1 RIASSUNTO
Parole chiave : toxoplasmosi, cavallo, zoonosi, PCR-RFLP, IFAT.
La toxoplasmosi di origine alimentare nell’uomo può derivare dall’esposizione ai diversi stadi di Toxoplasma gondii e ad oggi, viene pensato che il consumo di carne cruda o poco cotta ,contenente bradizoiti, sia una delle principali fonti di infezione. Poiché la carne di cavallo viene consumata in Europa ma prevalentemente in Italia ,è stato effettuato un test sierologico (IFAT) in questa specie con lo scopo di valutare la sieroprevalenza. Inoltre è stata effettuato un test di diagnostica molecolare (PCR-RFLP) su tessuti provenienti da equini macellati con lo scopo di verificare quali genotipi fossero presenti. Al test sierologico, con cut-off di 1:20, sono risultati positivi 43/321(13%) cavalli e la genotipizzazione è stata possibile per 3/51(6%) campioni di tessuto, identificando i genotipi I,II e III. La carne di cavallo potrebbe essere un rischio per le persone.
ABSTRACT
Key-words : toxoplasmosis , horse, zoonoses , PCR-RFLP, IFAT.
Food-borne toxoplasmosis in humans may result from exposure to different stages of Toxoplasma gondii, in particular from the ingestion of tissue cysts contained in meat. Since horse meat is consumed in Europe but especially in Italy, was carried out a serologic test to evaluate the seroprevalence. In addition was also carried out a molecular diagnostic tests (PCR-RFLP)on tissues from slaughtered horses, with the aim to verify which genotypes were present. Result from IFAT, cut-off 1:20, 43/321 (13%) horses positive and genotyping was possible for 3/51( 6%) of the tissue samples, identifying genotypes I, II and III. Horse meat could be a risk to people.
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CAPITOLO 1 TOXOPLASMOSI
1.1 Definizione e Importanza
La toxoplasmosi è una zoonosi a distribuzione mondiale (Bougattas et al.,2011), e in quanto tale, ha importanza sia per la medicina umana sia per la medicina veterinaria (Guclu et al.,2007; Al Anazia e Alyousif 2010; Dubey 2008). Nell’ uomo, viene stimato che circa 1/3 della popolazione mondiale sia affetta da questa parassitosi (Rinaldi 2008; Tenter et al.,2000). Sono identificate due forme: la forma acquisita e la forma congenita. La toxoplasmosi congenita può determinare aborto e può determinare nei neonati corioretinite, calcificazioni cerebrali, idrocefalo. Questa è la descrizione della tetrade classica dei sintomi della toxoplasmosi congenita (Tenter et al.,2000) che può comportare ritardo mentale, epilessia e ridotta capacità visiva (www.epicentro.iss.it). Non tutte le forme congenite si presentano così perché la gravità dei sintomi dipende dal momento in cui viene acquisita l’infezione durante la gestazione e dalla stato immunitario della madre. La toxoplasmosi acquisita può avere diversi quadri clinici e questi dipendono essenzialmente dal corretto funzionamento del sistema immunitario ovvero, dipendono dall’essere individui immunocompetenti o non immunocompetenti. Soggetti non immunocompetenti come bambini, pazienti con AIDS, pazienti che hanno subito un trapianto, pazienti trattati con farmaci immunosoppressori (Tenter et al.,2000) o con patologie del sistema immunitario come la tiroidite di Hascimoto (Elbez-Rubinstein et al., 2008) possono sviluppare encefalite, shock da sepsi, miocardite ed epatite. La maggior parte delle infezioni nell’uomo però viene messa in evidenza da sintomi lievi quali la linfadenopatia che è la manifestazione clinica più significativa (Tenter et al.,2000), accompagnata da stanchezza, mal di testa, mal di gola, senso di ossa “rotte”, febbre e interessamento di fegato e milza (www.epicentro.iss.it). La toxoplasmosi è una delle cause più comuni di uveite posteriore nei pazienti immunocompetenti (Jones et al.,2000), questa può determinare una corioretinite che può portare alle cecità nel 25% dei casi (Kijistra et al.,2008). La toxoplasmosi è stata messa in correlazione anche in pazienti affetti da schizofrenia e se ciò fosse confermato renderebbe l’impatto sociale ed economico della toxoplasmosi più elevato di quanto stimato in genere (Kijistra et al.,2008). Infatti questa malattia ha un grande impatto negativo sulla società perché aumenta i costi per le terapie nei pazienti con AIDS, per lo screening sierologico delle donne in gravidanza, per la cura dei pazienti e per la perdita produttività (Jauregui et al.,2001). Inoltre la toxoplasmosi è causa di elevate perdite economiche in diverse tipologie di allevamento (Raeghi et al.,2011). Per
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quanto riguarda l’allevamento suino la maggior parte delle infezioni decorre in modo sub clinico e latente, sono comunque riportati casi di mortalità. Invece per quanto riguarda i piccoli ruminati la toxoplasmosi è una delle maggiori cause di insuccesso riproduttivo in molti paesi del mondo essendo causa di riassorbimento embrionale, aborto, mummificazione fetale e morti natalità (Rinaldi e Scala 2008). A causa di questo grande impatto che la toxoplasmosi ha sulla qualità di vita umana più autorità, compresa l’ Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), hanno consigliato strategie per la sorveglianza ed il controllo nell’uomo (Tenter et al.,2000; Rinaldi e Scala, 2008).
1.2 Monitoraggio per la toxoplasmosi in Europa
L’ Unione Europea per poter effettuare un monitoraggio e per raccogliere i dati riguardanti le zoonosi ha emanato una direttiva sulle zoonosi (Zoonoses Directive 2003/99/EC ) che obbliga gli stati membri a raccogliere dati sulle zoonosi, agenti zoonosici, antibiotico resistenza e malattie a trasmissione alimentare (Report EFSA 2009).In Europa sono operative due agenzie che collaborano tra di loro per esaminare i dati sulle zoonosi, le epidemie di origine alimentare e per la resistenza microbica, l’ Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) e il Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC). L’ Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA), con sede a Parma in Italia, è stata istituita e finanziata dalla Unione europea (UE) come agenzia indipendente dal Regolamento CE n 178/20024 del 28 gennaio del 2002 a seguito di una serie di scandali alimentari che hanno causato preoccupazione nell’opinione pubblica circa la sicurezza alimentare e la capacità delle autorità di regolamentazione nel proteggere i consumatori (Report EFSA 2009). L’EFSA fornisce consulenza scientifica su tutte le questioni che hanno un impatto diretto o indiretto sulla sicurezza dei prodotti alimentari e dei mangimi, sulla salute e il benessere degli animali e sulla protezione delle piante. Il lavoro dell’EFSA si divide in due aree: la valutazione del rischio e la comunicazione del rischio. In particolare, le valutazioni del rischio dell’EFSA forniscono ai gestori del rischio, vale a dire la Commissione europea, il Parlamento europeo e il Consiglio, una solida base scientifica per poter intraprendere misure legislative o regolamentari necessarie a garantire un elevato livello di protezione per il consumatore. Il Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC), è un’agenzia con sede a Stoccolma, Svezia, ed è stata istituita del Regolamento CE n 851/20045 del 21 aprile del 2004. Il compito dell’ ECDC è quello di identificare, valutare e comunicarle minacce per la salute umana rappresentate dalle malattie infettive ( EFSA 2009). Sono queste
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due agenzie che nel Report del 2007 inseriscono la toxoplasmosi tra le malattie a trasmissione alimentare. Per quanto riguarda la Toxoplasmosi in questi report vengono segnalati:
a) i dati riguardanti gli animali quali: 1) la siero prevalenza della toxoplasmosi, nei diversi stati membri, nelle specie animali destinate al consumo umano come, specie selvatiche, specie allevate (ovini, caprini , bovini, suini), e non, come il cane e il gatto. Soprattutto quest’ultimo, anche se non viene utilizzato per il consumo umano è importantissimo ai fini epidemiologici per l’acquisizione di questa parassitosi negli ospiti intermedi. 2) vengono date indicazioni per gli stati membri su quali siano le specie importanti ai fini epidemiologici da campionare (ovini suini e caprini), su quali siano i test sierologici più adatti da utilizzare e delle linee guida su come e cosa riportare nei report che saranno successivamente inviati i all’ EFSA (quale tipo di campione viene preso ovvero se è del sangue o del materiale abortivo, dare la definizione di caso ovvero la definizione di un animale con un risultato positivo per questa parassitosi, di descrivere il sistema di monitoraggio, il test utilizzato, e se sono attuate campagne di vaccinazione nei gatti).
b) i dati riguardanti l’uomo: 1) sulla siero prevalenza della toxoplasmosi acquisita nei diversi stati membri. 2) sulla siero prevalenza della forma congenita che, è stata ridefinita nel corso del tempo tramite la Decisione 2008/426/EC45 (relativa alle definizione dei casi, ai fini della dichiarazione delle malattie trasmissibili alla rete di sorveglianza comunitaria) la quale chiede agli stati membri di riportare solo i casi di toxoplasmosi congenita in cui è stato dimostrato il passaggio madre-figlio ( Report EFSA 2011, 2012 e 2014).
Nelle specie animali destinate al consumo umano le siero prevalenze più elevate spettano sempre, nei diversi stati, agli ovi-caprini. Questo potrebbe essere dovuto anche al fatto che, visto che è una specie in cui e frequente l’aborto, è più controllata. Sono state riscontrate siero prevalenze molto elevate anche nei cinghiali in Italia e in Polonia inoltre, sono stati riscontrati campioni positivi anche nelle lepri, nei topi, nelle nutrie, nelle volpi, nei piccioni, nei bufali d’acqua , nei cervi e ciò indica di come sia ampia la diffusione del parassita tra le diverse specie animali e nella fauna selvatica. Per quanto riguarda la Toxoplasmosi nell’uomo, l’EFSA afferma che c’é un’apparente diminuzione della forma congenita (la forma acquisita non viene più riportata nei report più recenti) però, visto che la sorveglianza o lo screening di routine per diagnosticare questa malattia in alcuni paesi viene effettuata e in altri no, ciò
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potrebbe non far riflettere la reale incidenza della malattia che comunque si attesta a 0,56 casi ogni 100.000 persone ( report 2012).
1.3 Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii appartiene al phylum Apicomplexa (Levine, 1970), classe Sporozoasidae (Leukart, 1879), subclasse Cocccidiasina (Leukart, 1879), ordine Eimeriorina (Leger, 1911), famiglia Toxoplasmatidae (Biocca, 1956). Questo protozoo ha un ciclo biologico indiretto, gli ospiti definitivi sono i gatti ad altri felidi selvatici. Questi felidi possono infettarsi ingerendo oocisti mature o tramite ingestione di tessuti/ organi di ospiti intermedi con cisti contenenti i bradizoiti. Nell’intestino del gatto, a seguito di diverse fasi di moltiplicazione asessuata (fase schizogonia), segue una seconda fase (sessuata), da parte di merozoiti che si sono evoluti in macrogameti e micro gameti, che si conclude con la formazione di oocisti che saranno eliminate, ancora immature, nell’ ambiente con le feci (Cringoli, 2011). Toxoplasma gondii è in grado di infettare qualsiasi tipo di cellula all’interno di una gamma eccezionalmente ampia di ospiti intermedi compresi gli esseri umani,gli animali da compagnia, la fauna selvatica e gli uccelli (Webster, 2010). Nell’ospite intermedio Toxoplasma gondii subisce due fasi di moltiplicazione asessuata. Nella prima fase i tachizoiti si moltiplicano rapidamente per endoduogenia in molti tipi diversi di cellule. I tachizoiti di ultima generazione avviano la seconda fase di sviluppo che si traduce nella formazione di cisti tissutali. All'interno delle cisti tissutali, i bradizoiti si moltiplicano lentamente per endoduogenia. Le cisti tissutali si formano prevalentemente nel sistema nervoso centrale, nell'occhio, nei muscoli scheletrici e nel cuore. Tuttavia, in minore misura possono anche essere trovati a livello dei visceri, quali polmoni, fegato e reni (Dubey et al. 1998). Ci sono tre fasi infettive ovvero: i tachizoiti, i bradizoiti (contenuti in cisti tissutali) e gli sporozoiti (contenutei nelle oocisti ) che sono infettivi per entrambi gli ospiti intermedi e definitivi. Il parassita può essere trasmesso da un ospite definitivo ad un ospite intermedio, e viceversa, nonché tra i vari ospiti definitivi, o tra diversi ospiti intermedi. Non è attualmente noto quale sia la via di trasmissione più importante dal punto di vista epidemiologico. Tuttavia, il suo ciclo di vita può continuare indefinitamente con la trasmissione di cisti tissutali tra ospiti intermedi e anche tramite la trasmissione di oocisti tra ospiti definitivi (Tenter 2000).
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CAPITOLO 2 COME SI INFETTA L’UOMO
La toxoplasmosi di origine alimentare nell’uomo può derivare dall’esposizione ai diversi stadi di Toxoplasma gondii (Tenter, 2009).
2.1 Tachizoiti
I tachizoiti svolgono un ruolo fondamentale nella trasmissione verticale (quella transplacentare) ma, per quanto riguarda la trasmissione orizzontale sono molto sensibili alle diverse condizioni ambientali e sono rapidamente uccisi al di fuori dell’ospite. Pertanto si ritiene che questa modalità di trasmissione non sia molto importante dal punto di vista epidemiologico (Tenter, 2000). I tachizoiti sono stati rilevati in diversi fluidi corporei tra cui la saliva, l’ espettorato, l’urina, le lacrime, lo sperma ed il latte di diversi ospiti intermedi tra cui ovini, caprini, bovini e cammelli, mentre uno studio ha riportato che i tachizoiti possono essere isolati anche da uova di gallina in cui è stata indotta sperimentalmente l’ infezione. I tachizoiti sono sensibili agli enzimi proteolitici e di solito sono distrutti dalla digestione gastrica tuttavia i neonati potrebbero essere più suscettibili alla toxoplasmosi rispetto agli adulti perché hanno una minore concentrazione di enzimi proteolitici nel loro tratto gastrointestinale. Inoltre i tachizoiti possono occasionalmente sopravvivere per un breve periodo di tempo (fino a 2 ore) in soluzioni acide contenenti anche pepsina. Nell’uomo adulto i pasti solidi possono aumentare il pH dello stomaco fino a 5 per diverse ore, in questo modo i tachizoiti possono arrivare integri a livello dell’ intestino tenue. Inoltre questi particolari stadi parassitari sono capaci di attraversare le mucose integre. Fino ad ora la toxoplasmosi clinica nell’uomo è stata associata solo con il consumo di latte crudo di capra, in particolare se consumato crudo (Tenter, 2009). Tuttavia un recente studio ha messo in evidenza di come il parassita possa essere presente nel latte di altre specie animali quali bovini, ovini, bufali e cammelli oltre ai già citati caprini che comunque, anche in questo studio risultano avere la sieroprevalenza più elevata (Dehkordi et al 2013). Per tanto, per i motivi sopra esposti non si può escludere che almeno qualche infezione post natale sia causata dall’ ingestione di tachizoiti (Tenter, 2009) .
2.2 Oocisti
L’ingestione di acqua o cibo (frutta, verdura e molluschi lamellibranchi) contaminato rappresentano un importante via di trasmissione di Toxoplasma gondii all’uomo (Boughattas et al 2011; Dubey et al.,1999). Il significato in termini di salute pubblica delle oocisti nella trasmissione di Toxoplasma gondii è evidenziato ad esempio dall’elevata sieropositività in
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alcune popolazioni di vegetariani (Tenter, 2009). Nel 1999 furono diagnosticati 100 casi di toxoplasmosi acuta associata al consumo di acqua contaminata con oocistii (Tenter et al., 2000) inoltre, l’ingestione di acqua contaminata da oocisti e mangiare vegetali crudi o frutta non lavata è stato identificato come un fattore di rischio importante, per l’acquisizione della toxoplasmosi nell’uomo, in numerosi studi epidemiologici (Pereira et al., 2010) .
2.3 Cisti tissutali
Molti autori sono concordi nell’affermare che la carne è una delle principali fonti di infezione nell’uomo (EFSA, 2014; Kijistra e Jongert, 2008; Tenter, 2009; Bougattas et al.,2011).Tutti i mammiferi e gli uccelli che vengono consumati dagli esseri umani possono servire come ospiti intermedi per Toxoplasma gondii e quindi, possono essere una potenziale fonte di infezione per l'uomo (Tenter.,2012). Le cisti tissutali possono essere fonte di infezione per l’ uomo attraverso due meccanismi. Il primo riguarda il consumo di carne, prodotti a base di carne o frattaglie contenenti cisti tissutali, il secondo invece riguarda certe categorie professionali come macellai, lavoratori dei macelli e cacciatori che, possono infettarsi durante l’ eviscerazione e la manipolazione della carne. A differenza dei tachizoiti, i bradizoiti contenuti nelle le cisti tissutali sono relativamente resistenti alle differenti condizioni ambientali. Queste rimangono contagiose all’ interno delle carcasse e della carne fino a tre settimane a basse temperature che variano da 1 a 4°C e questo periodo di tempo, é ben più lungo del tempo in cui la carne rimane idonea al consumo umano (come carne fresca). Sebbene la maggior parte delle cisti tissutali vengano uccise a temperature di -12°C talvolta qualche cisti può sopravvivere ed è stato anche suggerito che alcuni ceppi di T.gondii possono essere resistenti al congelamento (Tenter, 2009). Il tempo di sopravvivenza delle cisti tissutali dipende anche dalla concentrazione salina (questo per i prodotti a base di carne) ad esempio in condizioni di laboratorio vengono uccise da soluzioni di NaCl al 6% ma, sopravvivono per diverse settimane in soluzioni acquose a bassa concentrazione di sale. Le cisti tissutali inoltre sono anche resistenti a diverse temperature però vengono distrutte se questa arriva o supera i 67°C (Tenter 2009). Da questo, l’estrema importanza di cuocere bene la carne.
Sono da considerare come fattori di rischio associabili alla carne, i tassi di sieroprevalenza e la presenza di cisti tissutali riscontrati nei diversi animali destinati per il consumo umano. Gli indici di siero prevalenza indicano che un’ animale è stato esposto al parassita e che quindi, essendo ospite intermedio, ci sia la possibilità che si siano formate le cisti tissutali (Garcia-Bocanegra et al 2012). Per quanto riguarda la formazione delle cisti tissutali queste, a causa dell’organotropismo variabile del parassita nelle diverse specie ospite, variano notevolmente
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di numero e di sede di localizzazione tra le diverse specie animali destinate al consumo umano, soprattutto per quanto riguarda la muscolatura scheletrica (Tenter, 2009). Gli indici di siero prevalenza sono molto variabilità tra le diverse specie animali (Bocanegra, 2012) e sono molto diverse anche tra i diversi Paesi. Ad esempio in uno studio è stato rilevato che gli ovini erano 15 volte in più sieropositivi rispetto ai bovini e 2 volte in più rispetto ai cavalli e che i cavalli lo erano 7 volte in più rispetto a bovini (Raeghi et al., 2011). Uno studio in Spagna ha rilevato una differenza statisticamente significativa tra asino e cavallo; l’asino risultava avere una prevalenza maggiore (P=0,001 ). Kijistra e Jongert, (2008), hanno passato in rassegna sotto questi due aspetti le principali specie animali destinate al consumo umano affermando che i piccoli ruminanti, a seguito di elevate siero prevalenze (fino al 77% in America) presentano anche un numero considerevole di cisti. Numerosi studi caso controllo hanno trovato altamente significativo il rischio di toxoplasmosi umana legata al consumo di questa carne (Cencigoga et al.,2013). Sono stati descritti casi di toxoplasmosi dovuti al consumo di carne suina ma, nel corso degli anni, per le più moderne tecnologie di allevamento la prevalenza in questa specie è diminuita tanto. Nel bovino a dispetto di elevate sieroprevalenze riscontrate, nessuno studio è stato in grado di isolare il parassita da bovini naturalmente infetti. Kijistra e Jongert (2008) affermano che nel cavallo invece le prevalenze possono essere elevate e che la presenza di cisti è stata riscontrata nei tessuti edibili; nel pollo invece sono state riscontrate sieroprevalenze elevate ma di solito, questo tipo di carne è cotta molto bene quindi non rappresenta un rischio per il consumatore. Studi che hanno utilizzato il biotest su topi hanno evidenziato che la carne bovina e quella di pollo raramente contenevano cisti (Cook at al.,2000). Un'altra causa ,oltre alla siero prevalenza degli animali e il numero di cisti che possono formarsi nei tessuti, che alla fine fa le differenza, in quanto più o meno tutti i tipi di carne possono potenzialmente contenere cisti tissutali, è il consumo di carne cruda o poco cotta (Tenter et al., 2009; Kijistra e Jongert 2008). Ogni paese ha le sue preferenze per quanto riguarda il consumo di carne cruda ad esempio uno studio norvegese ha evidenziato come fattori di rischio il consumo di carne di agnello e suino ma non il manzo, mentre in Francia la carne incriminata apparteneva all’ agnello ma, non al suino (CooK at al., 2000). Sono stati segnalati anche casi di toxoplasmosi in Australia dovuti al consumo di carne di canguro (Kijistra e Jongert, 2008). Pertanto dal punto di vista epidemiologico, dall’intersecarsi di questi fattori (valori di siero prevalenza in una determinata specie e in un determinato paese, presenza di cisti che varia a seconda dell’animale e preferenze alimentari del consumatore) le fonti di infezione da Toxoplasma gondii nell’uomo possono variare notevolmente da paese a paese ma, anche tra gruppi etnici e geografici (Tenter et al.,2000).
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CAPITOLO 3 MOTIVI PER I QUALI LA CARNE DI CAVALLO PUO’
RAPPRESENTARE UN RISCHIO IN ITALIA
Così come per diversi autori il consumo di carne equina non rappresenta un rischio per una certa popolazione, poiché questo tipo di carne non viene consumata (Evers et al.,2012; Bartova et al 2010), in Europa e soprattutto in Italia visto che viene consumata, può rappresentare un rischio. In Italia la consistenza del bestiame equino, in data 01 /12 /2013, è stata di 393.915 capi ed è andata aumentando nel corso degli anni come si può osservare anche dal grafico (Agri Istat ).
Tabella. Variazione della consistenza del bestiame equino negli ultimi 10 anni
La distribuzione dei capi non è uguale in tutto il territorio italiano
- Nelle regioni del nord (Piemonte , Lombardia , Liguria , Valle d’ Aosta , Trentino Alto Adige , Veneto , Friuli Venezia Giulia ed Emilia Romagna) sono presenti 159.584 capi di cui la metà sono allevati solo in due regioni , la Lombardia (45.354 capi) e il Veneto (33.568 capi). 200000 250000 300000 350000 400000 450000 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 N° di capi
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-Nelle regioni del centro (Toscana, Umbria, Marche e Lazio) sono presenti 102.653 capi di cui la metà sono allevati nel Lazio (52.370 capi ). Il Lazio è la regione italiana con il maggior numero di equini allevati.
-Nelle regioni del sud (Abruzzo, Molise, Campania, Puglia, Basilicata, Calabria , Sicilia e Sardegna) sono presenti 131.670 di cui circa 2/3 sono allevati in Sicilia (35.125 capi) , Puglia (27.559 capi) e Abruzzo (2.1581 capi).
Figura 2. Distribuzione dei capi equini in Italia aggiornata al 01/12/2013
Gli allevamenti equini sono maggiormente concentrati nel nord Italia. Il primo impiego del cavallo da parte dell’ uomo è stato per scopi alimentari poi, in seguito all’addomesticamento, l’uomo ne ha scoperto e sfruttato anche le doti di potenza muscolare, la velocità e la resistenza alla fatica per i lavori agricoli, i trasporti e le campagne militari (Orlandi, 2009). Con il passare dei secoli e con l’avvento delle nuove tecnologie, l’utilizzo del cavallo si è diversificato diventando così un animale sportivo per eccellenza, utilizzato per diverse iniziative agrituristiche, per l’ippoterapia. Di fatto indipendentemente dal motivo per cui sono allevati più della metà di questi animali sarà destinato alla produzione di alimenti perché secondo l’anagrafe equina su un totale di 397.438 equini, ben 224.394 sono equini DPA (destinati alla produzione di alimenti) secondo il Reg. (CE)N.504/2008 della Commissione europea che si occupa di identificazione degli equidi (www.anagrafeequidi.it ).
40,52 26,05 33,43 Nord Centro Sud
11 Tabella Equini DPA e non DPA presenti in Italia
Regione DPA NON DPA TOTALI equidi
Abruzzo 14.425 3.606 16.624 (18.031) Basilicata 7.868 1.028 9.069 (8.896) Calabria 2.659 4.324 7.921 (6.983) Campania 8.192 11.493 28.028 (19.685) Emilia Romagna 21.672 12.698 3.9861 (3.4370) Friuli V.G. 2.927 2.411 6.478 (5.338) Lazio 26.493 20.384 53.815 (46.877) Liguria 2.624 4.697 7.691 (7.321) Lombardia 19.387 26.227 53.851 (45.614) Marche 6.318 2.657 10.480 (8.975) Molise 3.859 2.657 4.868 (6.516) Piemonte 11.125 18.872 34.378 (29.997) Puglia 18.695 6.650 29.139 (25.345) Sardegna 8.970 7.102 22.357 (16.072) Sicilia 3.0291 9.629 45.478 (39.920) Toscana 9.562 17.341 34.744 (26.903) Trentino 7.737 3.009 11.005 (10.746) Umbria 5.724 6.434 13.703 (12.158) Valle d’Aosta 222 405 649 (627) Veneto 15.644 11.420 31.560 (27.064) Totali 224.394 173.044 (397.438)
I dati tra parentesi sono la somma dei soli equini
Quindi una parte della carne equina presente in Italia proviene da animali allevati nel territorio ma, è solo una minima parte in quanto importiamo elevati quantitativi di carne equina congelata e di capi vivi da paesi della comunità europea e non. Secondo i dati ISTAT siamo forti importatori di equini vivi da destinare al macello e di carne equina.
12 Tabella. Import/Export equini vivi
Import Export N°capi equini vivi/anno Tot. dal
Mondo Di cui Europa Tot. nel Mondo Di cui Europa Anno 2013 32.842 32.316 516 264 Anno 2012 38.849 37.480 4.213 4.027 Anno 2011 46.156 45.217 256 124 Anno 2010 51.653 50.175 955 275 Anno 2009 45.757 43.346 755 468 Anno 2008 53.448 51.154 738 537 Anno 2007 59.476 40.551 765 653
Rielaborazione Tavole CERI-Dati mensili e annuali degli animali vivi e delle carni. Agri Istat
Grafico. Import/export equini vivi
Rielaborazione Tavole CERI-Dati mensili e annuali degli animali vivi e delle carni. Agri Istat 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
equini vivi importati(N°capi) equini vivi esportati(N°capi)
13 Tabella. Import/Export carne equina
Import Export Carne equina ( t )/anno Tot. dal
Mondo Di cui Europa Tot. nel Mondo Di cui Europa Anno 2013 24695 24695 1266 869 Anno 2012 28259 26098 2753 2386 Anno 2011 28960 26863 3001 2816 Anno 2010 28230 25459 2367 2254 Anno 2009 27096 23252 2098 2004 Anno 2008 24850 20572 2179 2100 Anno 2007 25195 18139 1055 999
Rielaborazione Tavole CERI-Dati mensili e annuali degli animali vivi e delle carni. Agri Istat
Grafico. import/export carne equina
Rielaborazione Tavole CERI-Dati mensili e annuali degli animali vivi e delle carni. Agri Istat
L’import di carne equina e di capi vivi è rimasto abbastanza stabile nel corso di questi 7 anni anche se in lieve calo dal 2010. Di pari passo si assiste ad un incremento graduale della consistenza del bestiame equino. Secondo Evers et al.,(2012) i maggiori esportatori di carne
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Carne equina importata(in tonnellate)
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equina al mondo sono l’Argentina (28,7%), il Canada (24,6 ), la Polonia (14,6 %) e il Brasile (10.9 %) .Visto che dalle tabelle si evince che importiamo prevalentemente da paesi della comunità europea, forse la maggior parte dei cavalli che arriva in Italia proviene dalla Polonia, ai fini epidemiologici per il nostro paese, sarebbe importante conoscere la sieroprevalenza a Toxoplasma gondii nei paesi di provenienza di questi cavalli o effettuare studi di siero prevalenza in macelli che macellano più frequentemente questi animali provenienti dal paesi della comunità europea e non. L’Italia è a livello europeo, il maggior consumatore di carne equine; anche se si tratta di una realtà limitata (circa 1 Kg procapite all’anno) che risente fortemente di fattori culturali in quanto molti considerano il cavallo una specie da affezione e non da reddito (Scanziani et al.,2008). Infatti, da un indagine dell’IRVAM(Istituto per le ricerche e la informazioni di mercato e la valorizzazione della produzione agricola) condotta in Lazio,Toscana, Lombardia e Puglia è emerso che il 56% delle famiglie intervistate non ha mai consumato carne equina, principalmente perché non è gradita (69%), perché non è facilmente reperibile (27%); solo l’11% degli intervistati ha dichiarato di farne uso abitualmente, per le proprietà nutrizionali(43%), per le caratteristiche organolettiche (27%) oppure per alternarla alle altre carni (25%) (Orlandi, 2009). Una certa diffusione recente di questo tipo di carne è stata favorita dalla caduta delle limitazioni di vendita in spacci riservati tramite Regio Decreto 19 maggio 1927 N.868 , “grazie” alle legge 526/1999 e anche “grazie” all’ emergenza BSE che ha spinto i consumatori nella ricerca di carne alternative a quella bovina (Scanziani et al.,2008). Inoltre il consumo di questa carne è caratterizzata da una fortissima concentrazione territoriale in quanto le regioni a più elevato consumo sono la Puglia ,il Veneto, Emilia Romagna e la Lombardia (Scanziani et al., 2008). Altre persone potrebbero consumare carne equina inconsapevolmente visto che a seguito della raccomandazione europea 2013/99/UE del 19 febbraio 2013 (www.salute.gov.it) sono stati fatti dei controlli, in Italia, su prodotti etichettati come contenenti carni bovine (es carni macinate, prodotti a base di carne, preparazione di carne) ed è stata riscontrata la presenza di carne equina, non dichiarata in etichetta ( www.salute-gov.it ). Anche il consumo di questi prodotti può rappresentare un rischio per l’ uomo , di acquisire l’ infezione da Toxoplasma gondii, perché la cottura di questi prodotti non permette di cuocere la carne in modo uniforme (Tenter, 2009) anche se, la cottura al microonde è spesso associata al riscaldamento di prodotti già cotti e di solito congelati (Jones et al.,2009) e quindi più sicuri però, dipende dal tipo di prodotto. Spesso la carne di cavallo viene consumata cruda dopo macinatura e condimento e in un recente passato i medici la consigliavano a tutti coloro che soffrivano di anemia sottoforma di tartare ovvero, una grossa polpetta macinata finemente condita con sale
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,erbe aromatiche e servita cruda ( Pomares et al.,2011; Scanziani et al., 2008). La carne cruda è un alimento molto nutriente e spesso viene preferita in quanto mantiene intatto il contenuto di principi nutritivi, soprattutto le vitamine (Scanziani et al.,2008). Anche in altri paesi ,come la Tunisia, viene consigliato il consumo di carne equina cruda addirittura a donne in gravidanza perché, si pensa che faccia bene al feto ( Boughattas et al 2011) e anche in Francia ( Pomares et al 2011). Questa raccomandazione forse viene data perché, anche secondo WHO (World Health Organization) tra le cause più comuni di anemia in gravidanza è la carenza di ferro così come la carenza di vitamina B12 e folati (Doretto e Cappelletti 2010) e la carne equina, tra le specie animali maggiormente commercializzate, è quella che ne contiene di più. Nei supermercati, su qualche confezione viene esaltato proprio questo aspetto a fini commerciali. Inoltre è proprio la grande distribuzione che “spinge “ i consumatori a consumare questo tipo di carne da cruda o quasi in quanto, vengono commercializzati filetti, o fettine sottili da carpaccio che non si prestano affatto per cotture prolungate.Inoltre sono già stati riscontrati casi di toxoplasmosi nell’uomo associati al consumo di carne di cavallo e quindi, anche se sono raramente riportati, sono probabilmente sottostimati (Pomares et al.,2011).
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Capitolo 4 TOXOPLASMOSI NEL CAVALLO
4.1 Epidemiologia
La toxoplasmosi nel cavallo è stata identificata nel 1970 da Willand e Dalcow nel 1970 (Finger et al.,2013). Gli equidi ed altri erbivori, ospiti intermedi di Toxoplasma gondii, possono essere infettati dall’ingestione di cibo o di acqua contaminata da oocisti eliminate da felini (Garcia Bocanegra et al., 2012). Il gatto gioca un ruolo essenziale nell’epidemiologia della toxoplasmosi in tutte le specie, anche perché studi condotti in paesi dove non esiste questa specie hanno dimostrato l’assenza di Toxoplasma gondii (Dubey, 2008). Dopo l’infezione primaria da oocisti o da cisti tissutali un singolo gatto può eliminare nell’ambiente più di 100 milioni di oocisti che, in condizioni favorevoli come: areazione sufficiente, umidità, temperatura calda possono sporulare e diventare infettanti in un giorno. Le oocisti di Toxoplasma gondii sono anche molto resistenti alle condizioni ambientali, sopravvivono per brevi periodi al freddo e alla disidratazione ma, rimangono infette nei terreni umidi, sabbiosi anche fino a 18 mesi (Tenter,2009). Esse sono anche altamente impermeabili e molto resistenti ai comuni disinfettanti. Nell’ambiente le oocisti sono distribuite dal vento, dalla pioggia e dalle acque superficiali e possono diffondersi attraverso i lombrichi, invertebrati coprofagi o tramite il letame. Il fieno la paglia e il grano, contaminati dalle feci di gatto, sono stati identificati come fonte di infezione per il bestiame. Anche la pelliccia dei cani o dei gatti può fungere da vettore meccanico di oocisti (Tenter et al., 2000), inoltre i cani possono disseminare oocisti di Toxoplasma gondii con le feci non perché ospiti definitivi del parassita ma perché possono diffondere le oocisti nelle feci dopo l’ingestione di feci feline (Lappin 2008). Lo studio di Kouam et al.,(2010) confrontando la più bassa sieroprevalenza riscontrata negli ovini (14%) in Grecia , che comunque era più elevata rispetto alla già bassa siero prevalenza riscontrata nei cavalli (1,8%), ha ipotizzato, visto il fatto che questi cavalli erano allevati e non pascolavano liberamente, che la fonte con cui potessero essere stati infettati, potesse essere stata della carne ingerita ( topi morti ) accidentalmente contenente cisti tissutali. Molti studi comunque hanno confermato l’importanza delle oocisti e della loro sopravvivenza nell’ambiente ai fini epidemiologici per il cavallo. Elevate siero prevalenze (28%) come nello studio di Guclu et al., (2007) sono state messe in correlazione con un elevato inquinamento ambientale da oocisti. Lo studio di Boughattas et al.,(2011) ha messo in evidenza questo aspetto infatti in questo studio sono state riscontrate prevalenze più elevate in cavalli provenienti da città costiere della Tunisia caratterizzate da clima più mite che offre le migliori condizioni climatiche per la sopravvivenza delle oocisti inoltre, sono presenti molti
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gatti randagi e l’acqua fornita ai cavalli non è controllata. Sempre in questo studio i cavalli allevati più a nord mostravano prevalenze più basse in quanto erano cavalli di razza e le condizioni igieniche dell’allevamento erano migliori. Anche lo studio di Hajialilo et al., (2010) effettuato su 52 sieri di cavallo in Qazvin in Iran ha riscontrate una siero prevalenza elevata (71,2%) in più di due terzi dei cavalli sportivi, questi cavalli sono stati allevati e cresciuti per le corse di cavalli nella provincia di Qazvin, dove il clima è mite, con inverni relativamente freddi ed estati calde e umide. L’elevata prevalenza di Toxoplasma nella regione sembra essere associata a fattori ambientali quali precipitazione, umidità, e clima caldo e anche alla considerevole presenza di gatti. Molti di questi studi hanno fornito chiarimenti su quella che può essere l’epidemiologia per la toxoplasmosi nel cavallo cercando eventuali correlazioni tra le diverse siero prevalenze e: la diversa età, la razza, il colore del mantello, l’utilizzo, le modalità di allevamento, la zona di allevamento ecc. Uno degli studi più completi sull’epidemiologia sulla Toxoplasmosi nel cavallo è stato effettuato da Garcia Bocanegra et al., (2012) in Spagna, in questo studio sono state esaminate 23 variabili esplicative la quali sono state raggruppate così: a) dati individuali: specie (cavallo, muli e asini), classi di età (giovani: fino a 5 anni, adulto: 5-14 anni, anziano sopra i 14 anni), generi (cavalla, stallone e castrone) e razza ( razza pura e incroci ), b) i dati mandria: posizione (provincia) ,dimensione degli allevamenti, attività (agricoltura, tempo libero e lavoro), presenza di altre specie animali (gatti, cani, uccelli, ruminanti e roditori) e il tipo di alloggio (all’aperto, se era individuale o rifugio collettivo, i metodi di pulizia e disinfezione), c) biosicurezza e protocolli: programmi di controllo dei parassiti (insetti e roditori), fonti d’acqua e risanamento delle acque. Anche altri studi hanno cercato di mettere in evidenza se ci fossero stati eventuali fattori predisponenti/correlazioni, collegabili all’acquisizione di questa parassitosi nel cavallo, come età, genere e razza.
Differenze di età
Nello studio di Boughattas et al.,(2011) condotto su diversi allevamenti in Tunisia viene messo in evidenza che i cavalli con età superiore ai 10 anni presentano siero prevalenze statisticamente significative più elevate rispetto a cavalli con età inferiore questo secondo loro è dovuto ad un maggior contatto con le oocisti. Lo studio di Karetepe et al.,(2010) condotto su 125 cavalli non ha dato origine a differenze significative, sempre con il medesimo taglio di età. Neanche lo studio di Kouam at al.,(2010) condotto su 753 cavalli ha dato luogo a differenze di età però questo può essere dovuto oltre alla notevole dimensione del campione anche per il diverso taglio di età che è stato fatto infatti, i gruppi sono stati 3, da 0 a 3 anni, da
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3 a 6 anni ,maggiori di 6 sei anni e di età sconosciuta . Lo studio di Hajialilo et al (2010) condotto su 52 cavalli in Qazvin in Iran non ha dato luogo a differenze significative con taglio di età di <5 ,5-10 e ≥10 anni. Nello studio di Garcia Bocanegra et al.,(2012) con taglio di età di < 5 anni , tra 5-14 anni , sopra i 14 anni, non ha dato luogo a differenze significative però analizzando le sottocategorie tra loro la sieropositività per Toxoplasma gondii è stata maggiore negli equidi adulti e vecchi ( >5anni) rispetto ai puledri(<5), anche se era solo una tendenza verso la significatività. Neanche lo studio di Raeghi et al., (2011) condotto su pochissimi cavalli (26) ha dato luogo a differenze di età considerando età maggiori o minori di 6 mesi.
Potrebbero anche esserci delle differenze di età ma, i diversi tagli effettuati non permettono di fare confronti.
Differenze di razza
Nello studio di Boughattas et al.,(2011) condotto su diversi allevamenti in Tunisia viene messo in evidenza che i cavalli di razza Araba avevano siero prevalenza statisticamente significativa, più elevata rispetto a Pony, Purosangue Arabi, Breton, Mogod e meticci ma non spiegano il perché secondo loro. Lo studio di Garcia Bocanegra et al.,(2012) condotto su 450 cavalli ha trovato una differenza quasi significativa perché P=0,08 che indicava una prevalenza più elevata nei cavalli non di razza (8,8%nei cavalli di razza pure e il13,4% nei cavalli incrociati).
Differenze di genere
Nello studio di Boughattas et al.,(2011) condotto su diversi allevamenti in Tunisia viene messo in evidenza che i cavalli di genere maschile avevano una siero prevalenza statisticamente significativa più elevata rispetto ai cavalli di genere opposto ma, non spiegano un possibile perché. Lo studio di Karatepe et al.,(2010) non ha messo in evidenza differenze significative tra generi, così come lo studio di Kouam at al.,(2010) effettuato su 753 cavalli allevati in Grecia. Nello studio di Guclu et al.,(2007) condotto su 100 cavalli sportivi non sono state osservate differenze di genere .Anche lo studio di Al Anazia e Alyousif (2010) condotto in Arabia Saudita su 266 sieri equini non ha dato luogo a differenze significative. Anche lo studio di Hajialilo et al (2010) non ha dato luogo a differenze di genere. Lo studio di Garcia Bocanegra et al (2012) condotto su 616 equidi di cui 454 cavalli non ha dato luogo a differenze significative.
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Quindi probabilmente non ci sono differenze di genere. 4.2 Sintomatologia
Il cavallo è considerato una delle specie meno sensibili all’effetto patogeno di Toxoplasma gondii (Bougattas et al.,2011; Guclu et al.,2007), dal momento che questa infezione mostra un decorso subclinico (Guclu et al.,2007), invece giovani animali e animali con immunosoppressione (malati in stato di gravidanza o con età avanzate) sono più suscettibili a sviluppare sintomatologia clinica (Guclu et al.,2007), come avviene nell’uomo. In questi animali suscettibili, segni atipici di un infezione da Toxoplsma gondii sono rappresentati da febbre, atassia, degenerazione retinica ed encefalite ( Karatepe et al., 2010) e paralisi (Guclu et al.,2007). Lo studio di Ghazy et al.,(2007) riporta di cavalli sperimentalmente infettati che hanno manifestato sintomi quali febbre, laminite, manifestazioni nervose, patologie oculari, decubito e aborto. Altri studi invece, riportano di cavalli naturalmente infettati da Toxoplasma gondii che hanno manifestato interessamento oculare, nel Regno Unito, o con sintomi riferibili al sistema nervoso centrale in Brasile ( Gupta et al.,2002). Nello studio di Locatelli-Dittrich et al.,(2006) hanno cercato di verificare se cavalle risultate positive ad un test sierologico per Toxoplasma gondii, Neospora hughesi e Neospora caninum, presentassero problemi di mancato concepimento, aborto o se partorissero puledri poco vitali o malati alla nascita. Per quanto riguarda Toxoplasma gondii, solo una cavalla è risultata positiva al test sierologico e ha comunque partorito un puledro sano quindi, non sono riusciti a dimostrare, a dare una prova definitiva, che questo parassita causi un ‘infezione trans placentare nei cavalli. Comunque anche se l’aborto è stato segnalato solo occasionalmente, deve essere considerato possibile, anche se raro (Tassi 2007). Il cavallo come già detto in precedenza è una delle specie meno sensibili all’effetto patogeno di Toxoplasma gondii, ma, in passato è stato associato alla mieloencefalite protozoaria (Boughattash et al., 2011). Nel corso degli anni però non è mai stata data una prova definitiva che Toxoplasma gondii causi la malattia clinica nel cavallo anche se sono presenti anticorpi (Locatelli-Dittrich et al.,2006). Quindi qual’ora un cavallo mostrasse sintomi neurologici andrebbero considerate prima altre patologie nervose più frequenti.
4.3 Diagnosi
La diagnosi di toxoplasmosi nel cavallo può essere stabilita dai test sierologici, che sono il metodo iniziale e primario per la diagnosi, dall’amplificazione del DNA e dall’isolamento del parassita (Montoya 2002). Nella diagnosi indiretta, vengono ricercati gli anticorpi e i test più
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utilizzati recentemente, sono stati: l’immunofluorescenza indiretta (IFAT)( Evers et al., 2012; Locatelli-Dittrich et al.,2005), il test di agglutinazione modificato (MAT)( Yang et al 2013; Garcia Bocanegraet al., 2012; Costa et al., 2012; Raeghi at al.,2011; Dangoudoubiyan et al., 2011; Boughattas et al.,2011; Hajialilo et al., 2010; Dubey et al.,2003 e Doubey et al.,1999) , il saggio immunoenzimatico (ELISA) (Kuoam at al.,2010 ) ,il test di agglutinazione in lattice (LAT) (Bartova et al.,2010) , il Sabin Feldman dye test (SFDT)( Karatepe et al.,2009; Guclu et al.,2007) e la tecnica dell’agglutinazione diretta (DAT) (Britt-Jakubek et al 2005).Sono stati utilizzati anche l’inibizione dell’emoagglutinazione(IHA) e la fissazione del complemento (FC)(Karatepe et al., 2010). Forse il test meno adatto è la fissazione del complemento perché il siero dei cavalli ha capacità anticomplementare e lisa naturalmente i globuli rossi se viene utilizzato il sistema classico (Poli 1998). Questi test possono essere effettuati su diversi tipi di campione come il siero del sangue, il liquido cefalo rachidiano e dal succo di carne in caso di animali macellati inoltre, possono essere applicate su campioni di tessuto(immunoistochimica) per la visualizzazione diretta del parassita ( cisti tissutali contenenti formazioni a rosetta). Possono essere utilizzate anche tecniche come la PCR ( nelle diverse varianti come la nested o la real time) in diversi tessuti, che amplifica i geni P30, B1 e 18SrDNA (DNA ribosomiale) di Toxoplasma gondii (Jones et al.,2000). Tutti questi test effettuati di recente danno una conferma indiretta di quanto siano eccezionali le manifestazioni cliniche nel cavallo questo perché nessun test è stato condotto per sospetto clinico di toxoplasmosi. Questi test sono stati effettuati per diversi motivi come ad esempio per fare una comparazione per la sensibilità di test sierologici(Ghazy et al., 2007), visto che Toxoplasma gondii ha localizzazione muscolare sono stati effettati studi sulla siero prevalenza nei cavalli sportivi perché sono importante settore economico in certi paesi (Hajialilo et al.,2010), ma prevalentemente vengono effettuati perché il cavallo potrebbe essere un’importante fonte di acquisizione di un infezione da Toxoplasma gondii nell’uomo ed in tal senso vengono effettuati studi di siero prevalenza nei macelli da paesi che esportano carne di cavallo come il Brasile (Evers et al., 2013) e il nord America (Dubey et al., 1999). Vengono effettuati test anche in paesi come il Giappone (Matsuo et al., 2014) nei quali è tradizione mangiare carne cruda (sashimi). Il test di preferenza per la diagnosi di toxoplasmosi non è stato ancora definito (Dubey.,1998), tuttavia visto che le infezioni da Toxoplasma gondii mostrano prevalentemente un decorso subclinico nei cavalli, le tecniche sierologiche per l’ individuazione di anticorpi specifici contro il parassita hanno un grande valore diagnostico(Guclu e Karaer,2007; Jauregui,et al., 2011) considerando anche il fatto che la
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PCR pur essendo un test molto sensibile e specifico non riesce a svelare l’ effettiva distribuzione del parassita (Rinaldi,2008).
22 SCOPO DEL LAVORO
La toxoplasmosi nell’uomo è stata ridefinita recentemente come una malattia a trasmissione alimentare, principalmente mediante il consumo di carne cruda. In Europa e soprattutto in Italia è relativamente importante il consumo di carne di cavallo. Quindi, lo scopo del lavoro, che è stato articolato in due fasi, è stato quello di verificare la sieroprevalenza in un gruppo di equini allevati in Toscana ,con il test dell’immunofluorescenza indiretta il quale fornisce indicazioni su un eventuale esposizione dei cavalli a Toxoplasma gondii, al quale è seguita la verifica della sieroprevalenza in un secondo gruppo di equini, nati e allevati in Italia, destinati alla produzione di carne. Inoltre, in questo secondo gruppo sono stati prelevati anche dei campioni di tessuto (da lingua, massetere e cuore), da analizzare mediante PCR-RPLF con l’intento di rilevare e genotipizzare il DNA di Toxoplasma gondii. Non è stato cercato di mettere in evidenza eventuali formazioni di cisti tissutali perché ciò avrebbe previsto il saggio biologico su topi che presenta oltre alle restrizioni burocratiche di ordine etico, anche un lungo periodo di attesa (fino a 21 giorni).
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Capitolo 6 MATERIALI E METODI
6.1 Descrizione della popolazione
In questo studio sono state esaminate due popolazioni di animali. I campioni di sangue del primo gruppo sono stati prelevati da 273 cavalli allevati in diverse aziende in Toscana. Questi campioni erano già presenti in laboratorio e sprovvisti di anamnesi. Il secondo gruppo invece è rappresentato da 51 cavalli di cui 47 nati, allevati e macellati in Italia. Nella tabella che segue è riportata una descrizione più dettagliata di questi cavalli. Oltre al sangue, da questo gruppo sono stati prelevati anche campioni di lingua, massetere e cuore per la ricerca e la successiva genotipizzazione di DNA di Toxoplasma gondii. Sono stati scelti questi organi perché il tessuto muscolare non scheletrico ha una densità maggiore di cisti rispetto al tessuto muscolare ( Cook A.J.C 2000).
Tabella descrittiva degli equini macellati
N° Sesso Età Razza Mantello N° Sesso Età Razza Mantello
1 M 1 / / 27 M 17 Metic. Baio
2 M 3 / / 28 F 7 ! !
3 F 1 / / 29 F 1 Metic. Sauro
4 F 15 Metic. Baio 30 F 6 Bardig. Morello
5 F 3 Trot.It. Baio 31 F 1 Metic. Baio
6 F 3 Trot.It. Baio 32 F 2 Trot.It.. Baio
7 M 3 Trot.It. Baio 33 M 1 Bardig. Baio
8 F 1 Metic. Sauro 34 F 2 Trot.It.. Baio
9 M 2 Trot.It Baio 35 F 5 Trot.It. Baio
10 F 17 Metic. Sauro 36 F 2 Metic. Sauro
11 F 1 Bardig. Morello 37 F 18 Metic. Baio
12 F 9 ! ! 38 M 3 Trot.It. Baio
13 M 10 Metic. Palomino 39 M 20 Metic. Grigio
14 M 13 Metic Baio 40 F 1 Bardig Baio
15 F 5 Metic. Roano 41 F 16 Metic. Baio
16 F 2 Metic. Sauro 42 F 15 Metic. Baio
17 M 16 Metic. Morello 43 F 6 Metic. Palomino
18 F 22 Metic. Baio 44 F 20 Metic. Appal.
19 M 1 Metic. Baio 45 F 1 Metic. Baio
20 M 1 Metic. Baio 46 F 4 Metic. Baio
21 F 1 Metic. Sauro 47 F 10 ! !
22 M 3 Trot.It Baio 48 F 3 Trot.It. Sauro
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24 F 12 Bardig. / 50 F 4 Metic. Sauro
25 M 14 Metic. / 51 F 8 Metic Baio
26 M 1 Metic. Sauro .
Metic.=Meticcio; Trot.It=Trottatore Italiano; Bardig.=Bardigiano; F.Mon.=France de Mountagne; Appal.=Appaloosa; !=non nato in Italia;
Foto. Campioni di sangue e tessuti prelevati al macello
Dico tentare la genotipizzazione perché ho potuto prendere solo un piccolo pezzetto marginale da ogni organo visto che questi organi facendo parte del quinto quarto alimentare (destinato all’alimentazione umana) o del quinto quarto industriale (per la produzione di colle, cosmetici, alimenti per animali ecc) questi erano venduti. Il quinto quarto in generale viene venduto non tanto per i relativi profitti ma, per il risparmio sugli elevati costi di smaltimento ( corrispondono alla categoria 3 del Reg Ce 1774/2002) (Scanziani et al.,2008). Campioni di lingua e massetere erano prelevati anche dal Dott .Borrini G. per l’esame trichinoscopico da effettuare presso l’istituto zoo profilattico.
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Foto. Dott.Borrini mentre effettua l'ispezione post-mortem
26 6.2 Sito di raccolta e di campionamento
I 51 campioni sono stati raccolti in due macelli della provincia di La Spezia nel periodo compreso tra gennaio e giugno 2012. Non è stato fatto un campionamento dei cavalli per il test perché essendo dei piccoli macelli i cavalli non erano tanti. Dopo che i cavalli sono stati storditi e quasi dissanguati sono stati raccolti circa 10 ml di sangue (arterioso e venoso) da ognuno di questi e in un secondo momento sono stati prelevati i campioni di lingua, cuore e massetere; circa 50 g per ognuno. Non è stato fatto un prelievo venoso prima della macellazione per evitare di stressare gli animali. Comunque sarebbe meglio prelevare solo sangue venoso in quanto è richiesto per le buone pratiche di laboratorio per la sierologia, perché la composizione del sangue venoso è diversa per pH e composizione da quella arterioso e può influenzare sensibilità e specificità del test (Cenci-Goga et al 2013). Successivamente una volta ottenuti 1,5 ml di siero tutti i campioni sono stati conservati in contenitori isotermici trasportati in laboratorio. I campioni sono stati conservati a -20°C fino al momento delle analisi.
6.3 IFAT
Come antigeni sono stati utilizzati ToxoSpot della Bio Mérieux (Marcy l’Etoile, France). I sieri da testare sono stati diluiti in PBS con diluizione 1:20, messi sugli spot contenenti l’ antigene e fatti incubare per 30 minuti a 37°C. Successivamente sono stati tamponati con carta e messi in PBS per 5 minuti, sono stati tamponati nuovamente. Il coniugato anti-IGg marcato con isotiocianato di fluoresceina è stato diluito in PBS a pH 7.2 con titolo 1:3. E’ stata messa una goccia una goccia del coniugato diluito in ogni spot, compresi i controlli positivo e negativo, e successivamente sono stati incubati a 37°C per 30 minuti, lavati in PBS, asciugati e montati con glicerina. I vetrini così preparati sono stati osservati immediatamente al microscopio elettronico e, una diffusa e continua fluorescenza della membrana periferica, scartando quelli che mostravano solo una fluorescenza apicale, sono stati considerati come una positività (Locatelli-Dittrch et al., 2006).Visto che il test di preferenza nel cavallo non è stato deciso e neanche i cut-off, la diluizione del siero di 1:20 è stata scelta da noi in modo arbitrario, tenendo conto però che nei i cavalli non sono routinariamente esposti a Toxoplasma
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gondii e che quindi i titoli anticorpali potrebbero non essere sufficientemente elevati per essere rilevabili (Gupta et al 2002), per aumentare la sensibilità del test. A tutti i sieri risultati positivi, sono state fatte diluizioni seriali per raddoppio fino alla titolazione. La titolazione di un siero corrisponde alla massima diluizione del siero a cui viene mostrata ancora positività (Cenci-Goga et al., 2013).
Siero positivo al test IFAT
Test statistici
Per avere una conferma che le differenze osservate, nelle diverse siero prevalenze ,nelle due popolazioni di equini (quelli di azienda e quelli del macello) non fossero dovute al caso è stato effettuato il test del Chi-Quadro. Questo test può essere utilizzato se il contenuto di ciascuna cella della tabella è superiore o uguale alle 5 unità, qual’ora il contenuto delle celle fosse inferiore alle 5 unità può essere effettuato il test del Chi-Quadro con la correzione di Yates o il test esatto di Fisher. Ho potuto applicare il test del Chi-Quadro senza correzione solo per le prevalenze ≥1:20 e ≥1:40, per verificare la siero prevalenza ≥1:80 è stata effettuata la correzione di Yates. Inoltre, per il gruppo di equini del macello visto che avevo qualche dato sulla loro anamnesi ho effettuato il medesimo test per vedere se ci fossero state delle differenze tra le caratteristiche degli animali risultati positivi al test (cut-off ≥ 1:20) e gli animali risultati negativi. Le caratteristiche considerate sono state:
- l’ età (giovani, adulti, anziani), diversi studi hanno effettuato il test del chi quadro per controllare se i cavalli avessero avuto prevalenze diverse in funzione dell’età, però ogni studio
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effettua il suo taglio di età in modo arbitrario. Io ho deciso di riportare quello di Garcia Bocanegra.<5 giovani, 5-14 adulti ,>14 anziani .
-il genere ( maschile e femminile).
– la razza/incroci.
I risultati del test sono stati ottenuti da un programma presente in rete, da un sito che produce software per test statistici (WWW.graphpad.com).
6.4 Genotipizzazione 6.4 .1 Estrazione del DNA
L’ estrazione del DNA è stata effettuata per i tessuti dei cavalli risultati positivi all’IFAT con titolo ≥ 1:20, utilizzando il kit commerciale " Eurogold tissue DNA mini kit ". Visto che il test più sensibile e specifico nel cavallo non è stato ancora determinato, avremmo dovuto effettuare la PCR anche dai campioni risultati negativi tuttavia, però visto il basso cut-off utilizzato ed essendo la PCR molto costosa, è stato ragionevolmente deciso di non effettuarla nei campioni risultati negativi. Circa 40 mg di tessuto per ciascun campione, sono stati messi in una eppendorf a cui sono stati aggiunti 400 µl di DNA lysis buffer e 20 µl proteinasi K. Per ottimizzare la lisi tissutale, i campioni hanno subito un pre-trattamento con tripsina; una volta mescolato tramite vortex, questi ultimi sono stati lasciati a 50°C in overnight. Successivamente i campioni sono stati centrifugati a 13,2 mila giri per 30 secondi e il supernatante ottenuto è stato trasferito in una nuova eppendorf: a questo punto sono stati aggiunti 200 µl di DNA binding buffer e a seguire, il tutto è stato omogeneizzato mediante vortex. 750 µl di questa soluzione, sono stati trasferiti in una colonna “perfectbind DNA” montata su un tubo collettore; la colonna presenta un filtro, che si oppone al passaggio di DNA (in presenza di etanolo) ma non di altre macromolecole, che vengono raccolte nel tubo collettore. Infatti la colonnina è stata messa in centrifuga alla massima potenza per 2 minuti, ed il liquido che aveva attraversato il filtro è stato scartato. Dopodiché sono stati fatti 2 cicli di lavaggio con il “DNA Wash buffer ” (lavaggio, centrifuga ed eliminazione del filtrato). Prima dell’ultimo passaggio, è stata eseguita una centrifuga a 11400 rpm per 2 minuti, in modo da asciugare il filtro dall'etanolo contenuto nel wash buffer. Infine la colonnina è stata inserita
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all’ interno di una nuova eppendorf ed al suo interno sono stati introdotti 200 µl di elution buffer e poi centrifugati a 6,00 g per un minuto. L’ elution buffer permette il passaggio del DNA attraverso il filtro, e quindi, gli acidi nucleici estratti si troveranno nell’eppendorf, pronti ad essere utilizzati per la PCR.
6.4.2 Amplificazione del DNA (n-PCR)
Per quanto rigurda la PCR, è stato eseguito il protocollo di Jones et al.( 2001) : questo prevede una PRC “nested”, ossia una prima amplificazione di una sequenza tramite l’utilizzo di una coppia di primer ed una seconda amplificazione di una sequenza più corta, all’interno della precedente. Per l’ amplificazione del DNA è stata utilizzata una master mix (GoTaq® Green Master Mix) che contiene Taq DNA polimerasi, dNTPs, MgCl2, buffer in concentrazioni ottimali e un colorante che permette la visualizzazione del DNA al saggio dell’ elettroforesi in gel. I primer utilizzati ( B1 out R e B1 out F per il primo step/ B1 in F e B1 in R per il secondo) si appaiavano alle estremità di sequenze omologhe di DNA specifico per Toxoplasma gondii, amplificando prima un segmento di 193 paia di basi e poi uno di 96. I campioni positivi a questa PCR (cioè positivi a Toxoplasma gondii), mostreranno all’elettroforesi una banda di amplificazione all’altezza di 96 bp.
Tabella .Sequenza nucleotidica dei primer per n-PCR
B1 out Forward GGA ACT GCA TCC GTT CAT GAG
B1 Out Reverse TCT TTA AAG CGT TCG TGG TC
B1 in Forward TGC ATA GGT TGC AGT CAC TG
B1 in Reverse
GGC GAC CAA TCT GCG AAT ACA
CC
Jones C.D., Okhravi N., Adamson P., Tascker S., and Lightman S.(2000). Comparison of PCR detection methods for B1,P30 and 18S rDNA genes of T.Gondii in acqeous humor. IOVS,march 2000,vol41,No.3
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MATERIALE Prima amplificazione Seconda amplificazione
(quantità in µl ) ( quantità in µl )
Master Mix 10 10
H2O 2 6
Primer B1 out/inForward 1,5 1,5 Primer B1 out /inReverse 1,5 1,5
DNA 5 1
Totale 20 20
L’ amplificazione del DNA dei campioni e dei controlli ( positivo e negativo ) è avvenuta all’ interno di un termociclatore. Le foto che seguono riportano le temperature e i cicli delle due amplificazioni.
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Foto. Tempi e temperature della seconda amplificazione
I prodotti dell’ amplificazione sono stati analizzati, mediante elettroforesi in gel di agar al 2 %. Il gel è stato preparato aggiungendo a 100 ml di TAE buffer e 2 gr di agarosio. Una volta sciolto l’agarosio al microonde sono stati aggiunti 15 µl di gel red (un colorante per il DNA che emane luminescenza in presenza di raggi UV) e poi, ancora in stadio liquido è stato versato in un lettino per elettroforesi, in cui è stato aggiunto un pettine per la formazione di pozzetti, e fatta raffreddare. Una volta solidificato il gel, questo è stato messo nella cella elettroforetica. In ogni pozzetto sono stati messi 20 µl di ogni mix è ed stata applicata una differenza di potenziale di 80 V per 30 minuti. Successivamente i gels sono stati visualizzati sotto luce UV con un trans illuminatore per verificare una banda di amplificazione all’altezza di circa 100 paia di basi.
32 Foto. Campioni positivi alla n-PCR
6.4.3 PCR-RPFL
I campioni positivi alla precedente PCR sono stati successivamente genotipizzati mediante una PCR-RFLP (Restriction Frangment Length Polymorfphism) impiegata da Su et al.,(2009). Sono stati amplificati mediante PCR nested 12 markers genetici del parassita (SAG1, 3’SAG2, 5’SAG2, SAG2 new, SAG 3, BTUB, C-228, C29-2, GRA 6, L358, PK1 e APICO ) e dopodiché, gli amplificati sono stati trattati con enzimi di restrizione specifici (primer, enzimi e relative condizioni di taglio enzimatico sono indicati nella tabella sottostante). Gli enzimi di restrizione sono in grado di tagliare in punti specifici in DNA riconoscendo delle specifiche sequenze; in base alla lunghezza di questi frammenti di DNA tagliati, è possibile caratterizzare il genotipo di Toxoplasma gondii. Per la preparazione degli enzimi di restrizione sono strati utilizzati 10µl di DNA amplificato, 1,8µl di NEB, 0,2µl di BSA, 0,5µl di enzimi di restrizione e 7,5µl di acqua distillata per un totale di 20µl (se si usavano due enzimi di restrizione, allora sempre 0,5µl di enzima cadauno e 7 µl di acqua). La digestione avviene anche a temperature diverse e per tempi diversi. Una volta ottenuti i prodotti della digestione enzimatica questi venivano analizzati con una corsa in gel di agar (come è avvenuto per i precedenti, la sola differenza è stata la percentuale di gel agar utilizzato, era al 2,5%) e successivamente osservati al trans illuminatore.
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34 Tempi e temperature PCR-RFLP
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Risultati
Risultati IFAT
La siero prevalenza totale dei sieri di cavallo sottoposti a IFAT con cut-off di 1:20 è stata del 13%( 43/321). Dei 273 campioni di siero già presenti in laboratorio, 16 si sono fermati ( cut-off) alla diluizione di 1:20 , 18 campioni si sono fermati alla diluizione di 1:40 e 3 campioni si sono fermati alla diluizione di 1:80. Dei 48 campioni di siero prelevati ai macelli 4 si sono fermati alla diluizione di 1:20, 1 alla diluizione di 1:40, 3 alla diluizione di 1:80 e 1 alla diluizione di 1 :160. Le prevalenze dei campioni degli equini macellati sono state ottenute dividendo gli animali positivi per 48 in quanto 3 cavalli non erano nati in Italia. Visto che il titolo IFAT che dovrebbe essere considerato specifico per l’infezione da Toxoplasma gondii nel cavallo non è stato determinato, anche se da noi e stato scelto di 1:20, ho deciso di riportare anche una tabella che presentati tutti i titoli. Come viene fatto da Dubey et al.,(2003) con Neospora.
Titolo N° di animali Prevalenza
Equini aziende x≥1:20 34 34/273= 0,124 (12%) x≥1:40 18 18/273=0,065 (7%) 1:80 3 3/273=0,010(1%) Equini macello x≥1:20 9 9/48=0,187 (19%) x≥1:40 5 5/48=0,102 (10%) x≥1:80 4 4/48=0,082 (8%) 1:160 1 1/48=0,020 (2%) Totale x≥1:20 34+9=43 43/321=0,134 (13%) x≥1:40 18+5=23 23/321=0,071 (7%) x≥1:80 3+1=4 4/321=0,012(1%) X=1:160 1 1/321=0,00311(0,3%)
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Tabella. Descrizione degli equini risultati positivi a IFAT
CV.N° Sesso Età Razza N° Sesso Età Razza
4 F 15 Metic. 33 M 1 Bardig.
10 F 17 Metic. 46 F 4 Metic.
17 M 16 Metic. 49 F 11 Metic.
29 F 1 Metic 51 F 8 Metic.
31 F 1 Metic.
Risultati test statistici
1) Differenze tra le diverse siero prevalenze tra i due gruppi: - ≥1:20: Chi-quadro=1,40702; P=0,2376
- ≥1:40: Chi-quadro=0,49; P = 0,4801
- ≥1:80: Chi-quadro=6,912; P = 0,0086 ( significativa) 2) Differenze nel gruppo di equini macellati:
- Differenze di genere: Chi-quadro=0,154; P=0,6949. Differenza non significativa
- Differenze di razza: Chi-quadro=1,752; P=0,1857. Differenza non significativa ma, si avvicina.
- Differenze di età:
a) Tra equini giovani e adulti-anziani: Chi-quadro=0,176; P=0,6750. Differenza non significativa
b) Tra equini anziani e adulti-giovani: Chi-quadro=0,324; P=0,5693. Differenza non significativa
c) Tra equini adulti e anziani-giovani: Chi-quadro=0,003; P=0,9561. Differenza non significativa
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7.2 Risultati Nested-PCR
Alla PCR nested che è stata effettuata nei tessuti è stata riscontrata la banda di 100 paia di basi caratteristica del gene B1 di Toxoplasma gondii in 3 campioni su 9 ovvero nel 44%dei casi (3/9) e sul 18% dei cavalli in totale (3/51).
Cv n° n-PCR PCR cuore PCR lingua PCR massetere 4 Neg - - - 10 Neg - - - 17 Pos pos - - 29 neg - - - 31 Neg - - - 33 Neg - - - 46 Pos pos - - 49 Pos pos - - 51 neg - - -
Risultati della genotipizzazione PCR-RFLP
La genotipizzazione è stata fatta sui campioni di tessuto provenienti da 9 cavalli risultati positivi all’ IFAT (a qualsiasi titolo) e positivi alla PCR nested. Alla PCR nested è stata riscostrata la banda di 100 paia di basi caratteristica del gene B1 di Toxoplasma gondii in 3 campioni su 9 ovvero nel 44%dei casi (3/9) e sul 18% dei cavalli in totale (3/51). Il N°17 ha mostrato una positività al genotipo I ma, solo per il campione proveniente dal muscolo cardiaco così come il cavallo N° 46 però questo campione è risultato positivo per genotipo III. Il campione N° 49 è risultato positivo al genotipo misto II/III. La genotipizzazione è stata effettuata sul 5,88% dei campioni ( 3 cavalli su 51 ). Considerando come positività anche un solo tessuto(visto che per ogni animale ne avevo tre: lingua , massetere e cuore) risultato positivo al test vista l’esigua possibilità di riscontrare DNA di Toxoplasma gondii da pochi grammi di tessuto; nel maiale ad esempio viene stimato che possa essere presente una cisti ogni 50g di tessuto.
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Tabella. Risultati PCR-RFLP
Tabella riassuntiva
N°CV Genere Razza Età Titolo
IFAT Pos.n-PCR Pos.PCR-RFLP 4 F Met. 15 +/-1:160 10 F Met. 17 1:80 17 M Met. 16 1:80 Si,solo al cuore Genotipo I 29 F Met. 1 1:20 31 F Met. 1 1:20 33 M Bardigiano 1 1.20 46 F Met. 4 1:40 Si,solo al cuore Genotipo III 49 F Met. 11 1:80 Si, a cuore Genotipo mistoII/ III 51 F Met. 8 1:20
Cavallo 17 Cavallo 46 Cavallo 49
SAG1 I - -
3'SAG2 I/III I/III II
5'SAG2 I/II III I/II
SAG2
new - - -
SAG3 I III III
ΒTUB - - - C22-8 I III II C29-2 I III III GRA6 I III - L358 - - III PK1 I - II Apico - - -
