60°C il prodotto biancastro solidifica (1,22 g); (controllo TLC: etile acetato 9/ metanolo 1). Un campione analitico è ottenuto per cristallizzazione da diclorometano/etere di petrolio 60-80 °C.
Resa: 55%.
Caratteristiche fisico-chimiche e spettroscopiche del derivato N1-metilpirazolico 10
N N N H2 H5C2OOC CH3 *Scambia con D2O Formula p.f. (°C) solv. crist. 1 H-NMR(DMSO-d6) (ppm) C7H11N3O2 92-93 CH2Cl2 Etere di petrolio 60-80°C 1.23 (t, 3H, CH2CH3); 3.61 (s, 3H, NCH3); 4.09-4.20 (q, 2H, CH2); 5.32 (bs, 2H, NH2)*; 7.88 (s, 1H, H5).
2-Metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-(5H)-one 11[14]
In un pallone da 25 mL viene posto a reagire 1,0 g dell’intermedio pirazolico 10 (0,00591 moli) con 3,5 mL di formamide in condizioni di reazione energiche: 210°C per 6 ore a reflusso (Controllo TLC: etile acetato). Dopo raffreddamento la miscela si presenta come una sospensione marrone, la cui frazione solida viene filtrata sottovuoto e lavata con metanolo: abbiamo ottenuto il nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico, un solido marrone chiaro a grana molto fine (625 mg). Il prodotto può essere purificato sia per cristallizzazione da metanolo che per cromatografia su colonna, eluendo con etile acetato 99/acido acetico 1.
Resa: 71 %.
Le caratteristiche chimico-fisiche e spettroscopiche del composto 11 sono riportate nella Tabella 1.
Tabella 1
Caratteristiche fisico-chimiche e spettroscopiche dei derivati pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-oni
N N H N N O R R1 N R R1 Formula p.f. (°C) solv. crist. 1 H-NMR (DMSO-d6) (ppm) 2 H H C5H4N4O 213-214 H2O 8.01 (s, 1H, H6); 8.13 (s, 1H, H3); 12.02 (s, 1H, CONH)*; 13.68 (bs, 1H, NH) *. 5 CH3 H C6H6N4O >300 2.32 (s, 3H, CH3); 8.02 (s, 1H, H3); 11.93 (s, 1H, NH)*. 11 H CH3 C6H6N4O 293-294 MeOH 4.00 (s, 3H, CH3); 7.96 (s, 1H, H6); 8.50 (s, 1H, H3); 11.75 (bs, 1H, NH)*. *Scambia con D2O
Tabella 2
Caratteristiche fisico-chimiche e spettroscopiche dei derivati 4-cloropirazolo [3,4-d]pirimidinici N N N N H Cl R *Scambia con D2O N R Formula 1H-NMR (DMSO-d6) (ppm) 3 H C5H3N4Cl 8.45 (s, 1H, H6); 8.82 (s, 1H, H3); 14.5 (bs, 1H, NH). 6 CH3 C6H5N4Cl 2.66 (s, 3H, CH3); 8.34 (s, 1H, H3); 11.93 (s, 1H, NH)*.
Tabella 3
Caratteristiche fisico-chimiche e spettroscopiche dei prodotti finali 4a, 4b, 7a
N N N N H N R 1 H R N R R1 Formula p.f. Solv. crist./ (Eluente) 1 H-NMR (DMSO-d6) (ppm) 4a H OCH3 >200 Etile acetato 3.75 (s, 3H, OCH3); 6.94-6.98 (d, 2H, H3′ e H5′); 7.64-7.68 (d, 2H, H2′ e H6′); 8.08 (bs, 1H, NH)*; 8.30 (s, 1H, H3); 9..86 (s, 1H, H3); 13.55 (s, 1H, NH) *. 4b H OCH3 CH C H3 (R) C14H15N5O >200 Etile acetato (Etere di petrolio/Etile acetato) 1.48 (d, 3H, CH3); 3.71 (s, 3H, OCH3); 5.44 (m, 1H, CHCH3); 6.83-6.88 (m, 2H, H3′ e H5′); 7.28- 7.32 (m, 2H, H2′ e H6′); 8.14, 8.17 (2s, 2H, H3 + H6); 8.43 (d, 1H, NH)*; 13.30 (bs, 1H, NH) *. 7a CH3 OCH3 148-150 (Etile acetato) 1.99 (s, 3H, CH3); 3.70 (s, 3H, OCH3); 6.83-6.87 (d, 2H, H3′ e H5′); 7.44-7.48 (d, 2H, H2′ e H6′); 9.76 (s, 1H, H3)*. *Scambia con D2O
Bibliografia
[1] E. Pasquier, M. Kavallaris. Microtubules: A Dynamic Target in Cancer Therapy.
IUBMB Life (2008) 60 (3): 165-170.
[2] A. Krebs, K.N. Goldie, A. Hoenger. Structural rearrangements in tubulin following microtubule formation. EMBO reports (2005) 6, 227-232.
[3] S. Chakraborti, D. Chakravarty, S. Gupta, B. P. Chatterji, G. Dhar, A. Poddar, D. Panda, P. Chakrabarti, G.Dastidar, B. Bhattacharyya. Discrimination of Ligands with Different Flexibilities Resulting from the Plasticity of the Binding Site in Tubulin.
Biochemistry (2012), 51, 7138−7148.
[4] R.B.G. Ravelli, B. Gigant, P.A. Curmi, I. Jourdain, S. Lachkar, A. Sobel, M.Knossow. Insight into tubulin regulation from a complex with colchicines and a stathmin-like domain, Nature (2004) 428, 198-202.
[5] A. Massarotti, A. Coluccia, R. Silvestri, G. Sorba, A. Brancale. The Tubulin Colchicine Domain: a Molecular Modeling Perspective, ChemMedChem (2012) 7, 33-42.
[6] V. Karavasilis, A. Reid, R. Sinha, J.S. De Bono, Chapter 17: “Cancer drug resistance” 405-423, Cancer Drug Design and Discovery (2007) Elsevier.
[7] A. Gangjee, Y. Zhao, L. Lin, S. Raghavan, E.G. Roberts, A.L. Risinger, E. Hamel, S.L. Mooberry. Synthesis and Discovery of Water-Soluble Microtubule Targeting Agents that Bind to the Colchicine Site on Tubulin and Circumvent Pgp Mediated Resistance, Journal
of Medicinal Chemistry (2010) 53, 8116-8128.
[8] M.M. Kandeel, L.W. Mohamed, M.K. Abd El Hamid, A.T. Negmeldin. Design, synthesis, and Antitumor Evaluation of Novel Pyrazolo[3,4-d]pyrimidine Derivatives,
Scientia Pharmaceutica (2012) 80, 531-545.
[9] G. Bocci, A. Fioravanti, C. La Motta, P. Orlandi, B. Canu, T. Di Desidero, L. Mugnaini, S. Sartini, S. Cosconati, R. Frati, A. Antonelli, P. Berti, P. Miccoli, F. Da Settimo, R. Danesi. Antiproliferative and proapoptotic activity of CLM3, a novel multiple tyrosine kinase inhibitor, alone and in combination with SN-38 on endothelial and cancer cells. Biochemical Pharmacology (2011) 81, 1309-1316.
[10] A. Antonelli, G. Bocci, C. La Motta, SM. Ferrari, P. Fallahi, A. Fioravanti, S. Sartini, M. Minuto, S. Piaggi, A. Corti, G. Alì, P. Berti, G. Fontanini, R. Danesi, F. Da Settimo, P. Miccoli. Novel Pyrazolopyrimidine Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors with Antitumoral Activity in Vitro and in Vivo in Papillary Dedifferentiated Thyroid Cancer.
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism (2011) 96, E288-E296.
[11] R. K. Robins. Potential Purine Antagonists. I. Synthesis of Some 4,6-Substituted Pyrazolo[3,4-d]pyrimidines, Journal of the American Chemical Society (1955) 78, 784- 790.
[12] D. Todd. The Wolff-Kishner Reduction. I. The Preparation and Properties of N-Alkyl- and N,N-Dialkylhydrazones, Journal of the American Chemical Society (1949) 71, 1353- 1355.
[13] S. Senda, K. Hirota, G-N. Yang. Pyrimidine Derivatives and Related Compounds. XIII. The Synthesis of N-subsituted Pyrazolo[3,4-d]pyrimidines from Pyrazole Derivatives, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (1972) 20, 391-398.
[14] P. Schmidt, K. Eichenerger, M. Wilhelm, J. Druey. Pyrazolo-pyrimidine IV. Über Amino-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine, Helvetica Chimica Acta (1959) 84, 763-772.
[15] Cytoskeleton, Inc. V3.0 Tubulin Polymerization Assay Kit (Porcine Tubulin and
fluorescence based)
[16] P. Schmidt, K. Eichenerger, M. Wilhelm, J. Druey. Pyrazolo-pyrimidine III. Paraxanthin-, Theobromin- und Theophyllin-Analoga der Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Reihe,