5. Materiali e Metodi
5.2. Parte sperimentale:
Sintesi ± (E)-1,1-dietossinon-2-en-4-olo (5):
In un pallone da 100 mL, a 2 colli dotato di refrigerante ed ancoretta magnetica, è stato caricato 1 ml di 1-otten-3-olo 22 (837 mg, 1equiv, 6.5 mmol) e 35 mL di DCM. Successivamente, sono stati aggiunti 3 mL di acroleina dietilacetale 23 (2.6 g ,2.3 eq, 19.5 mmol) e 138 di catalizzatore Grubbs di 2° generazione mg (0.025 eq, 0.1625 mmol). La miscela di reazione così ottenuta è lasciata in agitazione a temperatura ambiente ed il suo andamento è stato seguito tramite analisi GLC con prelievi effettuati ogni 2 ore. Dopo 6 ore la reazione è stata fermata, il solvente allontanato a pressione ridotta a temperatura ambiente ed il prodotto grezzo così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice, impiegando come miscela eluente una soluzione di etere di petrolio/acetato di etile in proporzione 80/20. Le frazioni cromatografiche contenenti il prodotto sono riunite e concentrate, fornendo 1.02 g di un liquido color ruggine. Una successiva purificazione tramite distillazione ha permesso di ottenere 792 mg di un liquido incolore con una resa del 53%. La caratterizzazione spettroscopica effettuata è in completo accordo con i dati riportati precedentemente in letteratura26:
1H-NMR (400 MHz, CDCl
3) δ: 0.87–0.90 (m, 3H, CH3), 1.20 (t,6H, 2xCH3), 1.30–1.34 (m, 6H, 3xCH2),1.55 (m, 2H, CH2), 3.48–3.52 (m, 2H, CH2), 3.62–3.66 (m, 2H, CH2),4.15 (s, 1H, CH), 4.89–4.91 (m, 1H, CH),5.66–5.71 (m, 1H, CH), 5.84–5.88 (m, 1H, CH).
48 Separazione (S)-otten-3-olo propanoato 24, (R)-otten-3-olo R-22:
In un pallone da 100 mL, a 1 collo dotato ancoretta magnetica, sono stati caricati 2.5 ml di ± 1- otten-3-olo 22 ( 2.1 g, 1equiv, 16 mmol ) e 30 mL dietere diisopropilico. Successivamente, sono stati aggiunti 11 mL di propanoato di vinile (6.5 eq, 97.5 mmol) e 214 mg di Cal-B (5000U/g). Dopo 21 ore la miscela di reazione è stata filtrata su celite ed il solvente allontanato a pressione ridotta. I composti S-24 e R-22 sono stati separati tramite cromatografia flash utilizzando in sequenza due miscele eluenti: EtP/AcOEt in proporzione 97/3 e EtP/AcOEt in proporzione 90/10. La prima miscela ha permesso di recuperare l’estere, la seconda di recuperare l’alcol. In tal modo è stato possibile recuperare il composto S-24 con resa del 90% e il composto R-22 con una resa dell’86%.1HNMR (S-1-octen-3-olo-propanoato) δ= 0.88(t 3H), 1.19 (t, 3H), 1.26-1.63(m 8H), 2.32 (q ,2H), 5.11-5.29(m, 3H), 5.70-5.87(m, 1H). Di seguito i valori di eccesso enantiomerico delle due molecole. e.e S-24 : 99% (Perkin Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm))R.t (S)24.73 min (R)23.81min Conc: 11.7 mg/mL; Solv: Cloroformio; Lunghezza d’onda: 589.3 nm; Temp: 22.5 °C
e.e R-22 :99% Perkin Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm) R.t (R) 22.91 min (S) 25.57 min Conc: 12.5 mg/mL (litIV. ).; Solv: Cloroformio; Lunghezza d’onda: 589.3 nm; Temp: 22.5 °C
Segno e valore assoluto di potere ottico rotatorio dell’alcol sono coerenti con i dati di letteratura, mentre non ci sono dati in letteratura relativi all’estere.
IV A. F. Badenhop, W. F. Wilkens, The formation of 1-octen-3-o1 in soybeans during soaking journal of the oil chemists' society, 46,
49 (S)-otten-3-olo S-22:
In un pallone da 50 mL, a 2 colli dotato di ancoretta magnetica, sono stati caricati 1.3 g di S-24 (1equiv, 7.1 mmol) e 10 mL di MeOH acquoso (80%), e 2 g di K2CO3. La risultante miscela è lasciata sotto agitazione per 3h. Successivamente la miscela di reazione è stata diluita con etere etilico, e le due fasi separate. La fase acquosa è stata lavata 3 volte con etere. Le fasi organiche riunite sono state anidrificate su solfato di sodio, filtrate e concentrate a pressione ridotta. Sono stati ottenuti 0,81 g di S-22 con una resa dell’ 89%. 1HNMR 200 MHz ((3S)1-octen3-olo) δ = 0.86 (t, 3H, CH3CH2), 1.26-1.47 (m, 8H), 3.98 (m, 1H), 5.07-5.30 (m, 2H), 5.79-5.96 (m, 1H).
I dati NMR sono coerenti con quelli riportati in letteratura28;
L’eccesso enatiomerico è stato calcolato tramite una analisi GLC (Dani GC 1000) equipaggiato con colonna Chiraldex G-TA (20m x 0.25 mm x 0,25 μm )
e.e S-22 : 97% R.t (R): 22.91 min; R.t (S): 25.57 min
+ 9,1 Conc: 5 mg/mL; Solv: Cloroformio.(litV + 9 )
50 (4R)(E)-1,1-dietossinon-2-en-4-olo (S-5):
In un pallone da 100 mL, a 2 colli dotato di refrigerante ed ancoretta magnetica, sono stati caricati 824 mg di 1-otten-3-olo R-22 (1 mL, 1equiv, 6.4 mmol) e 34 mL di DCM. Successivamente, sono stati aggiunti 3 mL di acroleina dietilacetale 23 (2.6 g ,2.3 eq, 19.5 mmol) e 130 mg di catalizzatore Grubbs di 2° generazione (0.025 eq, 0.15 mmol). La miscela di reazione così ottenuta è lasciata in agitazione a temperatura ambiente ed il suo andamento è stato seguito tramite analisi GLC con prelievi effettuati ogni 2 ore. Dopo 6 ore la reazione è stata fermata, il solvente allontanato a pressione ridotta a temperatura ambiente ed il prodotto grezzo così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice, impiegando come miscela eluente una soluzione di Etere di petrolio/acetato di Etile in proporzione 80/20. Le frazioni cromatografiche contenenti il prodotto vengono riunite e concentrate, fornendo 0,96 g di un liquido color ruggine. Una successiva purificazione tramite distillazione ha permesso di ottenere 0,77 g di un liquido incolore con una resa del 52%. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)d: 0.87–0.90 (m, 3H, CH3), 1.20 (t,6H, 2xCH3), 1.29– 1.53 (m, 6H, 3xCH2),1.55 (m, 2H, CH2), 3.46–3.52 (m, 2H, CH2), 3.63–3.67 (m, 2H, CH2), 4.15 (s, 1H, CH), 4.89–4.91 (m, 1H, CH),5.66–5.71 (m, 1H, CH), 5.84–5.88 (m, 1H, CH).
La caratterizzazione spettroscopica effettuata è in completo accordo con i dati riportati precedentemente in letteratura26:
51 (4S)(E)-1,1-dietossinon-2-en-4-olo (S-5):
In un pallone da 100 mL, a 2 colli dotato di refrigerante ed ancoretta magnetica, sono stati caricati 777 mg di 1-otten-3-olo S-22 (1 mL, 1equiv, 6.07 mmol) e 32 mL di DCM. Successivamente, sono stati aggiunti 2.7 mL di acroleina dietilacetale 23 (3 eq, 17.7 mmol, 2.5 g) e 126 mg di catalizzatore Grubbs di 2° generazione (0,025 eq, 0.15 mmol). La miscela di reazione così ottenuta è lasciata in agitazione a temperatura ambiente ed il suo andamento è stato seguito tramite analisi GLC con prelievi effettuati ogni 2 ore. Dopo 6 ore la reazione è stata fermata, il solvente allontanato a pressione ridotta a temperatura ambiente ed il prodotto grezzo così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice, impiegando come miscela eluente una soluzione di Etere di petrolio/acetato di Etile in proporzione 80/20. Le frazioni cromatografiche contenenti il prodotto sono state riunite e concentrate, fornendo 0,95 g di un liquido color ruggine. Una successiva purificazione tramite distillazione ha permesso di ottenere 753 mg di un liquido incolore con una resa del 54%.
1H-NMR (400 MHz, CDCl
3) d: 0.87–0.90 (m, 3H, CH3), 1.20 (t,6H, 2xCH3), 1.29–1.53 (m, 6H, 3xCH2),1.55 (m, 2H, CH2), 3.46–3.52 (m, 2H, CH2), 3.63–3.67 (m, 2H, CH2), 4.15 (s, 1H, CH), 4.89–4.91 (m, 1H, CH),5.66–5.71 (m, 1H, CH), 5.84–5.88 (m, 1H, CH).
La caratterizzazione spettroscopica effettuata è in completo accordo con i dati riportati precedentemente in letteratura26:
L’eccesso enatiomerico viene calcolato tramite una analisi GLC (Dani GC 1000) con colonna Chiraldex G-TA (20m x 0.25 mm x 0,25 μm) e.e. 95%; R.t: t (R) 16.17min (S):16.39 min.
52
5.2.1. Determinazione dell’attività aldoso reduttasica
L’attività di AKR1B1 è stata determinata a 37°C seguendo il decremento dell’assorbanza a 340 nm dovuto all’ossidazione del cofattore enzimatico NADPH (ε340 = 6.22 mM-1 cm-1). Il volume finale della miscela di saggio è 700 µL e contiene: tampone sodio fosfato 0.25M a pH 6.8, NADPH 0.18 mM, solfato di ammonio 2.4 M, EDTA 0.5 mM. Per la determinazione del titolo dell’enzima si usa D, L- Gliceraldeide 4mM in presenza di opportuna quantità di preparato enzimatico. Per la determinazione dei parametri cinetici relativi ai substrati HNE (racemo, (R) ed (S)) e GS-(R) HNE, i saggi vengono allestiti usando 8mU di enzima a diverse concentrazioni di substrato come riportato nella sezione Risultati e Discussione. La miscela di saggio, senza il substrato, viene posta in incubazione per 5 minuti andando a registrare il decremento dell’assorbanza al minuto (ΔA/min.) dovuto all’ossidazione spontanea del NADPH. Il valore ottenuto sarà registrato come bianco e sottratto successivamente alla misura di ΔA/min. misurata dopo l’aggiunta di substrato.
Prima di effettuare il saggio, l’enzima viene sottoposto a dialisi su membrana YM10 contro tampone sodio fosfato 10 mM pH 7 in modo da rimuovere DTT e glicerolo utilizzati come preservanti durante la conservazione e che potrebbero interferire nella misura. Le condizioni di dialisi determinano una riduzione della concentrazione dei preservanti di circa 2.000 volte.
53
5.2.2. - Induzione di Purificazione dell’Aldoso Reduttasi, a partire da ceppi di E. Coli
ricombinanti
5.2.2.1 - Preparazione del terreno liquido di crescita, e pre-inoculo
Sono stati preparati 550ml di terreno liquido di cultura Luria Broth. La composizione del liquido di crescita è la seguente:
10 gr di triptone;
5 gr di estratto di lievito; 10 gr di NaCl;
Il terreno viene quindi sterilizzato in un contenitore in vetro da 1L in autoclave.
Un’aliquota di cellule di E. Coli trasformate viene scongelata e aggiunta a 9 mL di terreno Luria Broth in presenza di Kanamicina 1/1000.
Le cellule vengono fatte crescere in agitazione a 37 gradi per tutta la notte. Al termine di questa operazione viene ottenuta una concentrazione batterica di 109 cellule per ml.
5.2.2.2 - Inoculo e monitoraggio della crescita batterica
In questa fase viene presa una aliquota di 5ml delle cellule E. Coli dopo la crescita overnight e viene distribuita in 5 beute contenenti 200ml di LB e kanamicina 1/1.000.
Nelle ore successive viene monitorata la curva di crescita misurando l’assorbanza a 600nm.
Le misurazioni sono effettuate al tempo zero e in successione ogni 1,5/2ore, tenendo conto del fatto che E. Coli compie un ciclo di replicazione ogni circa 20 minuti.
Quando l’assorbanza arriva a 0.8, viene aggiunto in ogni beuta IPTG alla concentrazione finale di 0.4mM in modo da indurre l’espressione dell’ALR2 e la sospensione cellulare è incubata per 12 h a 37°C sotto blanda agitazione
54
5.2.3. - Ottenimento dell’estratto grezzo
Terminata l’induzione, le cellule vengono centrifugate a 1.900xg per 30 minuti a 4°C. Al termine della centrifugazione, Il sovra natante viene separato dal pellet che viene quindi delicatamente risospeso in 15mL di tampone sodio fosfato 10mM PH 7 addizionato con EDTA 0,1mM, ditiotreitolo (DTT) 2 mM e 4 µL/ml di PIC (Protease Inibitor Cocktail). Il passaggio seguente prevede la rottura cellulare, indotta mediante un doppio ciclo di congelamento e scongelamento della soluzione seguito da 7 cicli di sonicazione di un minuto ciascuno a. 4°C. La sospensione viene quindi sottoposta a centrifugazione a 12.000xg per 30 minuti a 4°C ed il sopranatante alla centrifugazione costituisce ciò che viene indicato come “estratto grezzo”.
5.2.4. - Purificazione dell’enzima
4.2.4.1 - Allestimento della colonna cromatografica a scambio anionico, DE52
L’estratto grezzo viene caricato su colonna (30x3.5cm) contenente 10 mL di resina DE52 precedentemente equilibrata overnight con tampone sodio fosfato 10 mM pH 7 e DTT 2 mM ad un flusso di 15 mL/h.
L’eluato viene raccolto in frazioni di 4 ml ciascuna (tempo di raccolta per frazione 15 minuti). L’eluizione viene monitorata mediante la misura spettrofotometrica delle frazioni relativa all’assorbimento proteico alla lunghezza d’onda di 280 nm; quando il valore di assorbanza si stabilizza intorno a 0.4, viene applicato un gradiente 0-120 mM di NaCl aggiunto alla fase mobile, in modo da ottenere il graduale rilascio delle molecole che hanno interagito con la resina.
Sulle frazioni in esame viene inoltre valutata l’attività dell’enzima di interesse utilizzando le condizioni standard di saggio (sezione 4.2.1, metodi), in presenza di D, L-GAL 4mM ed un’aliquota della frazione in esame. In questo modo è possibile individuare le frazioni contenenti l’enzima di interesse.
Le frazioni che mostrano attività enzimatica vengono riunite in un “pool” sul quale viene valutata la concentrazione proteica utilizzando il metodo colorimetrico di Bradford (Bradford M.M., 1977) e misurata l’attività enzimatica utilizzando le condizioni standard di saggio.
Prima di procedere con il secondo stadio della purificazione, il pool è sottoposto a dialisi su membrana di ultrafiltrazione YM10 in modo da ridurre significativamente la concentrazione di NaCl e DTT che potrebbero interferire con il legame dell’enzima alla resina di affinità Matrex.
55
Vengono applicati 3 cicli di dialisi in modo da ridurre la concentrazione salina e dell’agente riducente di circa 30 volte.
4.2.4.2 - Allestimento e cromatografia su colonna Matrex Orange A
Il pool dializzato viene caricato su una colonna (23 x 3,5 cm) contenente circa 100 mL di resina matrex Orange A precedentemente equilibrata overnight con tampone sodio fosfato 10 mM pH 7 ad un flusso di 15 mL/h. Vengono raccolte frazioni di 4mL sulle quali viene valutata l’assorbanza a 280nm e l’attività dell’enzima di interesse come descritto in precedenza.
Quando l’assorbanza si è stabilizzata, viene aggiunto NADPH 0,1 mM al tampone di eluizione, in modo da ottenere il rilascio dell’enzima dalla resina. Le frazioni che mostrano attività enzimatica vengono raccolte in un pool sul quale è determinata la concentrazione proteica e l’attività enzimatica.
Prima di effettuare il terzo passaggio cromatografico, il pool Matrex viene concentrato mediante ultrafiltrazione su membrana YM10.
4.2.4.3 - Allestimento e cromatografia su colonna G75
L’ultimo passaggio cromatografico prevede l’utilizzo di una colonna (80 x 2,6 cm) contenente 200 mL di resina Sephadex G75 in grado di effettuare la separazione delle molecole in base alle loro dimensioni con un limite di esclusione di approssimativamente 75.000 u.m.a. Utilizzando la stessa fase mobile presente per il primo passaggio di purificazione (sodio fosfato 10 mM pH 7 e DTT 2 mM), il pool concentrato proveniente dalla Matrex viene caricato su colonna ed eluito ad un flusso di 15 mL/h.
Vengono raccolte frazioni di 4mL sulle quali viene valutata l’assorbanza a 280nm e l’attività dell’enzima di interesse come descritto in precedenza.
Le frazioni contenenti l’enzima di interesse vengono raccolte in un pool, concentrate con membrana YM10 e distribuite in aliquote contenenti glicerolo al 33% e quindi conservate a -80°C.
Una volta determinata la concentrazione proteica e l’attività enzimatica relativa ai campioni di estratto grezzo, pool DE52 concentrato, pool Matrex concentrato e pool G75 concentrato, viene elaborata la tabella di purificazione.
56
5.2.5. - Determinazione della concentrazione proteica
La concentrazione proteica nell’estratto grezzo e nei preparati a diverso grado di purificazione è stata determinata mediante il saggio basato sulla colorazione Blue Comassie R-25 (Bradford, 1976). Il principio si basa sulla interazione aspecifica ma quantitativa tra il colorante e le proteine che formano un complesso con un massimo di assorbimento alla lunghezza d’onda di 595 nm. Il saggio viene eseguito aggiungendo a 800μl di campione proteico opportunamente diluito in acqua, 200μl del colorante “Biorad Protein Assay”. Dopo agitazione della soluzione su vortex e incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente, viene misurata l’assorbanza della soluzione a 595 nm. Al valore ottenuto viene sottratto quello relativo ad un bianco preparato sostituendo il campione proteico con 800μl di acqua. Per determinare la concentrazione proteica si fa riferimento ad una retta di taratura ottenuta utilizzando come proteina standard di riferimento albumina di siero bovino (BSA) disponibile pura in soluzione a titolo noto (0.1 μg/μL). La retta di taratura è riportata in Fig. 44.
Figura 44: Retta di taratura per la determinazione della concentrazione proteica. In figura è riportata l’assorbanza rilevata a 595 nm in funzione della quantità espressa in μg di BSA.
57
5.2.6. - Elettroforesi in condizioni denaturanti SDS-PAGE
Il grado di purezza dei diversi preparati enzimatici è stato valutato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti. Per procedere con l’analisi è stato preparato un gel bifasico: la fase superiore (Stacking gel o gel di impaccamento), con una dimensione dei pori tale da lasciare liberamente permeare tutte le proteine caricate, ed una fase inferiore (Running gel), con una dimensione di pori minore tale da creare attrito sulle molecole da separare dipendentemente dalle loro dimensioni e nella quale le molecole proteiche si separano in base al loro peso molecolare. Compito dello stacking gel è quello di consentire alle diverse componenti proteiche di concentrarsi sulla contigua superficie del running gel in modo da iniziare la migrazione essenzialmente dalla stessa linea di partenza. I gels vengono assemblati al momento dell’uso per copolimerizzazione radicalica di acrilammide e N, N’-metilen bisacrilammide in opportune concentrazioni.
4.2.6.1 - Preparazione dei gel:
Gel di impaccamento (3,7 % acrilammide): - acqua milliQ: 5,000 ml - acrilammide-bisacrilammide 30-0,8%: 1,000 ml - Tris/HCl 0,5 M pH 6,8: 2,000 ml - SDS 10%: 0,080 ml - ammonio persolfato (40 mg/ml): 0,040 ml - TEMED: 0,008 ml
Gel di separazione (12% acrilammide):
- acqua milliQ: 3,300 ml - acrilammide-bisacrilammide 30-0,8%: 4,000 ml - Tris/HCl 1,5 M pH 8,8: 2,500 ml - SDS 10%: 0,100 ml - ammonio persolfato (40 mg/ml): 0,050 ml - TEMED: 0,005 ml
58
In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata; concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore.
4.2.6.2 - Preparazione del campione
Ai preparati proteici, opportunamente diluiti, è stato aggiunto “sample buffer” (in rapporto 1 a 5 con il campione), una miscela composta da:
- acqua milliQ 9,5 ml - glicerolo 50 ml - SDS 10% 23 ml
- Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 12,5 ml - blu di bromofenolo 1% 5 ml
Immediatamente prima della corsa vengono inoltre aggiunti al campione 50μl di β-mercaptoetanolo per ml di soluzione.
La corsa elettroforetica viene condotta a corrente costante 20mA per circa 45 minuti in un tampone di corsa a pH 8.8 (Tris 25mM, Glicina 192mM, SDS 1%). La corsa elettroforetica è interrotta prima che il fronte proteico vada fuori dal bordo inferiore del gel. Al termine della corsa il gel recuperato viene messo in agitazione per 1 ora in una soluzione di metanolo al 50% in acqua, che fissa le bande proteiche. Il gel viene quindi sottoposto a 3 lavaggi con acqua e quindi sottoposto alla procedura di evidenziazione delle bande. Colorazione al Nitrato d’argento29.
Allo scopo, state preparate due soluzioni: la soluzione A (colorazione) e soluzione B (sviluppo). La soluzione A, è stata preparata aggiungendo, goccia a goccia 4ml di nitrato d’argento 1,18 M, ad una soluzione composta da 21ml di NaOH al 0,36% e 1ml di ammoniaca al 30%. La soluzione A è stata poi portata a 100ml con acqua. La soluzione B è stata preparata miscelando 125μL di acido citrico all'1% a 125μL formaldeide 38% e portando a 250ml con acqua.
Il gel è posto nella soluzione A per 15 minuti, e poi nella soluzione B fino allo sviluppo di colore. Lo sviluppo viene bloccato con metanolo al 50% in acqua.
59
5.2.7 - Determinazione del glutatione
La misura del glutatione totale è stata eseguita dopo una preliminare tappa di riduzione per aggiunta di ditiotreitolo (DTT) alla concentrazione finale di 2 mM a temperatura ambiente. La concentrazione di glutatione ossidato è stata quindi valutata per differenza tra la concentrazione di glutatione totale e quella di glutatione ridotto (GSH). Il metodo di dosaggio per via spettrofotometrica è basato sulla conversione del GSH a cisteina per azione della γ- glutammiltranspeptidasi (γ-GT) e della leucil-amminopeptidasi (LAP)30. In ambiente acido la cisteina prodotta reagisce specificamente con la ninidrina con formazione di un addotto esibente un massimo di assorbimento a 560 nm.
GSH + GlyGly CysGly + γ-Glu-Gly-Gly CysGly + H2O Cys + Gly
La miscela standard di dosaggio (in un volume finale di 125 μL conteneva MgCl2 8 mM, MnCl2 0.2 mM, Gly-Gly 40 mM, 50 mU/mL di γ-GT, e 50 mU/mL LAP in Tris–HCl in 32 mM, pH 8.5. Dopo 20 min. di incubazione a 37°C la reazione viene bloccata per aggiunta di 6,25 μL di acido tricloroacetico. La miscela d’incubazione viene quindi centrifugata per 3 min a 12000 x g ed il sovranatante addizionato di un egual volume di una soluzione di ninidrina in acido acetico preparata sciogliendo 250 mg di ninidrina in 10 mL di acido acetico glaciale/HCl 4M (3:2, v/v). La miscela viene quindi tenuta chiusa per 4 minuti in un bagno di acqua bollente. Dopo raffreddamento in ghiaccio la miscela viene diluita in un egual volume di etanolo al 95% e quindi misurata l’assorbanza a 560 nm. La concentrazione di glutatione viene determinata facendo riferimento ad una retta di calibrazione ottenuta usando una soluzione standard di glutatione (Fig. 45)
LAP γ-GT
60
Figura 45: Curva di calibrazione per la determinazione del glutatione.
5.2.8 -Preparazione di GSHNE
IL GSHNE, sia partendo da HNE racemo che da (R)-HNE, è stato preparato incubando l’alchenale 1 mM in presenza di 1,5 mM di glutatione in tampone sodio fosfato 50 mM pH7,4 a 37°C per 1 ora e quindi per 12 ore a 4°C. La reazione viene monitorata sia seguendo il consumo di HNE valutando l’assorbanza a 224 nm (coefficiente di estinzione molare ε224 = 13,75)16sia misurando il glutatione (§5.2.7). Tenendo conto della ossidazione spontanea del GSH il consumo del tiolo è avvenuto in condizioni pressoché stechiometriche con l’HNE, la cui concentrazione residua, per entrambe le soluzioni risultava essere inferiore al 10% di quella iniziale. La miscela così ottenuta è stata conservata a -80°C fino al momento dell’uso.
61
5.2.9 -Approccio alla separazione delle coppie anomeriche di (R,S)-3-glutationil-4-(R)-HNE
In vista della necessità di separare due delle possibili coppie anomeriche derivanti dalla glutationilazione dell’HNE, i componenti della miscela relativa alla sintesi delle due coppie anomeriche (R,S)-GSHNE ottenute a partire dall’(R)-HNE sono stati separati mediante HPLC, utilizzando una colonna Phenomenex Gemin 5 µm NX C18 110 Å (4,6 mm x 250 mm) equilibrata in acetonitrile (AN) al 16% contenente Acido formico 0,1%. L’eluizione nella quale l’acido formico è mantenuto costantemente allo 0,1%, viene realizzata ad un flusso di 2mL/min, secondo il seguente protocollo (Metodo 1): tempo 0-10min: AN 16% ; tempo 10-18min AN 16-75% con un gradiente lineare di 2 min; tempo 18 min AN 100%. L’apparato cromatografico utilizzato è il Beckman Gold system 126/168 e l’eluizione è stata seguita monitorando l’assorbanza a 254 nm.
Un approccio più utile alla risoluzione delle coppie anomeriche dei due diastereoisomeri si è rivelato quello che, nelle stesse condizioni operative appena descritte, prevede il seguente protocollo di eluizione (Metodo 2): tempo 0-4 min, AN 16%; tempo 4-10 min, AN 16-50% con un gradiente lineare di 4 min; tempo 10-16 min, AN 50-75% con un gradiente lineare di 4 min; tempo 16 min, AN 100%.
62