(N=19) PERIOSTINA SANGUE <MEDIANA (N=19) SIGNIFICA TIVITA’ Pazienti Ostruiti [n, %] 13 67% 7 33% p=0.05 Pre-BD FEV1 %pred[media±DS] 74.21 ± 19.77 83.37 ± 20.78
Post-BD FEV1 %pred
[media±DS] 79.1 ± 17.9 86.1 ± 22.7 Pre-BD Tiffenau %pred[media±DS] 77.8 ± 9.8 83.8 ± 16.6 Risposta BD % [media±DS] 14 ± 13.5 11.8 ± 9.5 Pre-BD FVC %pred [media±DS] 94.3 ± 18.9 102.7 ± 15.4 Post-BD FVC %pred [media±DS] 100.5 ± 18.3 105.2 ± 13.3 Pre-BD SVC %pred [media±DS] 100.1 ± 18.8 106.1 ± 15.1
Tabella 4C: Marcatori biologici nei pazienti con periostina nel sangue maggiore o minore della mediana (=46,45 ng/ml)
PERIOSTINA SANGUE >MEDIANA (N=19) PERIOSTINA SANGUE <MEDIANA (N=19) IL 8 (ng/ml) [mediana, range] 17.42 (2.1-40,2) 11.4 (1.4-29.3) GMCSF (pg/ml) [mediana, range] 19.2 (0-325.6) 67 (0-391.1) RANTES (pg/ml) [mediana, range] 525 (140-1430) 250 (0-7390) FGF-2 (ng/ml) [mediana,range] 10.93 (1.72-20.61) 14.38 (0-18.94) TGFβ (pg/ml) [mediana, range] 808.7 (0-5561.4) 375.3 (0-5454.68)
Eosinofili sangue (n. ass)
[mediana, range] 310 (50-1020) 240 (70-920)
Eosinofili sangue (%)
DISCUSSIONE e CONCLUSIONI
Il nostro lavoro si è focalizzato sullo studio dei mediatori pro-fibrogenici ed in parallelo infiammatori, presenti nell’espettorato di 45 pazienti con asma grave. Tra questi, la periostina è stata dosata anche nel siero.
I soggetti reclutati, sono stati suddivisi sulla base dei valori ottenuti all’esame spirometrico:un gruppo caratterizzato da ostruzione bronchiale persistente con indice di Tiffenau ≤ 88 %pred nei soggetti di sesso maschile o ≤ 89 %pred nei soggetti di sesso femminile, che quindi presentava una ostruzione di lieve-media entità (valore medio di
FEV1 in % del teorico= 63.9) ed un altro gruppo senza ostruzione bronchiale, con indice di
Tiffenau ≥ 88 %pred nei soggetti di sesso maschile ed 89 %pred nei soggetti di sesso femminile.
I risultati di questa tesi dimostrano differenze statisticamente significative nei due gruppi di pazienti considerati, per quanto riguarda i livelli di periostina e TGF-ß nell’espettorato indotto. Entrambi i biomarcatori risultano più elevati nel gruppo dei soggetti con ostruzione persistente (n=22) rispetto al gruppo di pazienti che non presentano ostruzione (n=23), in concordanza con i dati presenti in letteratura, che dimostrano il loro ruolo diretto nello sviluppo del rimodellamento bronchiale. La periostina inoltre, si è
dimostrata correlare in maniera inversa sia con i valori di FEV1 pre broncodilatore in % del
teorico che con i valori di FVC post broncodilatatore in % del teorico ed il suo dosaggio nel siero ha mostrato una tendenza, con valori ai limiti della significatività, sempre a favore del gruppo dei pazienti con ostruzione persistente.
Per quanto concerne gli altri biomarcatori, GM-CSF e FGF-2 sono risultati statisticamente più elevati nel gruppo dei pazienti senza ostruzione, mentre i dati clinico- demografici nei due gruppi presi in esame non hanno mostratodifferenze statisticamente significative.
Successivamente, abbiamo calcolato la mediana dei valori di periostina in questi due liquidi biologici, dividendo i pazienti in un gruppo che presentava livelli di questo biomarcatore maggiori rispetto alla mediana ed un altro con valori inferiori. Questa divisione è stata effettuata sia sulla base dei valori di mediana di periostina calcolata sull’espettorato che sul sangue.
Per quanto riguarda la periostina nell’espettorato, nei due gruppi è risultata presente una differenza ai limiti della significativa (p=0.05) nella % di eosinofili presenti
nell’espettorato, con i soggetti con valori di periostina nell’espettorato superiori alla mediana che mostrava valori più elevati di eosinofili nell’espettorato. Inoltre il gruppo con valori di periostina nell’espettorato maggiore della mediana presenta una percentuale di pazienti con ostruzione persistente del 67% contro il 42% di quelli con periostina minore della mediana ed un peggior controllo di malattia (assenza di controllo nel 22% di essi).
I valori di periostina nel sangue hanno evidenziato una differenza significativa nell’età media dei pazienti; in particolare l’età è risultata più elevata (65 anni) nei pazienti con valori più alti di periostina ematica rispetto a quelli con valori minori (55 anni). Inoltre i pazienti con valori di periostina nel sangue maggiore della mediana hanno mostrato una tendenza (p=0.05) per quanto riguarda la percentuale di pazienti con ostruzione persistente; questi sono il 68%, a differenza del 37% nel gruppo di pazienti con valori di periostina nel sangue minore della mediana.
I dati emersi dal nostro studio differiscono da quanto dimostrato per altri mediatori di infiammazione e rimodellamento in un campione di soggetti con asma grave misurati sull’espettorato indotto, nel quale non emergevano differenze tra il gruppo con persistente ostruzione nei confronti di quello con ostruzione intermittente ( 128)
. In questo studio, effettuato su 34 pazienti, le citochine dosate nell’espettorato indotto non hanno mostrato differenze nei due gruppi presi in esame che, a differenza del nostro lavoro, sono stati
suddivisi sulla base del valore di FEV1 maggiore o minore del 75% del predetto all’esame
spirometrico. Per quanto riguarda l’analisi dell’espettorato, Kaminska et al. non hanno evidenziato differenze significative tra soggetti ostruiti e non ostruiti nel dosaggio della proteina cationica eosinofila (ECP), mieloperossidasi (MPO), metalloproteinasi della matrice (MMP-9) ed inibitore tissutale di metalloproteinasi della matrice (TIMP-1). Inoltre è stato effettuato, su 9 pazienti con ostruzione peristente e 14 con ostruzione intermittente, il dosaggio di IL-1b, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, eotassina, fattore di crescita fibroblastica, fattore stimolante colonia granulocitaria (GM- CSF), IFN-(MCP)1, proteina infiammatoria macrofagica (MIP), RANTES, TNF-α e fattore di crescita endoteliale vascolare, senza che venissero dimostrate differenze significative. Per quanto riguarda RANTES, anche i nostri risultati non hanno mostrato differenze nei due gruppi, mentre il fattore di crescita fibroblastica e quello stimolante le colonie granulocitarie (GM-CSF) sono risultati più elevati nei soggetti non rimodellati. In questo lavoro l'analisi del componente principale ha rivelato che le variabili dominanti erano IL-12, IL-13 e IFN-γ
nel gruppo con ostruzione cronica e IL-9, IL-17, MCP-1 e RANTES nel gruppo con ostruzione intermittente.
Gli autori hanno dimostrato che l'ostruzione cronica persistente del flusso d'aria nei soggetti con asma grave è associata ad una precedente età di insorgenza ed addurata più lunga di malattia; mentre la nostra analisi statistica non ha ottenuto differenze in questo senso con una durata di malattia praticamente identica nei due gruppi ed un’eta media di insorgenza che differiva per soli 3 anni.
Per quanto riguarda il TGF-ß i suoi valori più elevati nei soggetti con ostruzione persistente risultano concordi con i dati di letteratura: è stato dimostrato che gli eosinofili presenti in soggetti con asma grave possiedono una up-regolazione dell’RNA messaggero per il TGF-ß suggerendo un loro ruolo attivo non solo nello sviluppo dell’infiammazione ma anche nella produzione di questo fattore di crescita e nei cambiamenti strutturali, come
la fibrosi subepiteliale, che si sviluppano nel rimodellamento (69)
. A conferma di questo fatto, la percentuale di eosinofili nel BAL dei soggetti con asma grave correla significativamente con la produzione di TGF-ß. Questo dato è stato riscontrato non solo nell’uomo, ma anche in un modello murino dove si è dimostrato l'infiammazione eosinofila delle vie aeree è responsabile dello sviluppo del rimodellamento delle vie aeree e dell'iperreattività
bronchiale nell’asma bronchiale allergica (70)
.
Inoltre già in passato era stato evidenziato come l’incremento di TGF-ß correlasse con l’ispessimento della membrana basale ed il numero di fibroblasti, sia in pazienti asmatici checon bronchite cronica, rispetto a controlli sani (71)
.
In merito alla validità ed all’utilità del dosaggio della periostina nell’espettorato indotto, i dati disponibili in letteratura sonolimitati e controversi.
In uno studio pubblicato nel 2015 (129)
, il cui scopo era quello di indagare il ruolo potenziale della periostina come marcatore di fenotipo per l’asma grave, in un gruppo di 62 pazienti con asma grave ed infiammazione eosinofilica persistente,essa è risultata più elevata nell’espettorato di pazienti con infiammazione eosinofilica rispetto ai soggetti con pattern infiammatorio misto, un risultato in linea con il nostro studio dove si è manifestata una differenza ai limiti della significativa (p=0.05) nella % di eosinofili presenti nell’espettorato, nel gruppo di pazienti con periostina nell’espettorato superiore alla mediana. Inoltre lo studio di Bobolea et al. ha ottenuto livelli significativamente più altiperi pazienti con ostruzione persistente (69.76 vs 43.84 pg/ml con p<0.05), altro dato concorde con il nostro lavoro dove il gruppo con valori di periostina nell’espettorato maggiore della
mediana presenta una percentuale di pazienti con ostruzione persistente del 67% contro il 42% di quelli con periostina minore della mediana. In questo studio è stata inoltre segnalata
una correlazione inversa tra il post broncodilatore FEV1/FVC ed livelli di periostina
nell’espettorato, differentemente dai nostri risultati dove questa correlazione è risultata
presente sia per il FEV1 pre broncodilatatore in % del teorico che con i valori di FVC post
broncodilatatore in % del teorico.
A conclusione dello studio, però, la correlazione tra i livelli di periostina e l’eosinofilia nell’espettorato indotto è stata giudicata debole.
Uno studio recente (130)
ha esplorato la relazione tra i livelli di periostina nelle vie aeree e sul siero e l’eosinofilia misurata sull’espettorato indotto su un campione di 83 pazienti asmatici non fumatori con scarso controllo di malattia.I livelli sierici di periostina sono risultati nettamente più alti rispetto a quelli misurati nell’espettorato (dato coincidente con quanto osservato nel nostro studio, dal momento che si parla di ng per la periostina nel siero e di pg per quella nell’espettorato). Il dosaggio di questo marcatore misurato in entrambi i liquidi biologici è risultato più elevato nel gruppo di pazienti con asma eosinofilico rispetto ai pazienti con asma non-eosinofilico, dimostrando un’associazione significativa con l’infiammazione eosinofilica. La periostina sierica e quella misurata nell’espettorato sono risultate predittive dell’infiammazione eosinofilica, ma la forza dell’associazione è risultata essere scarsa.Anche nel nostro lavoro, i pazienti con periostina nell’espettorato e nel siero con valori superiori alle rispettive mediane hanno presentato un fenotipo infiammatorio eosinofilico preponderante rispetto a quello neutrofilico e misto, confermando l’associazione tra livelli di periostina ed eosinofili, ed è risultata presente, come sottolineato precedentemente, una differenza ai limiti della significativa (p=0.05) nella % di eosinofili presenti nell’espettorato, con i soggetti con valori di periostina nell’espettorato superiori alla mediana che presentano valori più elevati di eosinofili nell’espettorato. Occorre sottolineare come i pazienti senza controllo di malattia reclutati nel nostro studio fossero solamente il 9% del totale, anche se il gruppo con valori di periostina nell’espettorato maggiore della mediana era, di tutti i gruppi studiati, quello caratterizzato dal peggior controllo di malattia con il 22% del totale dei pazienti senza controllo di malattia. Gli autori dello studio, per spiegare l’enorme discrepanza tra i livelli di periostina sul siero e sullo sputo hanno avanzato delle ipotesi per quanto riguarda l’attendibilità del suo dosaggio sull’espettorato. Innanzitutto bisogna tenere in conto che i test ELISA disponibili sono stati messi a punto per il suo dosaggio sul siero. In secondo luogo il dosaggio della periostina sull’espettorato potrebbe risentire dell’effetto della diluizione o dell’influenza della sputolisina sul
rilevamento delle proteine nel supernatante. Alla base dei bassi livelli di periostina riscontrati nell’espettorato, potrebbe esserci anche una spiegazione biologica. Dal momento che la periostina è localizzata a livello della membrana basale subito al di sotto dello strato epiteliale, l’ipotesi è che le cellule epiteliali la secernano rapidamente nello strato subepiteliale. Pertanto, la sua concentrazione nel supernatante potrebbe essere più bassa poichè esso rispecchia il contenuto intraluminale delle vie aeree.
Il maggior livello di GM-CSF nei soggetti che non hanno sviluppato rimodellamento è in linea con il maggior grado di infiammazione di tipo eosinofilico presente in questi soggetti, mentre il maggior livello di FGF-2 sempre in questi soggetti non è chiaramente spiegabile e suggerisce un ruolo differente da quello pro-fibrotico dimostrato in-vitro per questo mediatore. Esso potrebbe avere azione protettiva, a seguito di lesioni epiteliali
polmonari, come dimostrato in uno studio del 2014 (131)
: gli autori hanno utilizzato un modello murino nel quale, tramite l’utilizzo di bleomicina, sono riusciti ad indurre la fibrosi polmonare sia nel gruppo di controllo sia in topi FGF-2 knockout. Quest’ultimi hanno presentantoun aumento della mortalità e perdita di peso, con incapacià di risoluzione dell’infiammazione, aumentata cellularità nel BAL ed insufficiente recupero dell'integrità epiteliale. Questi risultati propongono un ruolo come fattore di crescita protettivo in seguito a lesioni epiteliali polmonari per FGF-2, mettendo in discussione la sua azione pro-fibrotica in vivo.
In conclusione, questo studio pilota ha permesso di individuare alcuni biomarcatori (la periostina e il TGF-beta) che risultano più elevati nel supernatante dell’espettorato di soggetti con asma grave che avevano sviluppato ostruzione bronchiale non più completamente reversibile rispettto a quelli con normale funzione respiratoria. Considerando il ruolo che questi due mediatori hanno in modelli sperimentali di rimodellamento, questa osservazione ne conferma l’importanza come biomarcatori dello sviluppo di ostruzione bronchiale non più completamente reversibile nei pazienti con asma grave. Questo aspetto viene confermato dall’esame della periostina nel sangue, anche se in questo liquido biologico il segnale è meno evidente, suggerendo quindi che il materiale ricavato dall’espettorato indotto sia un campione più adeguato per lo studio dei processi che si svolgono nelle vie aeree.
Infine, la presenza di un maggior livello di eosinofilia nell’espettorato dei soggetti con valori di periostina nell’espettorato superiore alla mediana suggeriscono che in effetti il processo infiammatorio e quello di rimodellamento (di cui la periostina può essere un
indicatore) possano procedere in maniera parallela, secondo le più moderne vedute relative alla fisiopatologia del rimodellamento nell’asma.
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