PCR end-point

Introdotta negli anni ’80 ha segnato un punto di svolta epocale nelle analisi del DNA rivoluzionando l’intero comparto della genetica molecolare mediante un approccio nuovo e innovativo per lo studio e l’analisi dei geni. La tecnica, dotata di estrema sensibilità e specificità, consente la sintesi enzimatica in vitro di segmenti di DNA in maniera esponenziale, amplificando il numero di molecole target di partenza e di fatto riproducendo sintetitcamente quella reazione enzimatica che in vivo è la replicazione del DNA. Si tratta di una reazione di tipo ciclica, ripetuta un numero variabile di volte direttamente proporzionale alla quantità di prodotto target ottenuto. Il DNA è sottoposto inizialmente a una fase di denaturazione ad elevate temperature che provoca il cosiddetto melting del DNA, ovvero la distruzione dei legami idrogeno esistenti tra le basi complementari e quindi perdita delle interazioni chimiche e apertura della doppia elica. La temperatura di reazione a questo punto viene abbassata in un range variabile da 50- 65°C, in cui viene consentita la fase di appaiamento o annealing dei primer, ovvero la completa ibridazione agli estremi 3’ e 5’ di una coppia di oligonucleotidi sintetici (circa 19-25 basi) sulle regioni fiancheggianti la regione target di DNA a singolo filamento. La temperatura in questa fase gioca un ruolo critico e può essere ottmizzata in modo da ottenere la massima efficienza di appaiamento allo stampo corretto e quindi il minimo legame ad altre sequenze. Questa fase è dunque temperatura dipendente, in quanto la formazione di amplificati aspecifici è riconducibile a temperature di annealing (Ta) basse tali da consentire l’ibridazione anche con regioni del DNA non perfettamente complementari (mismatch). Di contro, Ta elevate porteranno alla non ibridazione del primer con nessuna sequenza in quanto tale temperatura è tale da mantenere la coppia primer-target in uno stato di melting, determinando di fatto una non amplificazione. La temperatura di annealing più idonea dipenderà quindi dalla sequenza scelta per

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l’appaiamento e dalla lunghezza del primer stesso, in quanto più residui GC saranno presenti nella sequenza del primer maggiore sarà la forza del suo appaiamento e, di conseguenza, più elevata sarà la Ta da applicare. Per tali motivi, le Ta delle coppie di primer devono essere più simili possibili tra loro (±2°C) e complessivamente dai 3-5°C in meno rispetto alle loro temperature di melting (Tm). Solo in tali casi il complesso primer- DNA target si legherà stabilmente e formerà i legami idrogeno fornendo quindi un 3’-OH libero alla DNA polimerasi per catalizzare la successiva reazione di allungamento. In tale fase enzimatica, l’attività catalitica dell’oloenzima, ottimale intorno ai 72°C e dunque termostabile, sintetizza un nuovo filamento complementare di DNA aggiungendo nucleotidi trifosfati all’estremità 3’ dell’ibrido primer-DNA target (innesco). Il tempo di estensione dipenderà dalla grandezza del frammento da amplificare, il quale dipende dalla velocità di incorporazione nucleotidica della polimerasi, mediamente a temperatura ottimale, di circa 1000 nucleotidi per minuto. A questo punto la temperaturà verrà ancora una volta innalzata per iniziare un nuovo ciclo di PCR. Dal primo ciclo si otterrano due molecole di DNA a doppio filamento per ciascuna molecola originaria e, in assenza di condizioni limitanti quali substrati e reagenti, in ciascun ciclo la quantità di DNA verrà raddoppiata, amplificando di fatto in maniera esponenziale il target scelto. Possiamo quindi considerare la PCR composta da tre distinte fasi, le quali caratterizzano la sua cinetica di amplificazione (Figura 7).

-Fase E (Early): Questa fase rappresenta lo step iniziale in cui i primers iniziano a scansionare il templato di DNA alla ricerca della sequenza complementare sulla quale ibridare. Tale fase non risulta di particolare difficoltà dato l’eccesso di oligo aggiunti alla reazione e date le condizioni ottimali alle quali operano gli stessi, nonché la

concentrazione di Mg2+ e la temperatura. Si forma dunque in questa fase un complesso

binario stabile per la successiva interazione con la DNA polimerasi, la quale mostra attività catalitica anche a temperature inferiori rispetto a quella ottimale di estensione (72°C). L’allungamento della catena, infatti, a temperature non ottimali stabilizza ulteriormente il duplex il quale non dissocierà al raggiungimento dei 72°C in quanto, di pari passo con l’estensione, aumenterà la Tm del duplex stesso.

-Fase M (Mid): In questa fase il processo di amplificazione inizia e procede a gran ritmo, idealmente raddoppiando il numero di copie della sequenza target selezionata nella fase

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di annealing. Durante questo step si assiste ad un accumulo esponenziale del prodotto in quanto, man mano che la fase di amplificazione procede, il numero di copie di target aumenterà e dunque più semplice sarà rintracciare le sequenze complementari nella miscela da parte dei primers. Sarebbe importante concludere la reazione di PCR durante tale fase e appena prima l’inizio della fase successiva.

-Fase L (late): In tale fase, detta anche di plateau, l’amplificazione diminuisce progressivamente come conseguenza della riduzione dei reagenti disponibili alla reazione. In particolare, questo è dovuto all’esaurimento dei reagenti o alla inibizione della stessa reazione dai prodotti originati i quali tendono a reibridarsi (reannealing) essendo ridotta la quantità di primers disponibili e, poichè gli ampliconi sono di gran lunga maggiori della lunghezza degli oligo, il reanniling dei prodotti inizia già a temperature più elevate per effetto dell’aumento della Tm, sequenstrando di fatto il templato per le successive reazioni e rendendo inconcludente il processo.

Figura 7. Cinetica di accumulo dell’amplicone in una reazione di PCR. E: Fase precoce; M: Fase esponenziale; L: Fase tardiva o plateau. (McPherson M.J. & Moller S.G., PCR-Second Edition, 2006).

In una reazione di PCR, inoltre, la relazione tra la quantità di DNA bersaglio iniziale (A) e la quantità di prodotto amplificato ottenuto dopo n cicli (Yn) in condizioni ideali, è

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dove E rappresenta l’efficienza della reazione in ciascun ciclo di PCR. Come già detto, è chiaro che l’efficienza di amplificazione non dipenderà solamente dal numero di molecole di DNA bersaglio presenti inizialmente nella reazione, ma anche da una serie di altre variabili, condizioni per le quali si raggiungerà uno stadio di plateau.