PAZIENTI
Hanno preso parte allo studio 45 soggetti con asma, con età media di 60.3 anni (range 25- 80). 42 pazienti erano non fumatori, solo 3 pazienti ex fumatori con pack years<10. Il BMI (body mass index) presentava una media di 28.01 indicando come mediamente i pazienti reclutati fossero in sovrappeso. Il 66% di essi presentavano atopia ed il 27% reazione di ipersensibilità ad ASA e/FANS. Per quanto riguarda l’insorgenza di malattia la media di età risultava essere 39 anni e ben il 60% presentava un’insorgenza tardiva (late onset). La durata media di malattia ottenuta è stata 21.3 anni. Nel momento in cui i pazienti sono stati reclutati per lo studio il 42% di essi riferiva buon controllo della patologia, quelli con parziale controllo di malattia erano il 49% mentre solo il 9% risultava non controllato.La valutazione del controllo è stata fatta tenendo in considerazione la presenza di sintomi diurni e necessità di broncodilatatore al bisogno più di due volte a settimana, risvegli notturni dovuti ad asma e limitazione delle attività causata dalla malattia nelle 4 settimane precedenti alla visita. Tutti i pazienti stavano effettuando una terapia regolare con combinazione di broncodilatatore e steroide inalatorio a dosaggio medio-alto, in particolare il 62% attuava una terapia GINA STEP 4 mentre il restante 38% GINA STEP 5. Il pattern infiammatorio prevalente è risultato essere quello eosinofilico presente nel 45% sei soggetti analizzati (Tabella 1).
Tabella 1: Caratteristiche clinico-demografiche nella totalità dei pazienti studiati
L’analisi dell’espettorato indotto non è risultata attendibile in 5 pazienti su 45 totali
Numero totale pazienti 45
Sesso (F/M) [N, %] 32/13 71/29 %
Età [media±DS] 60.3 ± 13.58
BMI [media±DS] 28 ± 5.96
Atopia [n,%] 30 66%
Asma Onset [media±DS] 39±19.52
Early [n, %] 9 20% Intermediate [n, %] 9 20% Late [n, %] 27 60% Durata [media±DS] 21.3± 13.07 Controllo GINA Controllato [n, %] 19 42% Parzialmente controllato [n, %] 22 49% Non controllato [n, %] 4 9% ASA intolerance [n, %] 12 27%
Step terapia – GINA
Step 4 28 62% Step 5 17 38% Citologia espettorato Eosinofilico [n, %] 18 45% Neutrofilico [n, %] 6 15% Misto [n, %] 13 32.5%
METODI Spirometria
La spirometria è stata eseguita mediante uno spirometro a campana computerizzato (Biomedin, Padova, Italia). Per ciascun paziente sono state eseguite almeno 3 manovre, prima e 20 minuti dopo aver inalato 400 mcg di salbutamolo, nel rispetto delle
raccomandazioni internazionali. I valori di FEV1, FVC e PEF ottenuti sono stati confrontati
con i valori teorici standard.
Ossido Nitrico(NO)
L’NO è stato misurato nell’aria espirata, usando un analizzatore rapido di NO (NO analyser NOA,Sievers 280) secondo un protocollo standardizzato. Il paziente effettua una singola, lenta manovra di espirazione, della durata di 35-40 secondi, contro una modesta resistenza, e la concentrazione di NO alla bocca viene registrata durante tutta la fase espiratoria. Viene misurato il valore di NO nella fase terminale dell’espirazione. Si effettuano almeno tre manovre accettabili (la variazione deve essere inferiore al10%) e se ne considera il valore più alto.
Analisi del siero
In tutti i pazienti è stato effettuato un prelievo di sangue venoso. Il campione è stato centrifugato a 250g per 10 minuti ed immediatamente congelato a -80°C con successiva analisi per la misurazione dei marcatori biologici: periostina ed eosinofili.
Induzione ed analisi dell’espettorato
L’espettorato è stato indotto con l’inalazione di una soluzione salina ipertonica, nebulizzata tramite l’utilizzo di un nebulizzatore ultrasonico (Sirius, Technomed, Firenze, Italia). Dopo la misurazione basale del FEV1, è stata effettuata una premeditazione con
salbutamolo (200 mcg per aerosol dosato), allo scopo di prevenire una eccessiva broncocostrizione indotta dalla soluzione salina ipertonica. L’aerosol, prodotto con portata 2.8ml/min, è stato inalato per un periodo variabile, da un minimo di 5 minuti ad un massimo di 15 minuti, utilizzando una soluzione di NaCl al 4.5%. Ad intervalli di 5 minuti, a partire dall’inizio dell’inalazione, al paziente è stato chiesto di risciacquare accuratamente bocca e gola e provare ad espettorare in un apposito contenitore. La misurazione del FEV1 è stata
qualvolta il paziente riferiva sintomi di broncostenosi. Il test è stato interrotto dopo 15
minuti dall’inizio dell’inalazione ed in ogni caso per una caduta del FEV1>20% rispetto al
valore basale.
Dal campione di espettorato le parti di muco maggiormente dense(plugs) sono state separate dalla saliva, opportunatamente pesate e diluite con l’agente fluidificante ditiotreitolo (0.1% in tampone fosfato) nel rapporto di 1:4. I campioni sono stati incubati a 37°C per 15 minuti e quindi pipettati per dissolvere ulteriormente gli aggregati di muco. Alla fine dell’incubazione sono stati diluiti in tampone fosfato nel rapporto finale di 1:10 e successivamente filtrati attraverso una garza di nylon da 53 µm (Giuliani Filtrazioni, Torino, Italia) al fine di eliminare la componente non fluidificata. Dopo la loro centrifugazione (450g per 10 minuti), per separare il pellet cellulare dal sovranatante, quest’ultimo è stato immediatamente congelato a -80°C per la successiva analisi dei mediatori solubili mentre il pellet cellulare è stato utilizzato per la conta cellulare totale. Essa è stata effettuata utilizzando un emocitometro e la colorazione del Trypan blu, un colorante vitale che ha permesso contemporaneamente di valutare anche la vitalità cellulare. Sono stati scartati i campioni in cui è stata riscontrata una vitalità cellulare inferiore al 50%. Dopo la conta cellulare, aliquote del campione contenenti uno specifico numero di cellule (30’000-60'000) sono state citocentrifugate (450 rpm per 5 minuti tramite citocentrifuga Cytospin; Shandon Scientific,Sewickley,PA) per l’allestimento dei preparati citologici e colorate con la colorazione di Diff-Quick (Baxter Scientific Products,Miami,FL) al fine di effettuare la conta cellulare differenziale. Le cellule infiammatorie sono state espresse in % delle cellule infiammatorie totali escludendo le cellule squamose.
Analisi dei mediatori solubili
Tutti i mediatori solubili sono stati dosati nel sovranatante ottenuto dalla processazione dell’espettorato, come precedentemente riportato. Le concentrazioni delle chemochine, IL-8 e RANTES, dei fattori di crescita, GMCSF, TGF-ß e FGF-2, ed infine della periostina, proteina della matrice extracellulare, sono state quantificate mediante tecnica immunoenzimatica(ELISA), seguendo, per la maggior parte dei mediatori, la procedura fornita dalla ditta di produzione (R&D System, USA). Sono state introdotte alcune modifiche tecniche soltanto per quanto riguarda il dosaggio di periostina e GM-CSF allo scopo di aumentare la sensibilità del saggio. Tutti i campioni ed i punti della curva standard sono stati analizzati in duplicato. Il valore limite di sensibilità del saggio immunoenzimatico è risultato di 15 pg/ml per l’IL-8, RANTES e periostina; 4 pg/ml per
FGF-2 e TGF-ß; 7 pg/ml per GM-CSF. Il valore medio dei coefficienti di variazione intra- saggio ed inter-saggio era pari rispettivamente al 3.7% ed al 7.5%.
Analisi statistica
Tutti i parametri con distribuzione normale sono espressi come media e deviazione standard, mentre gli altri sono espressi come mediana e range.
I dati relativi ai dosaggi di periostina, TGF-ß, FGF-2, GM-CSF, RANTES ed eosinofili (questi ultimi indicati in numero totale e percento), sono espressi come medianae range interquartile di ogni campione valutato in duplicato.
Per lo studio statistico è stato utilizzato il programma SPSS Statistics Base. I dati relativi ai gruppi con ostruzione persistente e non ostruiti sono stati analizzati mediante il test ANOVA per i dati parametrici e con il test di Mann-Whitney per i dati non parametrici. Le correlazioni tra periostina nell’espettorato indotto ed i parametri funzionali sono state ottenute tramite test di Spearman. La probabilità inferiore a 0.05 è stata considerata statisticamente significativa.
RISULTATI
I pazienti sono stati suddivisi in due gruppi sulla base dei valori ottenuti all’esame spirometrico. In particolare:
-Gruppo dei pazienti con ostruzione bronchiale persistente: essi presentavano un indice di Tiffenau ≤88 nei soggetti di sesso maschile o ≤89 nei soggetti di sesso femminile in % del
teorico (media di 71.9) all’esame spirometrico. In questi soggetti il valore medio di FEV1 in
% del teorico era 63.9, raggiungendo una media di 70.5 dopo l’utilizzo di broncodilatatore denotando pertanto una ostruzione di medio-lieve entità. La definizione di ostruzione persistente in questi soggetti, stabilita sulla base della mancata normalizzazione dell’indice di Tiffeneau post-broncodilatatore, è stata supportata dalla revisione delle prove spirometriche eseguite negli anni, necessaria in considerazione della variabilità della funzione polmonare tipica dell’asma ed ha permesso di supporre la presenza di rimodellamento delle vie aeree in questo gruppo di pazienti.
-Gruppo dei pazienti senza ostruzione bronchiale: gruppo di controllo con indice di Tiffenau in % del predetto ≥ 88 nei soggetti di sesso maschile ed 89 nei soggetti di sesso femminile e variabilità dei valori di FEV1 in % del predetto nella storia clinica, con normale funzione
polmonare nei periodi di stabilità.
Le caratteristiche di questi due gruppi di pazienti sono indicate nelle tabelle 2A, 2B e 2C. Per quanto riguarda i dati clinico-demografici, i due gruppi non presentano differenze statisticamente significative, anche se è opportuno sottolineare come le femmine siano l’83% nel gruppo dei pazienti non ostruiti contro il 59% nel gruppo degli ostruiti.
Per quanto concerne i marcatori biologici, sono presenti alcune differenze statisticamente significative o ai limiti della significatiità. In particolare i valori di periostina e di TGF-ß risultano essere più elevati nell’espettorato dei pazienti con ostruzione persistente, con una significatività rispettivamente inferiore a 0.05 e 0.01. Queste significatività sono mostrate in Figura 1A.
GM-CSF e FGF-2 risultano invece statisticamente più elevati nel gruppo dei pazienti senza ostruzione persistente con una significatività rispettivamente inferiore a 0.05 e 0.001. I valori ottenuti di questi due marcatori vengono mostrati in Figura 1B dove sono presenti anche RANTES ed IL-8 che non sono risultati possedere differenze statisticamente significative nei due gruppi.
Tabella 2A: Caratteristiche clinico demografiche nei pazienti Ostruiti e Non ostruiti