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C Caannddiiddaattoo: Daniele Tognoni : RReellaattoorrii:: Prof. Umberto Mura Prof. Fabio Bellina
Controrelatrice: Dott.ssa Antonella Petri
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1. Sommario:
2. Introduzione: ... 42.1. ALR2 e complicazioni diabetiche ... 6
2.2. Struttura dell’aldoso reduttasi e meccanismo d’azione ... 9
2.3. 4-idrossi-2,3-nonenale come prodotto di perossidazione lipidica ... 12
2.4. 4-idrossi-2,3-nonenale, GS-HNE e “signalling” cellulare ... 14
2.5. Sintesi 4-HNE ... 17
3. Risultati e discussione ... 23
3.1. Strategia sintetica 4-HNE ... 23
3.2. Induzione e purificazione di AKR1B1 ricombinante umano... 28
3.3. Valutazione della stereospecificità di AKR1B1 nei confronti dell’HNE. ... 32
3.4. Misura dei parametri cinetici sul GS-HNE ... 39
3.5. Approccio alla separazione della coppia enantiomerica ... 41
4. Conclusioni: ... 44
5. Materiali e Metodi ... 46
5.1. Materiali: ... 46
5.2. Parte sperimentale: ... 47
Appendice 1: Inibitori di AKR1B1 ... 62
4 Legenda:
AKR1B1: Aldoso reduttasi ricombinante umano HNE: 4-idrossi-2,3-nonenale
GS: Glutatione
GSHNE: 3-glutationil-4-idrossi-2,3-nonenale GSDHN: 3-glutationil-1,4-diidrossinonano CAL-B: Lipasi da Candida anctartica IPTG: Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside DDT: ditiotreitolo
γ-GT: γ-glutammiltranspeptidasi LAP: leucil-amminopeptidasi
5
2. - Introduzione:
Il diabete è una delle patologie a più elevato impatto socio sanitario nel mondo e su di essa si concentra la ricerca per la comprensione dei meccanismi della sua eziologia e per quelli di danno cellulare ad essa correlati. Le complicanze croniche del diabete sintetizzabili in nefropatie, neuropatie periferiche, cardiopatie e cataratta, trovano concausa, a diversi livelli, nell’azione catalitica di un enzima: l’aldoso reduttasi (AKR1B1); ed è sullo studio di caratterizzazione di tale enzima che si sviluppa il presente lavoro di tesi. L’AKR1B1 è il primo enzima della cosiddetta “via dei polioli”; via metabolica nella quale il glucosio viene trasformato in fruttosio. L’enizma è anche coinvolto nel controllo tramite riduzione, della tossicità di aldeidi prodotte dalla degradazione degli acidi grassi, in condizioni di stress ossidativo. Tra queste aldeidi la più importante è il 4-idrossi-2,3-nonenale (HNE). La capacità di AKR1B1 di ridurre l’HNE ed il suo glutationil-derivato il GSHNE, conferisce all’enzima un ruolo chiave nel controllo dei livelli di queste importanti molecole la cui controversa azione sul metabolismo cellulare è ancora oggi sotto attiva indagine. Se è infatti vero che elevati livelli di HNE rappresentano fonte di danno cellulare è anche vero che a bassi livelli, questa molecola è in grado di esercitare una importante azione di “signalling” cellulare. Il GSHNE peraltro, il principale prodotto del catabolismo dell’HNE, genera, a seguito di riduzione AKR1B1-dipendente, un segnalatore pro-infiammatorio, il 3-glutationil-1,4 diidrossi nonano(GSDHN), di particolare efficacia. L’equivalenza tra il 4R-HNE e il 4S-HNE e tra i 4 diastereoisomeri del GS-HNE (fig.1) quali substrati dell’enzima non è al momento chiara, così come non è chiaro se l’azione di “signalling” cellulare di queste molecole sia un processo stereospecifico. Il presente lavoro di tesi s’innesta in questa problematica con l’obiettivo di valutare e caratterizzare la stereo specificità di AKR1B1 nei confronti di queste molecole. Da qui la necessità di disporre dei due enantiomeri dell’HNE e delle quattro coppie anomeriche derivanti dalla glutationilazione dei due enantiomeri di HNE, in quantità utile a garantire lo studio di caratterizzazione enzimologica.
6
2.1.
-
ALR2 e complicazioni diabetiche
In condizioni normoglicemiche il destino catabolico del glucosio vede questa molecola indirizzata quasi esclusivamente nella via glicolitica attraverso una sua iniziale fosforilazione catalizzata dall’enzima esochinasi. In condizioni di iperglicemia, tuttavia, il glucosio, insieme alla glicolisi, trova un’altra via di trasformazione attraverso la cosiddetta “via dei polioli” che, come mostrato in Fig.2 determina, attraverso una doppia tappa ossidoriduttiva, la trasformazione di glucosio in fruttosio. In particolare dopo la prima tappa di riduzione NADPH-dipendente catalizzata da AKR1B1, il sorbitolo prodotto viene nuovamente ossidato a fruttosio attraverso l’azione dell’enzima sorbitolo deidrogenasi NAD+ dipendente. Mentre in condizioni normoglicemiche soltanto il 3% del glucosio totale viene convertito in sorbitolo attraverso l’azione dell’AKR1B1, il primo enzima della via, in condizioni iperglicemiche il flusso di glucosio attraverso la via dei polioli può arrivare fino al 30% del glucosio presente nei distretti cellulari.
Figura 2 : Destino del glucosio in relazione ai livelli di glicemia : glicolisi (condizioni normoglicemiche); glicolisi + via dei Polioli (condizioni
iperglicemiche).
Non possedendo meccanismi di trasporto trans membrana, il sorbitolo, generato per azione dell’AKR1B1, agisce da osmolita, ed in caso di accumulo, è in grado di generare uno squilibrio iperosmotico che determina rigonfiamento e quindi danno cellulare. Lo stress osmotico non è
7
l’unico fattore di danno associato alla via dei polioli chiamato in causa nel determinare le complicanze del diabete (nefropatie, retinopatie, neuropatie periferiche e cataratta oculare1). Infatti, come si può evincere dalla Fig.3, ad un aumento del flusso della via dei polioli sono associate almeno altre due situazioni di potenziale danno cellulare. La prima attiene ad una riduzione della capacità antiossidante causata dall’alterazione dei rapporti delle coppie redox NADP+/NAPH, che aumenta, e NAD+/NADH che diminuisce; una situazione che compromette, peraltro, il regolare recupero in forma ridotta di un importante agente antiossidante quale il glutatione. La seconda attiene all’incremento dei livelli di fruttosio, un agente glicanteI più efficace del glucosio, che favorisce i processi di glicazione delle proteine cui è spesso associata una perdita di funzionalità delle stesse. Le proteine glicate, peraltro, sono considerate elementi estranei da parte della cellula che instaura un meccanismo difensivo anti infiammatorio generalizzato. L’inequivocabile coinvolgimento dell’aldoso reduttasi nell’instaurarsi dei suddetti fenomeni concorrenti allo sviluppo delle complicanze del diabete, ha stimolato la ricerca di inibitori specifici dell’enzima (ARIs) in grado di bloccarne l’attività (vedi appendice 1). Al riguardo sono stati individuati inibitori altamente specifici e potenti il cui sviluppo come farmaci non hanno tuttavia dato risultati soddisfacenti dal punto di vista terapeutico a causa di effetti secondari anche gravi. Una possibile concausa di ciò è da ricercarsi nella peculiare capacità di AKR1B1 di agire con efficienza paragonabile sia su molecole altamente idrofiliche, quali gli aldosi, che su aldeidi idrofobiche, citotossiche che si generano da processi di perossidazione lipidica. Se quindi l’inibizione dell’enzima agente sul glucosio dovrebbe portare ad un beneficio per il sistema cellulare, la compromissione della sua azione su molecole citotossiche potrebbe risultare causa di danno. Da ciò la recente proposta emersa dall’Unità di Biochimica del Dipartimento di Biologia dove è stata svolta parte del presente lavoro di tesi di ricercare molecole con azione inibitoria differenziale (Aldose Reductase Differential Inhbitors, ARDIs), in grado cioè, di inibire l’enzima dipendentemente dalla natura del substrato che viene trasformato2. In particolare l’azione inibitoria di tali molecole dovrebbe manifestarsi sulla reazione di riduzione del glucosio o altre molecole potenzialmente dannose come il GSHNE mentre dovrebbero risultare inefficaci o almeno limitare la loro azione inibente nei confronti dell’HNE e di altre aldeidi citotossiche. Inoltre gli ARDIs potrebbero aprire allo sviluppo di nuovi piani terapeutici per prevenire e comunque contrastare l’insorgenza delle complicanze del diabete.
I Per glicazione s’intende il processo attraverso il quale si realizza l’introduzione non catalizzata da enzimi di uno
8
9
2.2. - Struttura dell’aldoso reduttasi e meccanismo d’azione
L’AKR1B1, (EC 1.1.1.21) è un enzima NADPH dipendente appartenente alla famiglia delle aldo-cheto reduttasi, enzimi in grado di ridurre un’ampia varietà di aldeidi, sia idrofiliche sia idrofobiche1. Come già sottolineato, questo enzima gioca un ruolo chiave nella via dei polioli, manifestandosi, in condizioni di iperattività con elementi di danno cellulare.
L’enzima umano è costituito da una singola catena peptidica di 316 residui3 che studi di diffrazione ai raggi X, eseguiti sull’enzima complessato con vari inibitori4,5, hanno evidenziato organizzata in una struttura definita a “barile α/β ”, costituita da otto foglietti ß paralleli connessi da altrettanti segmenti ad α-elica, con un foglietto ß nella porzione ammino-terminale e con il sito attivo per il substrato situato nella regione carbossi terminale. Il sito per il cofattore protrude in una tasca idrofobica della molecola proteica6. Il cofattore è correttamente posizionato e mantenuto sul sito da un imponente riarrangiamento strutturale, indotto dalla sua stessa presenza, che vede coinvolto un loop tra il settimo foglietto ß e la rispettiva α-elica, definito come “safety belt”7. Studi di mutazione sito-specifica II hanno permesso di evidenziare che in assenza di cofattore il "safety belt" assume una conformazione, definita "aperta", significativamente diversa da quella, “chiusa”, osservata in presenza del cofattore. Ciò ha portato a ritenere che il processo d’interazione e rilascio del NADP/H sia condizionato dal cambiamento conformazionale dei residui che compongono la safety belt (evidenziata in Fig. 4.)
II La mutazione sito specifica è una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è creata in modo selettivo in un
particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide. Questo tipo di tecnica richiede la conoscenza della sequenza wild type del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà essere una sostituzione di base o una inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria.
10
Figura 4: Struttura dell’aldoso reduttasi umana; il loop della “safety belt” è evidenziato8
Il processo di riduzione catalizzato dall’AKR1B1 (schematizzato in Fig.5 e Fig.6) è stato descritto come un meccanismo Bi: Bi sequenziale ordinato nel quale il legame del NAPDH, con la “chiusura” della safety belt, precede il legame del substrato aldeidico (Pannello 5A)1. Il meccanismo di riduzione consiste in un trasferimento stereospecifico dell’idruro pro-R in posizione 4 del NADPH sulla faccia re del carbonio carbonilico dell’aldeide e dalla successiva protonazione da parte della Tyr48, assistita dalla Lys77 e dall’Asp 45 (Pannello 5B). Dopo la riduzione l’alcol è il primo prodotto a lasciare l’enzima (Pannello 6A) seguito dal NADP+ previa “apertura della safety belt (Pannello 6B).
11
Figura 5: A: Stadio iniziale della riduzione di un’aldeide ad opera dell’aldoso reduttasi; quando il substrato giunge nella tasca dell’enzima il NADPH è già legato al sito; B: Interazione tra l’aldeide, il NADPH il residuo Tyr 48 e Lys 77.
Figura 6: A: Interazione tra l’aldeide, il NADPH il residuo Tyr 48 e Lys 77; B: Apertura della Safety belt e rilascio del cofattore ossidato.
12
2.3.
- 4-idrossi-2,3-nonenale come prodotto di perossidazione lipidica
Dopo aver evidenziato la capacità di AKR1B1 di agire su aldeidi citotossiche, prendiamo in considerazione il contesto nel quale l’HNE, uno dei più importanti prodotti della perossidazione lipidica, viene a generarsi nella cellula. La condizione scatenante l’aumento dei livelli di HNE è quella definita come “stress ossidativo”. Una tale condizione insorge nel momento in cui ad un alterarsi dello stato redox cellulare consegue la produzione di specie reattive dell’ossigeno (il radicale superossido, il radicale idroperossido e il perossido di idrogeno) non sufficientemente bilanciata dai preposti meccanismi di difesa cellulari che si svolgono sia per azione enzimatica diretta (catalasi, superossido dismutasi) sia attraverso il controllo enzimatico di specie antiossidanti (livelli di glutatione ed enzimi coinvolti nel suo turnover redox). L’alterazione del normale stato redox conseguente l’accumulo di ROS può risultare devastante per la cellula dal momento che molecole di rilievo come proteine, lipidi ed acidi nucleici, DNA incluso, possono venire modificate, subendo danni tali anche da amplificare la condizione di stress che le ha modificate. Quando una cellula si trova sotto condizioni di stress ossidativo i lipidi e più precisamente gli acidi grassi poli insaturi (PUFAs) presenti nelle membrane cellulari vengono per primi attaccati dai ROS generando intermedi tossici, principalmente aldeidi a 3, 4, 6 e 9 atomi di carbonio, le più rilevanti delle quali, come la malonaldeide, l’esanale e l’acroleina sono riportate nell’ordine insieme all’HNE in Fig. 7A-D.
Figura 7: Principali aldeidi derivanti dalla perossidazione lipidica delle membrane cellulari. HNE (A), malondialdeide (B), esanale (C) e acroleina (D).
Tra le aldeidi generate dalla perossidazione lipidica le aldeidi α,β insature sono le più reattive nei confronti dei bersagli molecolari cellulari. Infatti, questa classe di molecole presenta due centri reattivi: un carbonio carbonilico elettrofilico che può generare facilmente basi di Shiff e un carbonio elettrofilico in γ che può essere coinvolto in addizioni di Michael con vari bersagli, incluso il glutatione9,10. La sintesi dell’HNE, l’aldeide α,β insatura più abbondante, prende avvio dalla perossidazione degli acidi grassi ω-6 (linoleico e arachidonico) e si realizza attraverso il meccanismo proposto da Schneider et al. 11 (Fig.8).
13
Lo stress ossidativo e la conseguente perossidazione lipidica sono coinvolti in un’ampia serie di stati patologici tra cui, arteriosclerosi, malattie neurodegenerative e cancro, nonché in svariate risposte di tipo infiammatorio. A parte la conclamata azione di danno cellulare, prodotti di degradazione della perossidazione lipidica vengono utilizzati come messaggeri secondari dello stress ossidativo, intervenendo quindi in svariati processi del ciclo cellulare, sia per la loro emivita significativamente più lunga di quella dei radicali che hanno indotto la loro formazione, che per la loro capacità di spostamento nei diversi distretti cellulari. Il fatto che l’AKR1B1 sia in grado di catalizzare molto efficacemente la riduzione di una varietà di tali composti aldeidici fa sì che l’enzima sia coinvolto in diverse azioni di signalling e controllo del ciclo cellulare.
14
2.4. - 4-idrossi-2,3-nonenale, GS-HNE e “signalling” cellulare.
L’HNE è un agente diffusibile, presente fisiologicamente nel citosol in quantità molto modesta (0,2-0,8 µM) è in grado di regolare l’espressione di molti geni, la proliferazione e la differenziazione in varie linee cellulari 12,13. In particolare, l’HNE svolge un ruolo proapoptoticoIII in diversi contesti cellulari con due principali meccanismi. Il primo prevede l’induzione della traslocazione della proteina Daxx (Death-associated protein 6) dal nucleo cellulare al citoplasma, permettendo la sua interazione con un dominio citoplasmatico del “death receptor Fas” (CD95), il quale, in presenza di FasL (Fas receptor ligand) dimerizza ed interagisce con la proteina adattatrice FADD (Fas-associated deathdomain). Questo aggregato proteico induce la formazione del complesso DISC (death-inducing signaling complex) che sequestra e attiva la procaspasi 8, la quale a sua volta attiva le caspasi effettrici dell’apoptosi12. Il Secondo meccanismo attraverso il quale l’HNE promuove apoptosi prevede l’induzione, la fosforilazione e la traslocazione della proteina p53, espressa in presenza di danno al DNA, in condizioni di ipossia e di stress ossidativo e responsabile dell’induzione di geni pro-apoptotici quali p21, Bax, JNK e CASP312.
Come già accennato in precedenza, l’HNE è un substrato ad alta affinità per l’aldoso reduttasi; i valori di KM per l’enzima umano sono infatti paragonabili a quelli della gliceraldeide (circa 50 μM), substrato di elezione dell’enzima in studi cinetici.
La principale via di eliminazione dell’HNE è la sua trasformazione in 3-glutationil-4-idrossi nonano (GS-HNE), un addotto di Michael la cui formazione, per quanto possa avvenire direttamente tra glutatione (GSH, γ-L-glutammil-L-cisteinilglicina) ed HNE, è catalizzata in modo efficiente nella cellula dall’enzima glutatione-S-transferasi (Fig. 9)
Figura 9: addotto glutatione HNE.
Mentre attraverso la ossidazione NADP+-dipendente della forma emiacetalica del GS-HNE al corrispondente lattone catalizzata dalla carbonil reduttasi (CBR1)14,15 la molecola viene estrusa dalla cellula, l’aldeide in forma libera è suscettibile di riduzione NADPH dipendente operata da AKR1B1 (Fig.10.)
15
Figura 10: vie di trasformazione del GS-HNE
Il prodotto di riduzione di tale reazione, il 3-glutationil 1,4 diidrossi nonano (GS-DHN) è in grado di esercitare una potente azione di signalling cellulare volta ad attivare la cascata dei fattori NF-κB e AP-1 che provocano la trascrizione di geni codificanti per citochine, chemochine, fattore di crescita INOS e Cox-2, responsabili attraverso un complesso network di interazioni, dell’insorgenza della maggior parte delle patologie infiammatorie legate al diabete13. La rappresentazione schematica del processo di attivazione della risposta infiammatoria è riportata in Fig. 11. Lo schema mette in evidenza la componente di signalling cellulare associata all’azione di AKR1B1 ed in particolare l’attivazione di NF-κB indotta dall’attivazione da parte del GS-DHN della fosfolipasi C con aumento dei livelli di diacilglicerolo cui consegue l’attivazione della proteinachinasi C. Nello schema è messo inoltre in evidenza come l’attivazione di NF-κB induca sia la sintesi delle citochine pro infiammatorie, che un incremento della sintesi della stessa AKR1B1 attraverso il fattore di trascrizione ORE (Osmotic Response Factor). Tutto ciò a rappresentare il profondo coinvolgimento di AKR1B1 in una funzione catalitica che soverchia, di fatto, senza sminuirne l’importanza, quella prettamente metabolica che attiene al catabolismo del glucosio.
16
17
2.5. - Sintesi 4-HNE
Dal momento che parte rilevante di questo lavoro di tesi attiene alla sintesi e risoluzione dell’HNE, ho ritenuto opportuno riportare un quadro degli approcci sperimentali che sono stati proposti e perseguiti per sintetizzare tale molecola. Di particolare importanza sono quelle reazioni in cui i due enantiomeri vengono separati mediante risoluzione della miscela racemica. La prima sintesi16 di tale miscela racemica fu proposta da Esterbauer e Weger nel 1967. Questa sintesi consiste nel preparare un reattivo di Grignard operando uno scambio metallo idrogeno tra il 3,3-dietossipropino (1) e l’etilmagnesio bromuro (2). L’alchinilmagnesio bromuro così ottenuto viene fatto reagire con l’esanale (3) (fig.12), ottenendo dopo idrolisi il 4-idrossi-2,3-noninaledietilacetale (4), che viene successivamente ridotto con LiAlH4 al corrispondente idrossialchenale (5). L’idrolisi finale dell’acetale porta quindi al 4-HNE racemo (6).
Figura 12: sintesi proposta da Esterbauer.
Un’altra strategia sintetica17per l’ottenimento della miscela racemica (fig.13) fu messa a punto nel 1986 da Gree et. Al. In questo studio vengono esplorate le potenzialità del building block (E)-4,4-dimetossi-2-butenale 10 come precursore di varie molecole polifunzionalizzate (polieni, olefine polifunzionalizzate e prodotti di Diels Alder), tra cui la molecola di nostro interesse. La sintesi per ottenere l’HNE prevede di far reagire il pentilmagnesiobromuro (11) con (10), ottenendo dopo idrolisi il prodotto finale 6.
18
Chandra e Srivastava18 nel 1997 ripresero la procedura di Gree per compiere uno studio sull’ossidazione del carbonio 4 sintetizzando la molecola con un idrogeno marcato isotopicamente. Nel 2006, R.F. Kurangi propose un meccanismo19 per la preparazione dell’HNE e del 4-osso-2,3-nonenale (ONE) attraverso le reazioni di Wittig e di Horner-Wardsworth-Emmons (HWE) Fig.14. La reazione consiste nel condensare il gliossale dimetil acetale con i reagenti 14a e 14b preparati secondo gli schemi di Fig.15 e Fig.16 Il vantaggio di questa procedura rispetto alle precedenti risiede nel fatto che non vengono utilizzati reattivi di Grignard.
Figura 14: per ottenere 15 la gliossale dimetil acetale può essere fatta reagire con 14a in metanolo a riflusso per 3h fornendo una resa del 59,03% oppure può essere fatta reagire con 14b in presenza di NaOH e (Bu)4I in CH2Cl2.
Figura 15: il reagente di Wittig 12a viene acilato con cloruro di esanoile per dare il reagente di Wittig 13a. Questo dopo essere stato sottoposto a idrolisi decarbossilativa fornisce il reagente 14a.
Figura 16: 12b viene acilato in presenza di MgCl2 , trietilammina e cloruro di esanoile in toluene. Il prodotto ottenuto 13b viene decarbossilato in presenza di acido paratoluensolfonico per ottenere il prodotto 14b.
De Monarby et. al nel 1988 proposero 20una delle prime risoluzioni utilizzando un complesso puro di ferro tricarbonile con acido sorbico (-)(16)(Fig.17). La risoluzione fu seguita da cromatografia e deacetalizzazione (fig. 18.)
19
Figura 17: complesso di ferro tricarbonile con acido sorbico
Figura 18: Sintesi proposta da De Montarby nel 1988.
Una strategia più pratica, basata sulla risoluzione enzimatica, è stata proposta21 da Allevi nel 1993. Si tratta di una risoluzione enzimatica. (Fig.19) In questo studio sono state impiegate lipasi da
Pseudomonas fluorescens, in un solvente organico. L’eccesso enantiomerico ottenuto con questo
20
Figura 19: Sintesi proposta da allevi nel 1993
G.Birngmann nel 1994 riprese la procedura di Esterbauer proponendo22 una sintesi enantioselettiva a partire dal 3,3-dimetossipropino (17). Il composto (18) venne ottenuto per litiazione, transmetallazione e addizione di cloruro di esanoile. La riduzione enantioselettiva del chetone venne effettuata utilizzando BINAL-H (19) (fig 20). L’ultimo stadio della sequenza sintetica previde, infine, una riduzione di 20 con LiAlH4 per ottenere l’alchene 21, ovvero l’HNE protetta come dimetil acetale (Fig 21).
21
Figura 21: Sintesi proposta da G.Bringmann
Nel 2007 Laurent Soul`ere23, visti i recenti sviluppi nell’utilizzo della reazione di cross-metatesi (vedi appendice 2) e della metatesi a chiusura d’anello per la sintesi di composti naturali, proposero un meccanismo per la sintesi dell’HNE e dei relativi idrossialchenali attraverso questo tipo di reazione utilizzando un catalizzatore Hoyveda-Grubbs di prima generazione, rappresentato in Fig.22.
Figura 22: catalizzatore Hoyveda-Grubbs di prima generazione.
Nello studio vennero sintetizzati: esenale, nonenale, la 4-idrossi-2,3-dodecenale unitamente ai relativi dimetil acetali (fig.23). Le rese per queste reazioni vanno dal 50% per il dodecenale acetale all’85% per la 4-idrossi-2,3-esenale.
22
Di rilevante interesse è la conferma della formazione quantitativa dell’isomero E, studio precedentemente avviato da Cossy24, la quale, in uno studio del 2001, ha fatto reagire aldeidi, esteri e allilsilani α-β insaturi con alcol insaturi in presenza del catalizzatore di fig.22. Questo lavoro mostra come ci sia una pressoché totale selettività di tipo E quando uno dei due partner olefinici presenta gruppi elettron attrattori come nel caso dell’acroleina. Nel 2009 Komisarski mise a punto25 una sintesi (fig.24) che prevede quale stadio chiave una reazione di metatesi catalizzata dal catalizzatore di Grubbs di seconda generazione fig.25 tra l’1-otten-3-olo (22) e l’acroleina (23), ottenendo in maniera efficiente una miscela racemica di HNE. Il punto di forza dello studio consiste nella separazione dei due enantiomeri. Venne proposta una risoluzione enzimatica ad opera di lipasi da Candida anctartica in presenza di propanoato di vinile. La risoluzione viene operata al livello dell’ottenolo racemo per ottenere (R-22) e l’S-ottenolo propanoato (24). R-22 viene sottoposto a metatesi olefinica con 23, il prodotto finale R-6 presenta un ottimo eccesso enantiomerico (>97,5%). Il propanoato 24 viene idrolizzato a pH tamponato 7.2 in presenza di lipasi da Candida
anctartica e successivamente fatto reagire con l’acroleina 23.
23
Figura 25: catalizzatore di Grubbs di seconda generazione
3. - Risultati e discussione
3.1. - Strategia sintetica per l’ottenimento di 4-HNE
Per ottenere la miscela racemica dell’(E)-4-idrossi-2,3-nonenale (±5) è stata utilizzata la procedura che sfrutta la reazione di metatesi olefinica proposta da Komiarski e collaboratori, descritta nel paragrafo 2.5. Rispetto alla procedura originale è stato preferito, per i motivi di seguito elencati, sintetizzare la molecola protetta sotto forma di dietilacetale. L’analisi retrosintetica è proposta in fig 26.
.
Figura 26: Analisi retro sintetica relativa al ± (E)-1,1-dietossinon-2-en-4-olo
La reazione è promossa dal catalizzatore di Grubbs di seconda generazione (descritto in appendice 2), mentre i reagenti di partenza sono l’acroleina dietilacetale (25) e il ± 1-otten-3-olo (22). Lo schema di reazione è riportato in fig 27.
24
Figura 27: Sintesi composto 5
La scelta di usare l’acroleina dietilacetale come sostituto dell’acroleina è stata motivata dalla conoscenza delle proprietà che manifesta il prodotto finale, che, sotto forma di aldeide libera, come già citato nel paragrafo 2.3 ha molti siti reattivi, (alcolico secondario, carbonio aldeidico e doppio legame coniugato). Si presenta quindi come una molecola estremamente reattiva e poco stabile. La presenza del gruppo acetale ne migliora notevolmente la stabilità, rendendola meno reattiva ed evitando quindi tutta una serie di reazioni indesiderate. La scelta di utilizzare questa procedura rispetto alle altre descritte nel paragrafo 2.5 risiede nel limitato numero di stadi di reazione, oltre ad un più comodo utilizzo di condizioni non strettamente anidre. La procedura eseguita ha fornito una resa di circa il 68%, comparabile con quella riportata nell’articolo di riferimento (70%). per l’elevata purezza richiesta nei saggi enzimatici, si è ritenuto opportuno purificare ulteriormente il prodotto mediante distillazione con un distillatore di tipo kughelrol. La distillazione è stata condotta ad una pressione di 0.4 mBar raggiungendo una temperatura massima di 160°C, con il prodotto che inizia a distillare a 120° C. Il prodotto derivato dalla distillazione si presenta incolore e la resa è del 53%. Nell’articolo è proposta anche la sintesi dei due enantiomeri dell’HNE.
25
Figura 28: Retrosintesi S-5 e R-5
Il primo passaggio prevede una risoluzione enzimatica al livello del ±1-otten-3-olo. Questo tipo di risoluzione, è ad opera di Lipasi da Candida anctartica (CAL-B) supportate su matrici polimeriche. La risoluzione enzimatica, ha fornito come prodotti R-22, e 24, ovvero l’alcol di configurazione R con una resa dell’86% (eccesso enantiomerico = 99%) e il propanoato dell’alcol di configurazione S con una resa del 90% (eccesso enantiomerico= 98%). In fig 29 è mostrato il passaggio di sintesi relativo alla risoluzione enzimatica.
Figura 29: Risoluzione enzimatica
Il propanoato ottenuto dalla risoluzione enzimatica, è stato quindi saponificato trattandolo con una soluzione 3M di carbonato di potassio acquoso, per 3h fornendo l’alcool S-22 una resa dell’89% (Fig 30). L’eccesso enantiomerico (97%) è stato calcolato mediante analisi con GC Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm).
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Figura 30: Idrolisi di 24
Gli eccessi enantiomerici sono stati calcolati mediante analisi con GC Elmer Autosystem e colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm).
(R)-22, dopo essere stato separato da 24 mediante cromatografia, è stato fatto reagire (fig.31) nelle condizioni già descritte precedentemente per la miscela racemica, con l’acroleina dietilacetale. In questo caso si ottiene una resa del 65%. Come descritto precedentemente, anche in questo caso a seguito della formazione di un liquido color ruggine si è ritenuto opportuno operare una distillazione. La resa dopo distillazione si attesta al 53%.
Figura 31:Sintesi R-5
(S)-22 derivante da idrolisi viene sottoposto alle stesse condizioni di reazione dell’(R)-22, il prodotto (S)-5 è ottenuto(fig.32) con una resa finale dopo distillazione del 52%.
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Figura 32: Sintesi S-5
Per la determinazione dell’eccesso enantiomerico di S-5 e R-5 è stata inizialmente seguita la procedura proposta in letteratura 25 per la separazione tramite HPLC del prodotto sotto forma di aldeide libera. Data l’indisponibilità della colonna chirale proposta dall’articolo, è stata utilizzata una colonna Chiralcel-OD che però non ha fornito alcun tipo di separazione. Successivamente è stata tentata una separazione enantiomerica via GC con colonna chirale Chiraldex G-TA (20m x 0.25 mm x 0,25 μm) che ha permesso una parziale separazione dei due enantiomeri R-5 ed S-5 con tempi di ritenzione rispettivamente di 16.17min 16.39 min. Ciò ha consentito di valutare un eccesso enantiomerico per S-5 del 95%. Più problematica è stata la valutazione, con lo stesso approccio dell’eccesso enantiomerico di R-5, il primo componente eluente. Infatti per un fenomeno di scollatura, i due componenti del campione R-5 non vengono adeguatamente risolti.
Per valutare l’arricchimento enantiomerico di R-5 sono state fatte misure di potere ottico rotatorio in CHCl3 ad una concentrazione di 0.12 g/mL. I valori ottenuti sono: per quanto riguarda S-5 e per quanto riguarda R-5. Non esistono dati in letteratura per la determinazione dell’eccesso enantiomerico tramite il calcolo del potere ottico rotatorio, tuttavia considerato che i valori sono pressochè uguali in valore assoluto è possibile considerare R-5 paragonabile a S-5 e quindi anche’esso arricchito al 95%.
28
3.2. - Induzione e purificazione di AKR1B1 ricombinante umano.
La necessità di apprezzabili quantità di enzima ad elevato grado di purezza è stata soddisfatta con una già collaudata induzione della sintesi di AKR1B1 umana in cellule di E. Coli e con la messa in atto di una procedura di purificazione dell’enzima altrettanto collaudata per l’isolamento dell’enzima da cristallino di vitello. In particolare sono state usate cellule di E. Coli nelle quali è stato inserito il plasmide pET AKR1B1 contenente la sequenza di cDNA relativa all’AKR1B1, ottenuta dalla estrazione dell’ mRNA da placenta umana, ed una sequenza di basi in grado di conferire alla cellula ospite resistenza alla kanamicina. Il gene di AKR1B1 inserito nel DNA di E.coli è messo sotto il controllo del promotore dell’operone-lac, per cui l’inserimento di Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) nel terreno di crescita dei batteri sarà il segnale per le cellule di iniziare a sintetizzare AKR1B1. Le cellule così trasformate, conservate a -80°C fino al momento dell’uso vengono preinoculate in un opportuno terreno di coltura e lasciate crescere overnight alla temperatura di 37°C. Il mezzo così ottenuto viene utilizzato come inoculo per la crescita preparativa che si realizza, al fine di evitare contaminazioni batteriche, in un terreno contenente Kanamicina in un volume di 1 L suddiviso in 5 beute contenenti 200 ml ciascuna. Sempre mantenendo la temperatura a 37°C e sotto blanda agitazione, la crescita viene monitorata tramite misura della turbidità valutando l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 600 nm. A un valore di assorbanza di 0.8 (a circa 12 ore dall’inoculo) viene aggiunto IPTG, che attiva l’espressione di AKR1B1. In queste condizioni che si protraggono per 12 ore sempre a 37°C e sotto blanda agitazione, l’estensiva attività di sintesi di AKR1B1 da parte di E. coli determina un significativo calo della crescita cellulare. Al termine di questa fase le cellule vengono recuperate mediante centrifugazione.
La fase di estrazione dell’enzima prende avvio con la risospensione delle cellule in 35 ml di tampone sodio fosfato 10 mM pH 7 contenente 0,1 mM EDTA, 2 mM ditiotreitolo (DTT) ed un cocktail di inibitori di proteasi (PIC) indispensabili per proteggere l’enzima in fase di estrazione. Quest’ultima avviene per sonicazione delle cellule mantenute in bagno di ghiaccio. Il sopranatante alla centrifugazione della sospensione a 4°C a 10.000 x g per 30 minuti viene definito come estratto grezzo. Da tale estratto, una miscela altamente variegata di molecole: lipidi, fosfolipidi, proteine strutturali, enzimi, acidi nucleici ecc., caratterizzato da un contenuto proteico di 21,17 mg/ml ed una attività aldoso reduttasica di 9,67 U/ml, si procede con la purificazione dell’enzima. La purificazione di AKR1B1 prevede l’utilizzo di tre diverse tecniche di cromatografia in colonna: uno scambio ionico, una cromatografia per affinità ed una gel filtrazione. La scelta dei supporti cromatografici è tale da favorire la progressiva separazione dei diversi componenti l’estratto utilizzando condizioni tali da minimizzare fenomeni di inattivazione dell’enzima. La prima tappa
29
prevede l’utilizzo di una resina a scambio anionico debole come la dietilamminoetil cellulosa (DE52) che consente una efficace separazione di materiale dal momento che l’enzima di interesse interagisce con efficacia sulla fase fissa. L’eluizione in questo caso viene realizzata solo dopo applicazione di un gradiente di forza ionica che risulta efficace per il rilascio dell’enzima intorno ai 70-100 mM di NaCl (Fig. 33 A). Le frazioni attive, riunite e dializzate, vengono quindi applicate ad una resina Matrex Orange A caratterizzata dalla presenza di gruppi ancorati alla matrice che mimano la struttura del cofattore enzimatico. L’interazione che si realizza tra tale supporto cromatografico e l’enzima risulta essere particolarmente efficace e specifico: l’AKR1B1 viene infatti recuperato dalla colonna solo dopo aggiunta nel tampone di eluizione di NADPH 0,1 mM (Fig.33 B). Il profilo di eluizione del terzo passaggio cromatografico di setaccio molecolare su Sephadex G75, riportato in Fig. 33C, mostra un unico picco esibente una sostanziale coincidente progressione tra contenuto proteico e attività enzimatica una chiara indicazione del buon esito della procedura di purificazione adottata.
Figura 33 Profili di eluizione relativi ai tre diversi passaggi cromatografici di purificazione di AKR1B1 ricombinante umano. Pannello A: cromatografia su DE52 (A), Matrex (B), Sepadhex G75 (C). In blu è rappresentato il profilo di eluizione relativo all’assorbanza proteica (280 nm), in arancio è in) rappresentato il profilo di eluizione relativo all’attività enzimatica (ΔA/min)
30
Per valutare il grado di purezza del preparato enzimatico, viene effettuata una elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS PAGE) al 12% preparato al momento dell’uso, Il principio su cui si basa questa tecnica elettroforetica è legata all'attività denaturante dell'SDS che, essendo in grado di interagire con le proteine in un rapporto costante (1,4 g di SDS ogni grammo di proteina) conferirà ad esse un rapporto massa/carica costante con la conseguenza che la loro mobilità nella corsa elettroforetica dipenderà solo dalle loro dimensioni. I risultati dell’analisi condotta sui campioni proteici prelevati ai diversi stadi di purificazione sono mostrati in Fig. 34.
Figura 34: Elettroferogramma dei campioni proteici relativi alle diverse tappe di purificazione. Su ogni pozzetto vengono caricati 5 µg di proteina ad eccezione della corsia C nella quale sono stati erroneamente caricati approsimativamente 0,5 µg. di materiale proteico.
L’erronea ridotta carica sul gel del campione emergente dalla cromatografia di affinità (corsia C) non consente un confronto diretto sull’elettroferogramma con i campioni emergenti dalla cromatografia per scambio ionico e setaccio molecolare (rispettivamente corsie B e D). Tuttavia l’intensità dell’unica banda proteica di tale campione è ben comparabile con quella dello stesso peso molecolare relativa all’estratto grezzo (corsia A), indicando che dopo la cromatografia d’affinità l’enzima ricombinante umano risulta puro ad omogeneità elettroforetica. La particolarmente elevata differenza di intensità delle bande proteiche relative al campione emergente dal setaccio molecolare (Fig. 34, corsia D) conferma peraltro l’alto grado di purezza del preparato enzimatico. I risultati di efficienza della procedura di purificazione e di recupero di unità enzimatiche sono riportati in Tab.1. Come si può osservare il passaggio che si rivela più efficace è quello iniziale di scambio ionico nel quale un recupero di circa l’80% di unità enzimatiche è associato ad un incremento di attività specifica di circa il 60% del massimo.
31 Campione Volume (ml) Attività (U/ml) Unità totali Proteine (mg/ml) Proteine Totali (mg) Attività specifica (U/mg) Fattore purificazione Resa % E.G. 35,0 9,67 338,45 21,17 740,95 0,46 1,00 100,00 Pool DE-52 39,0 7,18 280,02 2,44 95,16 2,94 6,39 82,74 Pool Matrex 23 9,12 209,76 1,84 42,32 4,96 10,78 61,97 Pool G75 115,0 1,25 143,75 0,27 31,05 4,63 10,06 42,47
Tabella 1: Purificazione di AKR1B1 ricombinante umana. I valori riportati in tabella emergono da misure di attività enzimatica e contenuto proteico dei preparati enzimatici dopo le diverse tappe di purificazione. Il fattore di purificazione è definito dal rapporto tra l’attività specifica dell’enzima ad un determinato stadio di purificazione e l’attività specifica dell’estratto grezzo di partenza; La resa percentuale definisce l’attività enzimatica recuperata ad un determinato stadio rispetto alle unita totali presenti nell’estratto grezzo di partenza.
E’ opportuno rilevare, a questo punto che la cromatografia per gel filtrazione, indispensabile nella purificazione dell’enzima di cristallino di vitello, e, pur potenzialmente utile a rimuovere possibili contaminati non proteici a vario peso molecolare acquisibili dal preparato durante le tappe di purificazione, non appare essere di particolare utilità nel caso della purificazione dell’enzima ricombinante umano. Infatti, come si evince dai risultati di Tab.1, in cui sono registrati i dati di recupero dell’attività enzimatica e di arricchimento in purezza dell’enzima durante la procedura di purificazione, la tappa di gel filtrazione comporta non solo la perdita di quota dell’attività enzimatica (circa il 20%) ma, addirittura, una diminuzione di circa il 10% dell’attività specifica dell’enzima. Una evidenza questa che mette in discussione per la purificazione dell’AKR1B1 ricombinante umano la tappa finale di setaccio molecolare.
32
3.3. - Valutazione della stereospecificità di AKR1B1 nei confronti dell’HNE.
Preliminarmente alla studio cinetico con i due enantiomeri si è proceduto con la verifica della rispondenza dei parametri cinetici misurati con l’HNE racemo di nuova sintesi e quelli determinati con l’HNE già in uso presso l’Unità di Biochimica preparato secondo un diverso metodo di sintesi 14. Le misure di velocità iniziale di reazione alle diverse concentrazioni di substrato per l’HNE neosintetizzato e per quello di riferimento sono state eseguite almeno in triplo ed i risultati, sono riportati rispettivamente in Tab.2 e Tab.3 e messi in evidenza in Fig. 35, rispettivamente nel
pannello A e pannello B.
(R,S)-HNE μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min
μM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media σ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 1,62 1,62 2,91 2,27 1,95 2,27 1,79 2,06 0,46 40 2,59 2,43 2,69 2,36 2,52 2,27 2,43 2,62 2,20 2,24 2,43 0,17 50 2,27 2,11 3,55 2,11 3,55 2,36 2,75 2,91 2,72 2,70 0,56 60 3,39 2,91 3,55 2,86 3,18 0,35 70 2,75 3,71 3,81 3,39 3,88 2,48 3,34 0,59 80 3,81 4,52 4,52 3,09 3,29 2,91 2,91 3,58 0,71 90 2,75 4,84 4,36 2,86 3,70 3,80 3,80 3,73 0,75 100 3,65 4,84 4,84 3,07 4,13 3,77 4,05 4,05 0,64
33
(R,S)-HNE μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min
μM 1 2 3 4 5 Media σ 0 0 0 0 0 0 0,00 0,00 20 1,11 1,09 1,02 1,07 0,04 25 1,42 1,17 1,34 1,31 0,13 30 1,71 1,50 1,52 1,58 0,12 35 1,33 1,86 1,86 1,52 1,89 1,69 0,25 40 1,83 1,84 2,23 1,87 1,94 0,19 50 2,41 2,23 2,37 1,84 2,21 0,26 70 2,76 2,87 2,69 2,28 2,07 2,53 0,34 80 2,74 2,71 2,68 2,71 0,03 90 2,61 2,52 2,52 2,89 2,45 2,60 0,17 100 2,68 2,81 2,76 2,79 2,76 0,06 110 3,03 2,97 2,89 2,82 2,92 2,93 0,08
Tabella 3: dati dell’HNE presente in stock
Figura 35:Curve di saturazione di substrato per AKR1B1. Pannello A: racemo di nuova sintesi; Pannello B: racemo di controllo. Le misure sono state eseguite utilizzando 8 mU di enzima per il substrato di nuova sintesi e 4,7 mU per il substrato di controllo.
I parametri cinetici relativi alle due serie di misure sono stati determinanti mediante una analisi di regressione non lineare dei punti di Fig.35 nonché, per via grafica, utilizzando sia il grafico dei doppi reciproci Fig.36 ed il plot di Hanes-Woolf, Fig.37.
34
Figura 36: Grafico dei doppi reciproci per le due serie di dati
Figura 37: Grafico di Hanes Woolf
35 Campione Vmax (µM/min) KM (µM) Kcat (min-1) HNE nuova sintesi Regressione non lineare 6,8 ±0,3 72,6 ±6,4 95 ± 4
1/v0=(9724±582) [HNE]-1+(173±11.3) 5,8 ±0,4 56 ± 0,3 81 ± 6
[HNE]/v0=(1389±873)[HNE]+(138±6) 7,2 ±0,4 83.1 ±0.9 100 ± 5,5
HNE in stock Regressione non lineare 4,3 ±0, 2 53 ±5,6 102 ± 5
1/v0=(14030±606) [HNE]-1+(201±16) 5 ± 0,4 70 ± 2,6 119 ± 9,5
[HNE]/v0=(12931±777)[HNE]+(227±11) 4,4 ± 0,2 57 ± 6 104 ± 4,5
Tabella 4: Confronto tra i parametri cinetici di rilievo per l’HNE racemo
I due preparati sono risultati immediatamente comparabili per quanto riguarda il confronto della, valori indipendenti dalla quantità di enzima utilizzata. I risultati mostrano una buona comparabilità dei parametri cinetici. Ad una modesta differenza osservabile per la KM fa riscontro una sostanziale
identità nei valori misurati dell kcat. E’ evidente la differenza osservata per i valori di Vmax dal momento che il saggio con il substrato di riferimento è stato eseguito utilizzando una ridotta quantità di preparato enzimatico.
Utilizzando il medesimo approccio metodologico, sono stati determinati i parametri cinetici kcat e
KM utilizzando i due enatiomeri dell’HNE 4-(R)-HNE e 4-(S)-HNE di nuova sintesi. I valori di
velocità di reazione determinati almeno in triplicato alle diverse concentrazioni di substrato per i due enantiomeri R ed S sono riportatati rispettivamente in Tab.5 e Tab.6 mentre in Fig.38A e Fig. 38B sono riportati i grafici diretti relativi ai valori misurati.
36
(R)-HNE μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min
μM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 media σ 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 30 1,27 1,43 1,91 1,87 1,91 1,51 1,65 0,28 40 1,43 2,56 2,40 1,27 2,09 2,54 2,05 0,57 50 2,88 3,36 2,07 2,56 2,24 1,75 1,91 2,40 1,91 2,34 0,52 60 3,20 2,72 2,56 2,56 2,56 2,24 2,64 0,32 70 2,72 2,88 3,20 3,20 3,00 0,24 80 2,88 3,52 3,36 3,20 2,56 2,72 3,60 3,79 3,20 0,45 90 3,36 3,36 3,46 3,39 0,06 100 3,36 3,36 3,94 3,36 3,51 0,29
Tabella 5: Dati dell’(R)-HNE
(S)-HNE μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min μM/min
μM 1 2 3 4 5 6 7 8 media σ 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 30 2,36 2,20 3,17 2,20 2,48 0,46 45 3,97 3,65 2,69 3,81 2,85 3,39 0,59 50 3,33 4,61 4,13 4,03 0,65 60 4,61 3,81 4,29 4,45 3,65 4,16 0,42 75 5,10 3,81 4,61 4,13 4,78 4,49 0,51 80 3,97 3,97 5,10 5,10 4,53 0,65 90 4,94 4,45 4,94 4,61 4,29 4,65 0,29 105 4,78 4,78 5,26 5,10 4,98 0,24 120 4,94 5,42 5,58 5,58 5,58 5,58 5,42 5,58 5,46 0,22 135 5,10 5,10 5,42 5,26 5,42 5,26 0,16 150 4,94 5,90 5,74 5,74 5,26 5,52 0,40
37
Figura 38: Grafico diretto delle velocità di reazioni misurate a diverse concentrazioni di substrato; Pannello A: (R)-HNE; Pannello B: (S)-HNE. Le barre d’errore si riferiscono alla deviazione standard dalla media e, quando non visibili, rientrano nelle dimensioni del simbolo usato.
L’analisi grafica mediante il plot dei doppi reciproci e quello di Hanes-Wolff per i due enantiomeri (R)-HNE e (S)-HNE è rappresentata rispettivamente in Fig. 39 e Fig.40.
38
Figura 40: Grafico di Hanes-Wolff relativo ai due enantiomeri di HNE.
I valori emergenti dall’analisi di regressione non lineare e dall’analisi per via grafica sono riportati in Tab.7.
L’enzima è in grado quindi di discriminare i due enantiomeri dell’HNE. I dati evidenziano che l’enzima ha una affinità maggiore per l’enantiomero S, che mostra una Km circa due volte più bassa dell’enantiomero R. Si rimanda al paragrafo delle conclusioni dove è esposta una analisi critica dettagliata.
Analisi dei dati Vmax
(µM/min)
KM
(μM)
Kcat
(min-1)
(R)-HNE Regressione non lineare 7,0 ±0, 3 98,2 ±6,7 97 ± 2,1 1/v0=(15113±560)[R-HNE]-1+(131±10.8) 7,7 ±0,6 115 ± 5,3 108 ± 8,5
[R-HNE]/v0=(135.1±7.69)[R-HNE]+(14703±530) 7,4 ±,4 109.0 ±2.3 103 ± 5,1
(S)-HNE Regressione non lineare 7,3 ±0,3 47,6 ±5,7 102 ± 4 1/v0=(8384±815)[S-HNE]-1+(110±15.8) 9,2 ±1,3 76,0 ± 3,6 128 ± 57 [S-HNE]/v0=(126.3±10.13) [R-HNE]+(7973±698) 7,9 ±0,6 63.1 ±0.5 110 ± 13
39
3.4. - Misura dei parametri cinetici sul GS-HNE
Una volta accertato il grado di stereospecificità nel riconoscimento da parte di AKR1B1 nei confronti dei due enantiomeri dell’HNE, l’obiettivo programmato era quello di valutare la stereospecificità nei confronti dei diversi diastereoisomeri che si sono generati a seguito dell’addizione di Michael sui due enantiomeri (R) ed (S) dell’HNE. Il raggiungimento di tale obiettivo è stato tuttavia compromesso dalla impossibilità, durante il periodo di Tesi, di pervenire alla separazione delle diverse coppie anomeriche del GSHNE. Pertanto, nel cercare di definire un approccio utile alla separazione delle diverse coppie anomeriche del GSH ( al momento quella delle coppie anomeriche 3S,4R-GSHNE e 3R,4R-GSHNE) ci si è limitati alla caratterizzazione in termini di valutazione dei parametri cinetici del racemo.
I risultati delle misure di velocità utilizzandola miscela (3R,4R)-GSHNE e (3S,4R)-GSHNE come substrato sono riportati in Tab. 8 ed i risultati messi in evidenza nel grafico diretto in Fig.41A e nei grafici dei doppi reciproci e del plot di Hanes-Woolf rispettivamente Fig.41B e Fig. 41C .
(3R, 3S)(4R)-GSHNE μM/min μM/min media σ
0 ,00 0 ,00 0 ,00 0 ,00 0 ,00 60 3,633 3,62 3,63 0,01 70 3,94 4,02 3,98 0,06 90 4,39 4,34 4,37 0,03 110 4,98 4,95 4,97 0,02 115 5,85 6,25 6,05 0,28
40
Figura 41: Plot dei dati relativi al (3R, 3S)(4R)-GSHNE, nell’ordine : A: regressione non lineare; B: grafico dei doppi reciproci e C: Grafico di Hanes Woolf.
I parametri cinetici kcat e KM valutati con i diversi approcci sono riportati in Tab. 9.
Anche in questo caso la migliore comparabilità è tra i valori emergenti dall’analisi di regressione non lineare e quella grafica mediante il plot di Hanes. In relazione al valore ottenuto, tenendo conto che il GSHNE è presente in soluzione come aldeide libera, e quindi competente per una sua riduzione, in concentrazione approssimativamente pari al 5% del totale (il GSHNE è presente principalmente in soluzione per circa il 95% in forma emiacetalica), è da sottolineare la ottima capacità di catalitica dell’enzima in termini di riconoscimento del substrato, per il quale, infatti, il valore della KM apparente risulterebbe intorno a 6 µM.
Analisi Vmax (µM /min) KM (µ M) Kcat (min-1)
Regressione non lineare 11,0±1,1 128±2 261 Doppi Reciproci 9,9±1,1 105±3 235 Hanes-Wolff 10,9±,2 124±3 259
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3.5. - Approccio alla separazione della coppia enantiomerica
Per quanto la caratterizzazione cinetica di AKR1B1 condotta utilizzando i due enantiomeri di HNE permetta di definire un possibile scenario di trasformazione dell’alchenale, l’individuazione di una azione stereospecifica dell’enzima nei confronti delle quattro coppie anomeriche che possono venire a generarsi a seguito dell’addizione di Michael del glutatione sui due enantiomeri dell’HNE sarebbe utile a definire le caratteristiche di stereospecificità del processo di signalling AKR1B1-dipendente.
Come già rilevato in precedenza la risoluzione dei diversi diastereoisomeri non ha avuto modo di realizzarsi durante il presente lavoro di tesi, lasciando così aperto il dubbio sul riconoscimento stereospecifico di uno (o più d’uno) dei diversi diastereoisomeri di riduzione del GS-HNE quale molecola segnalatrice dell’attivazione della cascata dell’NFκB. Al riguardo è stata preliminarmente tentata la separazione delle due coppie anomeriche di GS-HNE derivanti dall’enantiomero (R)-HNE mediante HPLC su colonna a fase inversa C18, ottenendosi buone indicazioni sulla possibilità di risolvere mediante tale approccio le due corrispondenti coppie anomeriche (R,R)-GSHNE ed (S,R)-GSHNE. I risultati della separazione dei componenti la miscela di sintesi di GSHNE a partire da (R)-HNE e glutatione sono riportati in Fig. 42. Si osservano nella figura i picchi corrispondenti al GSH che non viene essenzialmente ritenuto dalla colonna (tempo di ritenzione 0,86 min), e all’HNE (tempo di ritenzione 14,23 min), individuati tramite l’approccio di arricchimento del picco, insieme a due picchi, non completamente risolti, con tempi di ritenzione intermedi, (12,99 min e 13,04 min) che per quanto non identificati direttamente sono ragionevolmente attribuibili alle due coppie anomeriche in studio.
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Figura 42: Analisi mediante HPLC della miscela di reazione tra (R)-HNE e GSH per la preparazione di (R,S)-GSHNE. Pannello A: due aliquote di 20 µL della miscela, contenenti 0,86 mM di GSHNE vengono addizionate di GSH alla concentrazione finale di 0,5 mM (profilo in azzurro) o di HNE alla concentrazione finale di 0,1 mM (profilo in rosso) applicate alla colonna e analizzate (vedi Materiali e Metodi § 5.2.9, Metodo1). I pannelli B e C non sono altro che l’ingrandimento ai tempi di eluizione critici lle corse di pannello A. In particolare, nel Pannello B (curva azzurra) è evidente l’innalzamento del picco del glutatione, mentre nel Panello C è evidente l’innalzamento del picco dell’HNE.
Alla ricerca di condizioni utili alla risoluzione delle due coppie anomeriche , è risultata utile una modifica del protocollo di eluizione i cui risultati sono mostrati in Fig. 43. Nelle nuove condizioni i due componenti di interesse della miscela, per quanto non direttamente identificati, appaiono ben risolti con tempi di ritenzione di 9,07 min e 9,25 min. Anche se la metodica richiede un ulteriore fase di ottimizzazione della metodica, i risultati ottenuti sono incoraggianti ai fini del raggiungimento dell’obbiettivo di poter arrivare a disporre almeno per i derivati glutationilati del (R)-HNE delle coppie anomeriche dei due diastereoisomeri.
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Figura 43- Ottimizzazione della separazione dei diastereoisomeri di (R,S)-GSHNE mediante HPLC
Nel riquadro superiore è riportato il profilo di eluizione della miscela di diastereoisomeri analizzata come descritto in Fig. 36 ma utilizzando un diverso protocollo di eluizione (vedi Materiali e Metodi § 5.2.9, Metodo2). Il riquadro inferiore non è altro che un ingrandimento del profilo ai tempi di eluizione dei due diastereoisomeri.
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4.
- Conclusioni
:
L’analisi cinetica eseguita su un preparato purificato di AKR1B1 ricombinante umana ha evidenziato che l’enzima è in grado di discriminare tra i due enantiomeri dell’HNE. Mentre la velocità massima di reazione per i due enantiomeri è risultata essere la stessa (7,4±0,4 e 7,9±0,6 mM/min, rispettivamente per gli enantiomeri R ed S), l’enantiomero R mostra una KM di 109,0±2,3
µM, circa due volte più alta di quella dell’(S)-HNE (KM 63.1±0.5 µM). Se dal punto di vista della
capacità di trasformazione dei due substrati la differenza osservata non è tale da ingenerare una significativa discriminazione tra i due enantiomeri a livelli relativamente alti di substrato, a più bassi livelli di HNE, l’enantiomero R, il più refrattario al riconoscimento di AKR1B1, potrebbe risultare arricchito e più disponibile per il processo di glutationilazione catalizzato dalla glutatione S-trasferasi.
In una tale condizione, sulla base della specificità di azione di quest’ultimo enzima di inserire la porzione glutationilica a generare i diastereoisomeri 3S dell’HNE la cellula verrebbe ad arricchirsi del diastereoisomero 3S,4R-GSHNE. La recente evidenza sperimentale che l’enzima umano carbonil reduttasi 1 (CBR1), è in grado di catalizzare l’ossidazione del GS-HNE al lattone del corrispondente acido glutationil-nonanoico con una apparente bassissima preferenzialità per il diastereoisomero in questione 3S,4R-GSHNE14, aprirebbe per quest’ultimo una possibile via di riduzione preferenziale ad opera AKR1B1 con formazione della molecola segnalatrice pro-infiammatoria.
È evidente che la naturale prosecuzione dell’indagine, non può prescindere dalla caratterizzazione della eventuale stereospecificità dell’azione enzimatica dell’ AKR1B1 sulle quattro coppie anomeriche che possono generarsi a seguito della formazione dell’addotto glutationilato dell’HNE. Per quanto tra gli obiettivi in programma del presente lavoro di tesi, come già accennato, la separazione dei diversi diastereoisomeri del GSHNE, già disponibile come racemo, è risultata più problematica del previsto, anche se risultati della sperimentazione in corso lasciano ben sperare nel raggiungimento dell’obiettivo in tempi brevi almeno per due (3S,4R- e 3R,4R-GSHNE) delle quattro coppie anomeriche. La disponibilità dei diversi diastereoisomeri aprirebbe la strada alla identificazione di restrizioni steriche di questi composti nel processo di trasformazione da parte dell’ AKR1B1 e quindi nella successiva fase di signalling cellulare. Inoltre, qualora verificata la preferenzialità d’azione di AKR1B1 sul diastereoisomero 3S,4R-GSHNE verrebbe, ad aprirsi la possibilità di un nuovo quadro di controllo metabolico delle specie molecolari in esame. Infatti due enzimi AKR1B1 e CBR1 potrebbero agire di concerto ed in modo complementare, indirizzando in
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modo stereospecifico i diastereoisomeri dell’GSHNE o verso l’eliminazione per via ossidativa (CBR1) oppure, per via riduttiva (AKR1B1), verso il “signalling” per una risposta di tipo infiammatorio.
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5. - Materiali e Metodi
5.1. - Materiali:
Reagenti: 1-octen-3-olo(Aldrich);Acroleina dietil acetale (Aldrich);Propionato di vinile(Aldrich);Catalizzatore Grubbs 2° Generazione (Aldrich);Candida antartica Lipasi A(Aldrich); Sodio fosfato bibasico (J.T. Baker); Solfato d'ammonio (J.T. Baker); EDTA (Juoro); PIC (inibitore di proteasi) (ICN); NADPH (Sigma Aldrich); Idrossido di sodio (J.T. Baker); Cloruro di sodio (J.T.
Baker); Nitrato d’Argento (J.T. Baker); Ammoniaca (Carlo Erba); Biorad protein assay solution (BioRAD Laboratories); Metanolo (Sigma Aldrich); BSA (Sigma Aldrich); D,L-gliceraldeide (Sigma Aldrich); ditiotreitolo (DTT) (Sigma Aldrich); Acrilammide (BioRAD Laboratories);
N,N’-metilen-bis-acrilammide (BioRAD Laboratories); TEMED (BioRAD Laboratories); Ammonio persolfato (BioRAD Laboratories); SDS (BioRAD Laboratories); Tris HCl (BDH); Standard proteici per SDS-page (BioRAD Laboratories); Glicerolo (BDH); DEAE cellulosa DE-52
(Whatman); Matrex Orange A (Millipore Amicon); Sephadex G 75 (GE Healthcare), membrane da
dialisi Ultracel (Amicon);
Strumenti: Centrifuga Avanti J-20 (Beckman); Sonicatore VibraCell (Sonic and Materials); Spettrofotometro (Libra, Biochrom); Le analisi TLC sono state eseguite con lastrine in gel di silice supportata su PET (Sigma Aldrich); le analisi gas-cromatografiche sono state effettuate con un Gascromatografo Dani GC 1000 con iniettore PTV e interfacciato con unità di elaborazione Dani
DDS 1000, usando una Agilent J&W HP-5ms (30m x 0,25mm x 0,25 μm)con una rampa di
temperatura : 50°C(2’)-10°C/min->150°C(5’)-30°C/min->280°C(70’) e per il calcolo dell’eccesso enantiomerico una Chiraldex G-TA (20m x 0.25 mm x 0,25 μm ) e con un Perkin Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm); le analisi HPLC per la separazione degli enantiomeri del GS-HNE sono state effettuate con uno strumento Beckman Gold system 126/168.Le analisi 1H-NMR sono state condotte utilizzando uno spettrometro Varian
Gemini a 200 MHz e uno spettrometro Bruker a 400 MHz, usando TMS come standard interno.Gli
spettri NMR sono stati riportati usando la seguente notazione: s = singoletto, d = doppietto, m = multipletto. Se non diversamente specificato, tutte le reazioni sono state condotte sotto una leggera pressione di Ar, utilizzando una tecnica Schlenk
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5.2. - Parte sperimentale:
Sintesi ± (E)-1,1-dietossinon-2-en-4-olo (5):
In un pallone da 100 mL, a 2 colli dotato di refrigerante ed ancoretta magnetica, è stato caricato 1 ml di 1-otten-3-olo 22 (837 mg, 1equiv, 6.5 mmol) e 35 mL di DCM. Successivamente, sono stati aggiunti 3 mL di acroleina dietilacetale 23 (2.6 g ,2.3 eq, 19.5 mmol) e 138 di catalizzatore Grubbs di 2° generazione mg (0.025 eq, 0.1625 mmol). La miscela di reazione così ottenuta è lasciata in agitazione a temperatura ambiente ed il suo andamento è stato seguito tramite analisi GLC con prelievi effettuati ogni 2 ore. Dopo 6 ore la reazione è stata fermata, il solvente allontanato a pressione ridotta a temperatura ambiente ed il prodotto grezzo così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice, impiegando come miscela eluente una soluzione di etere di petrolio/acetato di etile in proporzione 80/20. Le frazioni cromatografiche contenenti il prodotto sono riunite e concentrate, fornendo 1.02 g di un liquido color ruggine. Una successiva purificazione tramite distillazione ha permesso di ottenere 792 mg di un liquido incolore con una resa del 53%. La caratterizzazione spettroscopica effettuata è in completo accordo con i dati riportati precedentemente in letteratura26:
1H-NMR (400 MHz, CDCl
3) δ: 0.87–0.90 (m, 3H, CH3), 1.20 (t,6H, 2xCH3), 1.30–1.34 (m, 6H, 3xCH2),1.55 (m, 2H, CH2), 3.48–3.52 (m, 2H, CH2), 3.62–3.66 (m, 2H, CH2),4.15 (s, 1H, CH), 4.89–4.91 (m, 1H, CH),5.66–5.71 (m, 1H, CH), 5.84–5.88 (m, 1H, CH).
48 Separazione (S)-otten-3-olo propanoato 24, (R)-otten-3-olo R-22:
In un pallone da 100 mL, a 1 collo dotato ancoretta magnetica, sono stati caricati 2.5 ml di ± 1-otten-3-olo 22 ( 2.1 g, 1equiv, 16 mmol ) e 30 mL dietere diisopropilico. Successivamente, sono stati aggiunti 11 mL di propanoato di vinile (6.5 eq, 97.5 mmol) e 214 mg di Cal-B (5000U/g). Dopo 21 ore la miscela di reazione è stata filtrata su celite ed il solvente allontanato a pressione ridotta. I composti S-24 e R-22 sono stati separati tramite cromatografia flash utilizzando in sequenza due miscele eluenti: EtP/AcOEt in proporzione 97/3 e EtP/AcOEt in proporzione 90/10. La prima miscela ha permesso di recuperare l’estere, la seconda di recuperare l’alcol. In tal modo è stato possibile recuperare il composto S-24 con resa del 90% e il composto R-22 con una resa dell’86%.1HNMR (S-1-octen-3-olo-propanoato) δ= 0.88(t 3H), 1.19 (t, 3H), 1.26-1.63(m 8H), 2.32 (q ,2H), 5.11-5.29(m, 3H), 5.70-5.87(m, 1H). Di seguito i valori di eccesso enantiomerico delle due molecole. e.e S-24 : 99% (Perkin Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm))R.t (S)24.73 min (R)23.81min Conc: 11.7 mg/mL; Solv: Cloroformio; Lunghezza d’onda: 589.3 nm; Temp: 22.5 °C
e.e R-22 :99% Perkin Elmer Autosystem con colonna chirale CyclodexB (30 m x 0.25 mm x 0,25 μm) R.t (R) 22.91 min (S) 25.57 min Conc: 12.5 mg/mL (litIV. ).; Solv: Cloroformio; Lunghezza d’onda: 589.3 nm; Temp: 22.5 °C
Segno e valore assoluto di potere ottico rotatorio dell’alcol sono coerenti con i dati di letteratura, mentre non ci sono dati in letteratura relativi all’estere.
IV A. F. Badenhop, W. F. Wilkens, The formation of 1-octen-3-o1 in soybeans during soaking journal of the oil chemists' society, 46,
