Risultati Nested-PCR

Alla PCR nested che è stata effettuata nei tessuti è stata riscontrata la banda di 100 paia di basi caratteristica del gene B1 di Toxoplasma gondii in 3 campioni su 9 ovvero nel 44%dei casi (3/9) e sul 18% dei cavalli in totale (3/51).

Cv n° n-PCR PCR cuore PCR lingua PCR massetere 4 Neg - - - 10 Neg - - - 17 Pos pos - - 29 neg - - - 31 Neg - - - 33 Neg - - - 46 Pos pos - - 49 Pos pos - - 51 neg - - -

Risultati della genotipizzazione PCR-RFLP

La genotipizzazione è stata fatta sui campioni di tessuto provenienti da 9 cavalli risultati positivi all’ IFAT (a qualsiasi titolo) e positivi alla PCR nested. Alla PCR nested è stata riscostrata la banda di 100 paia di basi caratteristica del gene B1 di Toxoplasma gondii in 3 campioni su 9 ovvero nel 44%dei casi (3/9) e sul 18% dei cavalli in totale (3/51). Il N°17 ha mostrato una positività al genotipo I ma, solo per il campione proveniente dal muscolo cardiaco così come il cavallo N° 46 però questo campione è risultato positivo per genotipo III. Il campione N° 49 è risultato positivo al genotipo misto II/III. La genotipizzazione è stata effettuata sul 5,88% dei campioni ( 3 cavalli su 51 ). Considerando come positività anche un solo tessuto(visto che per ogni animale ne avevo tre: lingua , massetere e cuore) risultato positivo al test vista l’esigua possibilità di riscontrare DNA di Toxoplasma gondii da pochi grammi di tessuto; nel maiale ad esempio viene stimato che possa essere presente una cisti ogni 50g di tessuto.

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Tabella. Risultati PCR-RFLP

Tabella riassuntiva

N°CV Genere Razza Età Titolo

IFAT Pos.n- PCR Pos.PCR- RFLP 4 F Met. 15 +/-1:160 10 F Met. 17 1:80 17 M Met. 16 1:80 Si,solo al cuore Genotipo I 29 F Met. 1 1:20 31 F Met. 1 1:20 33 M Bardigiano 1 1.20 46 F Met. 4 1:40 Si,solo al cuore Genotipo III 49 F Met. 11 1:80 Si, a cuore Genotipo mistoII/ III 51 F Met. 8 1:20

Cavallo 17 Cavallo 46 Cavallo 49

SAG1 I - -

3'SAG2 I/III I/III II

5'SAG2 I/II III I/II

SAG2

new - - -

SAG3 I III III

ΒTUB - - - C22-8 I III II C29-2 I III III GRA6 I III - L358 - - III PK1 I - II Apico - - -

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Capitolo 8 Discussione

8.1 IFAT

Abbiamo trovato una prevalenza totale del 13% (43/321). La siero prevalenza in entrambi i due gruppi di equini potrebbe essere definita, alla diluizione del siero ≥ di 1:20 moderata in quanto In EFSA Jouranal (2014) la prevalenza di agenti zoonotici negli animali è indicata come : rara se <0,1%, molto bassa se compresa tra 0,1% e 1%, bassa se > dell’ 1% fino al 10%, moderata se è > del 10% fino al 20%, elevata se è > del 20% fino al 50%, molto elevata se > del 50% fino al 70% ed estremamente elevata se è > del 70%. In Italia l’unico studio ,che sono riuscita a trovare, è quello di Rinaldi e Scala (2008) il quale, riporta le diverse siero prevalenze degli animali allevati in Italia per Toxoplasma gondii negli ultimi 30 anni. In questo studio sono forniti dati più dettagliati ( numero di animali, regione di provenienza) per quanto riguarda gli ovi-caprini e per i suini invece, per quanto riguarda la specie equina l’unico dato è un valore di siero prevalenza, riferito allo studio di Tassi (2006), del 30,7% utilizzando MAT, in cavalli da macello provenienti da diverse e non specificate regioni. L’autore conclude dicendo che la siero prevalenza negli animali allevati in Italia non è uniformemente distribuita nel territorio. La siero prevalenza , dal 1999 fino ad oggi, nella specie equina varia nel mondo dallo 0% in Giappone(Matsuo et al.,2014 ) al 71% in Iran (Hajalilo et al.,2010). In Europa invece sono riportate siero prevalenze del 10.8% in Spagna ( Garcia-Bocanegra et al.,2012), del 31,2% in Francia (Efsa 2012), dell’1,7% in Grecia (Kuoam et al.,2010), del 24% in Repubblica Ceca (Bartova et al.,2010), del 55% (Elghaysh 1998) e dello 0% (Efsa 2012) in Germania, del 7,2% ( Karatepe et al.,2010) e del 28% (Cuclu et al.,2007) in Turchia. Dai paesi europei da cui importiamo carne equina e animali vivi come la Polonia non ho trovato alcun dato. Dai paesi extra europei come Brasile e Argentina, le siero prevalenze variano dall’11,6%( Evers et al.,2012) e il 43,7%( Costa et al.,2012) in Brasile, al 13,1% in Argentina (Dubey et al., 1999). Non mi è possibile spingermi oltre alla semplice elencazione dei dati (non posso dire che è più elevata in un luogo rispetto ad un altro) perché quando si confrontano i dati sulla siero prevalenza per l’infezione da Toxplasma gondii si deve tenere conto del fatto che sono utilizzati diversi metodi sierologici (Dubey et al.,1999). Questi diversi test inoltre potrebbero non avere neanche correlazione, ad es nello studio di Dubey et al.,1999 non è stata trovata una correlazione tra MAT e DT. Questi test visto che non sono standardizzati che, ovvero questi test variando di sensibilità e specificità non produrranno quasi mai lo stesso risultato anche se condotti nello stesso laboratorio( Jakubek

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et al,2006). Il test di preferenza per la diagnosi di toxoplasmosi nel cavallo quindi anche ad oggi rimane sconosciuto perché la sensibilità e la specificità di ogni test non è stata determinata (Dubey ,1998), anche se il test IFAT è considerato uno dei test più sensibili per la diagnosi di questa parassitosi (Guclu e Karaer,2007). Comunque anche se i dati esaminati possono non corrispondere alla prevalenza reale, possono essere comparati con altri studi se interpretati come stima , diventando così paragonabili le differenze di età , i differenti fattori ambientali o altri fattori che possono avere un impatto diretto sull’epidemiologia di Toxoplama gondii (Jakubek et al,2006). Ed è in tal senso che è stato messo in evidenza di come l’attività e la localizzazione geografica siano significative per l’acquisizione di Toxoplasma gondii nei cavalli(Kuoam et al.,2010). L’utilizzo che viene fatto dei cavalli può aumentare o diminuire il rischio di esposizione alle oocisti, ad esempio nello studio di Finger et al.,2013 i cavalli, prima di essere macellati, erano utilizzati per effettuare la raccolta differenziata dei rifiuti urbani. In questo modo potevano venire in contatto con più probabilità, con le feci dei gatti che in città sono molto più numerosi. Questi animali non sono allevati come animali per la produzione di alimenti (quindi in regime di alimentazione e di allevamento controllati) ma, a fine carriera vengono destinati a tal scopo. Un discorso simile può essere fatto per i cavalli macellati in Liguria in questo studio. Nel settore equino si possono identificare tre tipologie di animai:1) cavalli come animali da compagnia i quali per un loro valore intrinseco o per motivi affettivi dei proprietari non andranno mai al macello e ai fini della registrazione e dell’effettuazione dei trattamenti farmacologici sono a tutti gli effetti equiparabili alle altre specie di animali d’affezione. 2) cavalli come animali da carne, sono equidi allevati specificatamente per la produzione di carne, di razze particolari, importati da paesi esteri solo per essere macellati, sono soggetti a tutti gli obblighi di registrazione dei trattamenti farmacologici previsti per le altre specie animali in produzione. 3) cavalli ad uso sportivo, sono la categoria più vasta, di razze diverse, possono essere collocati in una delle due precedenti categorie in base alle decisioni del proprietario, allo stato di salute, all’età ecc( su Clara, appunti di medicina legale della Prof.ssa Biagi Giulia). In Europa il Regolamento (CE) N.504/2008 della Commissione Europea si occupa dell’identificazione degli equidi( enti preposti, tipo di microchip, documento di identificazione ecc) e li suddivide di fatto in solo due categorie. Il documento di identificazione è suddiviso in 10 sezioni e prevede, oltre al segnalamento dell’animale e ai dati del detentore ed altro, nella sezione IX, che a sua volta è suddivisa in 3 parti, l’ esclusione ( quindi equino non DPA ovvero non destinato alla produzione di alimenti) o la non esclusione ( quindi equide DPA ovvero destinato alla produzione di alimenti) dall’animale dalla macellazione. Questa suddivisione viene effettuata

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in relazione ad eventuale trattamenti farmacologici: gli animali DPA in possono essere trattati con i farmaci appartenenti agli allegati I II e III del Regolamento (CE) 2377/90 ma non con i farmaci dall’allegato 4. Qualunque fosse stato il tipo di farmaco ( dei primi 3 allegati) i tempi di sospensione ,dall’ultimo trattamento effettuato, erano di 6 mesi. Gli animali non DPA non avevano limitazioni di questo genere. Di recente il Regolamento CE 2377/90 è stato “sostituito” dal Regolamento 37/2010 che di fatto unisce le prime tre tabelle del Reg.CE 2377/9). Come si può ben vedere dalla tabella nella quale ho riportato la descrizione dei cavalli macellati in provincia di La Spezia ben 26 cavalli su 51 macellati avevano più di 3 anni, addirittura il cavallo n 44 aveva 20 anni, appartenevano a diverse razze e quindi la metà degli animali sembra corrispondere alla categoria degli animali sportivi o ad altro uso descritta in precedenza anche se sul documento di identificazione erano tutti DPA. In generale poi, gli animali destinati per la produzione di carne vengono macellati ad età inferiori , questo perché nell’ottica di un allevamento destinato a tal fine vengono utilizzate certe razze che in genere sono selezionate per questo scopo, a alle quali viene fornita un certo tipo di alimentazione che è razionata cioè che permette di raggiungere un certo tipo di peso, di qualità della carne, in tempi ben stabiliti e relativamente brevi, per poter avere un certo tipo di guadagno ( ad es, il vitellone bianco dell’Appennino centrale viene macellato a 18-22 mesi quando ha raggiunto un certo peso vivo )( ho effettuato il tirocinio di zootecnia in un allevamento di bovini da carne in Mugello). Macellare questo tipo di animale il quale può essere stato utilizzato in vita per diversi scopi potrebbe dare origine:

- ad una carne dal valore qualitativo più basso,

- ad una carne che potenzialmente può contenere più residui chimici di farmaci, questo perché “ dal punto di vista del veterinari ufficiale è questa la categoria più pericolosa in quanto gli animali arrivano alla macellazione in genere dopo svariati trattamenti farmacologici dei quali si può perdere la traccia durante i frequenti passaggi di proprietà” ( Prof.ssa Biagi )

- ad una carne che per via dell’età e della modalità di allevamento degli animali può essere stata in contatto con diversi agenti patogeni o sviluppare patologie legate all’età. Il cavallo grigio meticcio n 49 ( tra l’altro è uno degli animali positivi a Toxoplasma gondii.) di 11 anni ha presentato metastasi di melanomi in quasi tutte le parti della carcassa. Ovviamente la carcassa è stata sequestrata e distrutta a spese del proprietario. Inoltre possono essere esposti ad altri parassiti, per i quali c’è comunque un controllo da parte del veterinario ufficiale in quanto le lesiono o sono visibili ad occhio nudo come Echinococco o vengono prelevati dei campioni da inviare all’istituto zoo profilattico come nel caso di Trichinella. Questo discorso

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però non vale per Toxoplasma gondii perché le lesioni essendo troppo piccole non sono visibili ad occhio nudo ( Evers et al 2013) e non sono previsti nel cavallo dei test da effettuare . Essere a conoscenza dei dati epidemiologici che incidono sulla prevalenza della toxoplasmosi nel cavallo, ci permette anche di poter intervenire nel tentativo di diminuire la siero prevalenza in questa specie. Per prevenire l’infezione da Toxoplasma gondii in azienda è necessario identificare le fonti di infezione in relazione alle diverse specie allevate (Kijistra 2008). Le misure di intervento sono trattate da Tenter 2008 e vengono esposte così:

Rischio Misure da

intraprendere

Su cosa interviene la misura

Eliminazione attiva delle oocisti

Rimuovere i gatti dalle aziende e vaccinare i gatti

Elimina la fonte di oocisti dalle aziende e previene lo spargimento di oocisti

Contaminazione

ambientale della oocisti

Sterilizzare il cibo e vietare l’accesso esterno agli animali che producono carne

Riduce l’esposizione alle oocisti

Infezione nei topi Vaccinare gli animali produttori di carne per l’uomo

Riduce la trasmissione soprattutto negli animali onnivori ma, anche nei cavalli visto che accidentalmente

potrebbero ingerire questi animali.

Cisti tissutali nella carne Vaccinare gli animali Previene la formazione di cisti

Come la stesse autrice sostiene, alcune di queste misure non possono essere attuate in animali come le pecore, le capre e i cavalli perché questi animali richiedono l’accesso all’esterno, inoltre il vaccino per questi animali sembra promettente ma , è ancora in fase sperimentale. Il controllo della presenza dei gatti in azienda è fondamentale per la prevenzione negli

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allevamenti di animali erbivori, anche se, pur essendo presenti dei vaccini ,che si sono anche dimostrati efficaci ,questi non sono presenti in commercio e comunque viene messo anche in dubbio un possibile utilizzazione da parte degli allevatori perché, non potendo vaccinare anche i gatti randagi, quindi sarebbe tutto un po’ inutile (Kijistra, 2008). Sono presenti anche vaccini da destinare agli animali da allevamento, questi vaccini possono prevenire l’aborto nella pecora e ridurre il numero di cisti tissutali, più recentemente un vaccino composto da un cocktail di DNA di Toxoplasma gondii ha permesso di ottenere carni senza cisti tissutali (Kijistra, 2008). Oltre alla derattizzazione è molto importante effettuare la lotta contro gli insetti come mosche, scarafaggi ecc., perché possono fungere da vettori per le oocisti di Toxoplasma gondii e vietare anche l’acceso dei cani, sempre per lo stesso motivo.

Risultati del test statistico

La siero prevalenza del 12% e del 7% nei cavalli del primo gruppo, rispettivamente con titoli ≥1:20 e ≥ 1:40 non ha dato luogo a differenze statisticamente significative al test del chi quadro, con la siero prevalenza dei cavalli del secondo gruppo, 19% e 10% ( gli equini macellati). Questo può essere spiegato considerando l’area di provenienza , con lo stesso clima rispetto alle regioni del sud Italia, di questi animali visto che il primo gruppo è stato censito in Toscana e che molti cavalli del secondo gruppo provenivano dalla medesima regione più, altre province del nord Italia, quindi più o meno provenivano dalla medesima area, anche se non si può generalizzare troppo perché, un recente studio ha dimostrato che la contaminazione oocisti T. gondii dell'ambiente è per lo più limitato a siti defecazione gatto (Afonso et al. , 2008). Invece è stata trovata una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi con siero prevalenza ≥1:80, il primo gruppo di equini mostrava una siero prevalenza dell’ 1% e il secondo dell’8%. Questo potrebbe essere collegato all’età dei cavalli visto che, sebbene non sia a conoscenza dell’età dei cavalli del primo gruppo però, i cavalli del secondo gruppo risultati positivi con questo cut –off, avevano 15,17,16,e 11 anni e quindi, con l’aumentare dell’età aumentano anche le possibilità di entrare a contatto con il parassita (Boughattas et al.,2011). Inoltre, questi cavalli potrebbero essere i veri positivi al test IFAT ,se considero il fatto che altri studi hanno utilizzato cut -off più elevati e, visto che aumentando la diluizione diminuisce il rischio di reazioni crociate o forse che questi cavalli presentano titoli più elevati perché continuamente esposti al parassita, visto che se non ci sono contatti ripetuti con il parassita con il passare del tempo gli anticorpi si abbassano tanto fino a

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non essere più rilevabili (Fioretti, 2004). I risultati della positività sierologica al test IFAT con IgG possono essere dovuti a:

- ad equini veramente positivi entrati in contatto con il parassita (probabile) IFAT è molto specifico (Ravaioli 1985).

-alla presenza di anticorpi dovuti all’immunità passiva fornita con il colostro( poco probabile perché i puledri avevano tutti almeno 1 anno e a quell’età sono già svezzati. I puledri vengono svezzati a 6 mesi (Orlandi 2009)

-falsi positivi dovuti a reazioni crociate. Quando due molecole possiedono determinanti antigenici comuni o strutturalmente simili, gli anticorpi prodotti verso uno di questi antigeni tende a reagire anche verso l’altro (Poli 1998). Le molecole di superficie degli Apicomplexa , sono importanti fattori di virulenza e sono responsabili dell’interazione iniziale del patogeno con la superficie della cellula ospite e della risposta immunitaria dell’ospite. Una famiglia composta da più di venti antigeni è stata trovata per Toxoplsma gondii e una ricerca di bioinformatica indica che, il pieno assemblaggio dei geni per gli antigeni di superficie è molto esteso nel ceppo ME49 anche se parte di questi potrebbero essere pseudo geni non espressi( Howc et al.,2004). Sempre nello studio di Howc et al., 2004 viene detto che le molecole di superficie (Sn SAG1, Sn SAG2 e Sn SAG3) del genere Sarcocistis ( che è un genere molto ampio) esprime antigeni di superficie simili a Toxoplasma gondii (Tg SAG1, Tg SAG2 e Tg SAG3) e che il gene che sintetizza per SnSAG1 è molto simile al gene che sintetizza l’antigene di superficie Tg SAG2. Le molecole Tg SAGs sono fortemente immunogene e questo limita un’infezione dilagante da Toxoplasma gondii nella fase iniziale di infezione e che TgSAG 1 , rilevabile principalmente nei tachizoiti nelle fasi iniziali di infezione e rilevabile con anticorpi IgA IgG e IgM,è assente nei bradizoiti all’interno delle cisti tissutali. Però Nello studio di Gupta et al.,2002 gli anticorpi contro Sarcosystis neurona non hanno reagito né con antigeni di Toxoplasma gondii né con antigeni di Neospora spp., inoltre, ci sono Sarcocistis spp. che hanno come ospite intermedio proprio il cavallo come, S. equicanis (bertrami) e S. fayeri il cui ospite definitivo è il cane ( Urquhart et al.,1998). Toxoplasma gondii è un parassita correlato anche con Neospora spp. pertanto sono possibili cross-reazioni anche con questo parassita. Ci sono stati casi in cui sieri equini positivi per Neospora sp. sono risultati positivi anche per Toxoplasma gondii con basse diluizioni ma, non a diluizioni più elevate, aumentare la diluizione fa diminuire le cross-reazioni. Questo comunque rafforza ulteriormente la presenza di epitopi superficiali simili tra Toxoplasma gondii e Neospora spp. (Gupta et al.,2002). Cavalli risultati debolmente positivi e IFAT hanno confermato la

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positività anche all’immunoblot quindi questo test può essere utilizzato come test di conferma in quanto molto più specifico ( Jakubek et al., 2006 ). Lo studio di Bartova et al., (2010) condotto su 552 cavalli ha messo in evidenza che solo 1 cavallo (0,2%) mostrava una positività ad entrambi i parassiti. Forse le cross reazioni sono possibili ma non molto probabili e questo può dipendere anche dalla diluizione del siero. Sensibilità e specificità del test IFAT possono dipendere anche dal ceppo di Toxoplsma gondii utilizzato ( Cenci-Goga et al., 2013), la risposta immunitaria dell’ospite varia a seconda della specie ospite e dal ceppo di Toxoplasma gondii ( ad esempio il ceppo I è sempre letale nei topi ma non lo è nell’uomo immunocompetente) ecco perché lo studio di Ghazy ci tiene a sottolineare che per la prima volta sono stati utilizzati per i test sierologici tachizoiti ottenuti dal cavallo ( anche se poi li ri- inocula nei topi). Inoltre le caratteristiche di un test sono influenzate a seconda se si utilizzano tachizoiti grezzi (interi) o ridotti in frammenti più piccoli perche gli anticorpi prodotti dai linfociti B sono di tipo conformazionale ( riconoscono la conformazione spaziale che assumono le proteine SAGs non tanto la sequenza lineare amminoacidica della proteina denaturata) e non riconoscono le proteine SAGs ridotte (Gupta et al.,2002) come avviene per qualche test sierologico. L’utilizzo di proteine come SAG1 non riducibile( di 30Kda) e di SAG2 non riducibile( di 20Kda) da utilizzare con l’immunoblot potrebbero essere utilizzate come test di conferma, perché molto più sensibili e specifiche, soprattutto SAG2, perché è stato osservato che sieri provenienti da individui con infezione recente hanno reagito più energicamente con questa proteina che viene prodotta prevalentemente nella fase acuta dell’infezione.(Gupta et al.,2002).

I risultati della negatività sierologica possono essere dovuti a

-equini veramente negativi (possibile e probabile perché i sieri di cavallo non sono stati molto diluiti ed è per questo motivo che non è stata fatta la PCR nei tessuti corrispondenti ai sieri risultati negativi perfino alla diluizione 1:20)

-Equini con un infezione precoce che ancora non hanno sviluppato anticorpi o che stanno producendo anticorpi della classe IgM e quindi non rilevabili con un anticorpo marcato anti IgG

-equini infettati che non hanno una risposta immunitaria

-equini infettati ormai da troppo tempo e che hanno anticorpi troppo bassi, come dice Piergili Fioretti (2004) ”gli anticorpi cadono a livelli bassissimi quando l’infezione diventa cronica”.

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Dubey et al.,(1999) nello studio sui cavalli da macello dell’America del nord afferma che elevati titoli anticorpali nel cavallo persistono per poco più di un anno.

Quindi effettuare una comparazione per la toxoplasmosi nel cavallo tra i diversi studi è difficile così come lo é interpretare i risultati sierologici perché: sono utilizzati diversi test di cui non è nota sensibilità , specificità e cut-off, non è stato scelto il test di preferenza( gold standard) in questa specie, i risultati dei test variano anche in base all’antigene utilizzato e dalla quantità di immunoglobuline presenti nel siero.