PCR-RFLP

Nel campione N.49 è stata rilevata la presenza di DNA appartenente al genotipo II( perché presente in 4/7 marker genotipizzati) o misto II/III questo dubbio perché non sono stati ottenuti dei risultati da tutti i marker nel campione, inoltre il marker 5’SAG2 non distingue i genotipi I e II. Nel campione N.46 è stata rilevata la presenza di DNA appartenente prevalentemente al genotipo III(6/6 marker genotipizzati) anche se il marker 3’SAG2 all’elettroforesi mostra bande molto simili, poco distinguibili, per i genotipi I e III. Per quanto riguarda il cavallo N.17 è stato riscontrato il genotipo I su 8/8 marker genotipizzati anche se, i marker 3’SAG2 e 5’SAG2 non permettono una chiara distinzione all’elettroforesi dei tipi I e III e di I e II rispettivamente. L’unico altro studio che ha effettuato questo tipo di genotipizzazione nel cavallo è stato quello di Evers et al.,2013 il quale ha identificato nei cavalli solo il genotipo I, il quale risulta essere molto presente negli animali in sud America, mentre risultano eccezionale il ritrovamento del genotipo II che invece è molto comune in Europa. Sempre la stessa autrice afferma che diversi studi condotti recentemente in Brasile hanno riscontrato il genotipo II negli ovini e nei bovini. Quindi i risultati di questo studio concordano sul fatto che sono stati riscontrati genotipi che comunemente sono riscontrati in Europa però il risultato del campione N49 discorda rispetto a molti studi i quali affermano che il genotipo I non è molto presente negli animali in Europa (Maksimov et al.,2013). Però, c’è da sottolineare che fino a poco tempo fa l’ identificazione era effettuata con solo 4 marcatori (SAG2, SAG3, BTUBE e GRA6 )o micro satelliti, e per lo più questi erano biallelici cioè che non riuscivano a distinguere tutti e tre i tipi clonali (Su et al 2006; Su et al 2009). Gli studi condotti fino ad oggi, sono stati importanti per capire l’epidemiologia, la genetica di popolazione e la filogenesi di T.gondii. Toxoplasma gondii si è sempre creduto essere strutturato in sottopopolazioni a seconda della localizzazione geografica che, sembra essere di tipo clonale in America del nord e in Europa dove i tre linee predominanti cono chiamate tipo I, II e III.(Su et al.,2009). La diversità genetiche di questi 3 genotipi è stimata essere minore

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dell’1% nonostante questo, i saggi biologici in vivo hanno sorprendentemente rilevato che la letalità verso i topi da esperimento era diversa. Infatti il genotipo I causava una letalità pari al 100%, in contrasto con la virulenza dei tipi II e III che era significativamente inferiore. (Su et al 2006). E’ di grande interesse indagare se i genotipi siano legati anche alle manifestazioni cliniche nell’uomo perché, il tipo II è quello che causa più frequentemente la toxoplasmosi nell’uomo, il tipo I è stato associato alla retino coroidite e i genotipi atipici sono stati associati a toxoplasmosi disseminata in pazienti immunocompetenti (Su et al.,2009). Lo sviluppo di metodi facili, sensibili e rapidi per il rilevamento e l’identificazione di Toxoplasma gondii è importante per gli studi diagnostici ed epidemiologici di questa zoonosi. Gli studi condotti fino ad oggi, sono stati importanti per capire l’epidemiologia, la genetica di popolazione e la filogenesi di T.gondii. I metodi molecolari ad elevata risoluzione, come questo, sono utili ai fini epidemiologici perché ci permettono di tracciare le fonti di contaminazione per gli ospiti intermedi. La genotipizzazione è stata possibile per i campioni a cui corrispondevano dei sieri con titoli più elevati di 1:20 ovvero di 1 a 1:40 e di 2 a 1:80. Inoltre l’identificazione è stata sempre possibile per il tessuto cardiaco, questo potrebbe confermare che in effetti in questo organo è più possibile che si possano formare cisti è che quindi nell’ottica di un monitoraggio potrebbe essere l’organo più importante da ispezionare. Non è stato possibile amplificare tutti i marker forse perché la quantità di DNA era poca. Non è stata effettuata l’amplificazione di alt SAG2 (SAG2new) perché può essere un’alternativa a 5’SAG2 in quanto, non sarebbe necessario amplificare il frammento di DNA per 5’SAG2 perché questo è coperto dai primer esterni di alt SAG2 (Su et al.,2009) quindi anche viceversa.

CAPITOLO 9 CONCLUSIONI

Poiché in questo studio è stato utilizzato un cut-off basso(1:20) rispetto ad un cut-off di 1:64 utilizzato nello studio di Evers et al.,2013 utilizzando IFAT il quale ha evidenziato una siero prevalenza simile (11%) a quella di questo studio, del test IFAT nel cavallo e visto quanto detto in precedenza, forse i veri positivi di questo studio potrebbero anche essere di meno. In questo studio non è stato messo in evidenza il maggiore rischio che i consumatori corrono di contrarre un infezione da Toxoplasma gondii consumando carne di cavallo perché, la maggior parte della carne che viene consumata in Italia, proviene da altri paesi della comunità europea e dal sud America. Dai paesi della comunità Europea, la carne equina, ci arriva o come carne congelata, della quale forse possiamo essere più sicuri perché eventuali cisti tissutali sarebbero inattivate con le basse temperature, o come animali vivi e poi macellati in Italia. Per

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quanto riguarda questo aspetto il rischio che corrono i consumatori è sconosciuto perché, non ci sono (o non ho trovato) dati sulla siero prevalenza degli equini di questi paesi ( Polonia, Romania, Bulgaria) né sottoforma di articoli scientifici né come dati forniti dall’ EFSA . Invece può destare molta più preoccupazione la carne equina proveniente dal sud America (Brasile e Argentina), non tanto per la quantità importata in Italia che è piuttosto bassa ma, perché sono presenti genotipi diversi (BrI) o atipici, vista l’elevata biodiversità che è presente in quel territorio, da quelli che sono presenti in Europa. Per i genotipi presenti in Europa è presente una certa immunità nella popolazione ma , potrebbe non essere efficace per questi genotipi (Rubistain et al.,2009). Di recente alla cronaca sono emersi episodi ,di cui uno mortale, associati alla presenza di un genotipo atipico presente in questo tipo di carne importata (Pomares et al., 2011). Per questi motivi penso che dovrebbero essere fatti studi di siero prevalenza nei cavalli in macelli dove arrivano questo tipo di animali ma, soprattutto in macelli che macellano numeri elevati di questa specie in modo da ottenere dei numeri significativi da campionare. Ad esempio nel 2010(dato più aggiornato ISTAT) sono stati macellati 67.000 equini in Italia di cui, 31.144 in Puglia, 12.382 in Veneto, 5935 in Emilia Romagna seguiti da Piemonte e Lombardia, in Liguria 501 capi e in Toscana 225 (www.agriistat.it ). Nei macelli dove ho raccolto i campioni, erano macellati da 1 a 5 cavalli in media tre, solo una volta a settimana. Dovrebbe essere anche stabilito quale sia il test più sensibile e specifico e cut-off per la toxoplasmosi nel cavallo tenendo di conto che determinati test come IFAT, IHA ed ELISA si prestano bene per essere utilizzati anche nei macelli (Fioretti, 2004) anche nell’ottica di un piano di monitoraggio, perché sono di più facile esecuzione, non troppo costosi e non prevedono l’utilizzo di antigeni vivi come avviene in MAT o nel SFDT. Qual’ora questi test non rappresentassero il gold standard per la diagnosi di toxoplasmosi nel cavallo, potrebbero essere comunque utilizzati come test di screening iniziali a seguito dei quali potrebbe seguire un test più specifico ,come l’immunoblot. Per quanto riguarda la messa in evidenza delle cisti tissutali questo rimane un problema di non facile risoluzione perché i metodi più affidabili per ispezionare il cibo per Toxoplasma gondii e dimostrare la presenza di cisti tissutali contenenti i bradizoiti vivi responsabili dell’infezione nell’uomo, sono rappresentati dai saggi biologici in vivo o tramite esame immunoistochimico di sezioni di tessuto provenienti però da organi molto grandi nella specie equina. Questi test sono costosi e richiedono tempo quindi non sono adatti per il macello o per il monitoraggio dei prodotti a base di carne (Jauregui et al.,2001). I saggi condotti con la q-PCR invece, rilevano il DNA di Toxoplasma gondii ma, non la forma vitale di provenienza (bradizoiti, tachizoiti) e non ci danno informazioni sulla vitalità degli organismi. Monitoraggio statale

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perché, sebbene dove sia stata io sono stati molto gentili anche perché ho preso solo un pezzettino, gli allevatori non credo siano ben disposti a fornire per la ricerca, campioni significativi di organi che per loro sono fonte di guadagno.

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Variazione consistenza del bestiame equino per categoria Anno2004: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2004&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2005: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2005&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2006: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2006&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2007: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2007&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2008: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2008&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2009: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2009&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2010: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2010&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2011: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2011&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2012: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2012&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anno2013: http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plB040000010000013000&an=2013&ig= 1&ct=204&id=8A|9A Anagrafe equidi Dati per regione DPA:

58 http://www.anagrafeequidi.it/index.php?id=280 Dati per regione equidi non DPA:

http://www.anagrafeequidi.it/index.php?id=281 Dati per regione totali :

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Macellazione di equini, per tipo di mattatoio. Dettaglio per regione - Anno 2010

http://agri.istat.it/sag_is_pdwout/jsp/dawinci.jsp?q=plA140000010000012000&an=2010&ig= 1&ct=302&id=8A|10A|51A

Frode in commercio carne equina

Risultati dei controlli:

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Raccomandazione UE 2013/99/UE:

http://www.salute.gov.it/relazioneAnnuale2013/paginaAttivitaRA2013.jsp?sezione=cap itolo1&capitolo=alimenti1&paragrafo=importazioni1&id=1889

ciclo vitale di toxoplasma gondii J.P.Dubey:

59 Ringraziamenti

Desidero esprimere i miei ringraziamenti alla Prof.ssa Mancianti Francesca, al Dott.Papini Roberto, alla Prof.ssa Perrucci Stefania, alla Dott.ssa Mugnaini Linda e al Dott.Rocchigiani Guido per la pazienza, la puntualità e la qualità con cui nel tempo hanno seguito il mio percorso.

Ringrazio il Dott. Borrini Gianfranco, i proprietari e il personale dei macelli, per l’aiuto e la disponibilità che hanno dimostrato.