Il test biologico, eseguito sui prodotti finali, è effettuato utilizzando il kit "Tubulin Polymerization Assay Kit" prodotto dalla Cytoskeleton, Inc.
1.Introduzione al saggio.
Questo tipo di saggio si basa su una procedura one step per la determinazione degli effetti di farmaci o proteine sulla polimerizzazione delle tubuline. Il processo di polimerizzazione è seguito da un incremento di fluorescenza conseguente all'incorporazione di un marcatore fluorescente nei microtubuli. Il saggio standard usa tubulina neuronale (Cat. # T240) che porta alla formazione di una curva di polimerizzazione rappresentante le tre fasi della formazione del microtubulo, chiamate: nucleazione (Fase 1 in Fig. 1), crescita (Fase 2 in Fig.1) e stato stazionario di equilibrio (Fase 3 in Fig. 1).
Figura 9. Reazione di polimerizzazione in assenza ed in presenza di farmaci antimitotici
Spesso composti o proteine che interagiscono con le tubuline alterano una o più fasi della polimerizzazione. Ad esempio, la Fig. 1 mostra gli effetti dell'aggiunta di un farmaco antimitotico, il Paclitaxel, alla normale reazione di polimerizzazione. A 3mM, il Paclitaxel elimina la fase di nucleazione e aumenta la Vmax nella fase di crescita.
Questo test usa tubulina altamente purificata proveniente dal cervello suino, con un grado di purezza superiore al 99%. La qualità, quindi il grado di purezza, è essenziale per ottenere risultati ottimali.[15]
2. Esecuzione del saggio 2.1. Fluorimetro
Le fasi di polimerizzazione sono seguite da un notevole aumento della fluorescenzaa 410-460 nm per più di 60 minuti alla temperatura di 37°C, è quindi richiesto un fluorimetro con il quale si possa regolare la temperatura e che possa leggere a 410-460 nm, con filtri di eccitazione di 340-360 nm.
2.2. Tecnica di pipettaggio e scelta della pipetta
Andremo ad analizzare il caso in cui la pipetta utilizzata è a singolo canale, ottimale per procedere con un numero di campioni che va da 1 a 8, e che quindi rispecchia il nostro caso, dovendo analizzare tre prodotti finali. La cosa importante durante il pipettaggio è cercare di finire tutta la tubulina in meno di 1 minuto. Quindi più l'operatore ha familiarità con la pipetta, minore sarà la variabilità tra i campioni, ed è per questo motivo che viene consigliata, prima di eseguire questo passaggio, la pratica con BSA (Bovine
Serum Albumin). Il secondo importante aspetto da evitare, è la formazione di bolle nei
pozzetti dopo il pipettaggio, in quanto questi porterebbero durante la lettura ad un falso positivo. Generalmente queste bolle si formano quando vengono utilizzate altezze o tecniche di pipettaggio errate. E' consigliato l'uso di punte per pipetta a bassa altezza mantenendo una media velocità di pipettaggio.
2.3. Temperatura
La polimerizzazione della tubulina in questo test è regolata dalla temperatura. A 37°C la tubulina polimerizza nei microtubuli, mentre a 4°C i microtubuli depolimerizzano nelle varie subunità della tubulina. E' inoltre necessario mantenere la tubulina in ghiaccio prima di trasferirla nei pozzetti per la polimerizzazione a 37°C.
2.4. Preparazione del composto di prova
Un punto ottimale di partenza per la preparazione del composto è quello di aggiungere 2 mM di soluzione del composto stesso in DMSO; questo viene poi diluito in acqua alla concentrazione 10x desiderata. Se non è possibile solubilizzare il composto a questa concentrazione, allora il DMSO può essere sostituito con etanolo. Durante la fase di preparazione del campione è importante accertarsi di alcune condizioni :
Mantenere il pH tra 6,5 - 7,0
Non usare tamponi contenenti calcio
3. Preparazione delle soluzioni
Componenti del kit Ricostituzione Condizioni di
stoccaggio
Tampone 1 (BP01)
1. Ricostituire ciascuna bottiglia con 10 ml di acqua Milli- Q(20 ml totali), acqua altamente purificata e deionizzata. 2. Preserva il contenuto delle bottiglie.
3. Aliquote da 13 x 1.5 ml di volume e congelarle a -70°C.
Stoccare a -70°C Stabile per un massimo di 6 mesi Tampone tubulina/glicerolo (Tampone cuscino) (Cat. #BST05-001)
Non è necessario alcun tipo di ricostituzione.
Stoccare a -4°C Stabile per un massimo di 6 mesi
Riserva di GTP (Cat. #BST-06-001)
1. Ricostituire ciascuna delle tre tubicini con 100 µl di acqua distillata e sterile ghiacciata. (totale 300 µl)
2. Porre in ghiaccio.
3. Preserva il contenuto dei tubicini
4. Aliquote da 13 x 20 µl di volume e congelarle a -70°C.
Stoccare a -70°C Stabile per un massimo di 6 mesi
Tubulina (Cat. #T240-DX)
1. Porre la bottiglia da 10mg di tubulina T240-DX in ghiaccio, munirsi di azoto liquido conservato in un dewar. 2. Etichetta dodici criotubi "Riserva tubulina, 10 mg/ml" e ponili in ghiaccio pronti per essere utilizzati.
3. Scongela 20µl di GTP stoccato.
4. Mescola 1.5ml del Tampone 1 ghiacciato con 15µl di GTP stoccato.
5. Ri-sospendere completamente la tubulina in polvere con i restanti 1.1 ml di Tampone 1.
6. Mantenere in ghiaccio per almeno 2 minuti in modo da permettere la ri-sospensione.
7. Porre nei criotubi etichettati aliquote da 12 x 88 µl e farle congelare in azoto liquido.
8. Conservare a -70°C. Stoccare a -70°C Stabile per un massimo di 6 mesi Riserva di Paclitaxel (Cat. #TXD01)
Ricostituire il tubicino di Paclitaxel con 100 µl di DMSO. Congelare a -70°C oppure a -20°C
Stoccare a -70°C Stabile per un massimo di 6 mesi
4. Protocollo sperimentale di saggio
Questo tipo di test standard può essere utilizzato per determinare inibitori e promotori, le condizioni sono: 2 mg/ml di tubulina in una pipetta da 80mM a pH 6.9, 2.0 mM di Cloruro di Magnesio, 0.5 mM di EGTA, 1.0 mM di GTP e 15% di glicerolo. Un accorgimento che può essere adottato per la ricerca di inibitori, come nel nostro caso, è quello di utilizzare il 20% di glicerolo, ricordandosi di prestare particolare attenzione alla temperatura in quanto la polimerizzazione della tubulina è strettamente correlata a questo parametro.
1. Azionare il fluorimetro e inserire i parametri prestabiliti.
2. Posizionare i pozzetti (Corning Costar, Cat. #3686) nel fluorimetro e riscaldare a 37°C per 10 minuti.
3. Scongelare il paclitaxel stoccato e porre 5 µl di questo in 325 µl di acqua sterile e distillata a temperatura ambiente. Mantenere poi questa a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
4. Preparare 10x soluzioni madre dei composti di prova o delle proteine di interesse come descritto in sezione 2.4.
5. Non continuare fino a quando i composti non sono completamente pronti.
6. Scongelare 1.5 ml di Tampone 1 e porlo in ghiaccio.
7. Scongelare 20µl di GTP e porlo in ghiaccio.
8. Rimuovere il tampone di tubulina/glicerolo dalla temperatura di 4°C e porlo in ghiaccio.
9. Scongelare 88 µl di tubulina (880 µg) in un bagno ad acqua a temperatura ambiente fino a quando non diventa liquido, quindi porlo immediatamente in ghiaccio.
10. Mescolare poi immediatamente i vari componenti del test (scegliendo a priori se le condizioni da operare sono standard, per inibitori o per promotori)
11. Pipettare 5µl del tampone di controllo nel primo doppio pozzetto A1 e B1. Pipettare poi 5 µl del 10x paclitaxel nel C1 e D1 seguito da 5 µl del composto in esame nei pozzetti E1 e F1.
12. Porre poi la piastra nell'apposito lettore riscaldante per 1 minuto circa, non di più perchè in questo caso i 5 µl del composto evaporerebbero rapidamente.
13. Pipettare 50 µl della miscela di reazione della tubulina, in ciascuno dei pozzetti utilizzati servendosi di una pipetta a singolo canale. E' importante agire rapidamente, mantenendo una media velocità di pipettaggio, tenendo la punta della pipetta contro le pareti del pozzetto in modo tale da evitare la formazione di bolle che come precedentemente detto andrebbero a disturbare la lettura dell'assorbanza portando ad un falso positivo.
14. Iniziare immediatamente la lettura. Se il software subisce un crash durante i primi 5 minuti di lettura, vale la pena riavviare il protocollo poiché alcuni elementi possono essere recuperati.